專利名稱：一種羊生長激素釋放激素基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工合成基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用，特別是一種人工合成的羊生長激素釋放激素基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用。
一、GHRH研究的興起1973年Buger從肢端肥大癥病人的胰腺腫瘤提取到對(duì)GH分泌有刺激作用的提取物。1980年Frohman從肢端肥大癥病人的垂體外腫瘤分離到部分純化的GHRH。Thorner對(duì)伴有Turner’s癥的肢端肥大癥病人進(jìn)行垂體摘除，未見效，后查出胰腺有腫瘤，并摘除之，則血中GH水平由70ng/ml降至2ng/ml。Guillemin和Vale分別對(duì)腫瘤組織體外培養(yǎng)和分析獲得，具有促進(jìn)GH釋放作用的是兩個(gè)不同的肽，兩種均有活性，它們分別由44個(gè)和40個(gè)氨基酸殘基組成。44肽的結(jié)構(gòu)為酪-丙-天冬-丙-異亮-苯丙-蘇-天冬酰胺-絲-酪-精-賴-纈-亮-甘-谷氨-亮-絲-丙-精-賴-亮-亮-谷氨-天冬-異亮-甲硫-絲-精-谷氨-谷氨-甘-谷-絲-天冬酰胺-谷氨-谷-精-甘-丙-精-丙-精-亮-NH2。這種物質(zhì)被稱之為人胰腺生長激素釋放因子(hpGHRH)。
Vale還報(bào)道了兩種分別由40個(gè)和37個(gè)氨基酸殘基組成的肽。這兩種肽的體外研究均證明有生物活性，而以GHRH40活性最高。Guillemin認(rèn)為GHRH37和GHRH40為GHRH44的降解物。目前已經(jīng)確認(rèn)人下丘腦GHRH為44肽。
有人從幾千個(gè)人的下丘腦中分離GHRH活性物質(zhì)。1984年Guillemin證明來自下丘腦的GHRH與來自胰腺瘤的相同。大鼠的GHRH有15個(gè)氨基酸與人的不相同。大鼠的GHRH為43肽，有一游離的C末端。牛和豬下丘腦的GHRH均為44肽，羧端已酰胺化。就目前資料來看GHRH有種屬差異。
二、GHRH在體內(nèi)的分布GHRH在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布免疫組織化學(xué)證實(shí)GHRH的胞體位于弓狀核，對(duì)人、猴、豬和大鼠的研究表明，在弓狀核中GHRH胞體很密集。電生理研究證實(shí)電刺激腹內(nèi)側(cè)核可引起GH分泌。此外，在貓的海馬、杏仁、殼核，大鼠的內(nèi)側(cè)前腦束、背內(nèi)側(cè)核及室周核和穹隆附近也有GHRH胞體分布。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GHRH有廣泛的分布，尤以下丘腦濃度最高。人和貓GHRH神經(jīng)末捎對(duì)稱分布在正中隆起外側(cè)，平行于毛細(xì)血管，終止于垂體門脈血管。大鼠的GHRH纖維主要分布于正中隆起中央。
GHRH在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的分布在猴發(fā)現(xiàn)GHRH分布在垂體前葉細(xì)胞，在人的胎盤、胰腺也存有GHRH活性樣物質(zhì)，用RIA測得人的空腸、十二指腸和胃的提取物中有GHRH。
三、GHRH的生理作用及機(jī)理GHRH和生長激素抑制素也稱生長抑素(Somatostatin，SS)對(duì)GH的分泌起雙重調(diào)節(jié)作用。正常情況下，GH每天以一定時(shí)間間隔脈沖式釋放。鎮(zhèn)發(fā)周期約為1～3h。給清醒的大鼠注射GHRH，在GH釋放的谷期刺激作用極小，而在峰期則非常明顯。但將大鼠用SS抗血清處理后，GHRH在GH釋放谷期也能刺激GH的釋放。因此說明SS對(duì)GH的釋放起關(guān)鍵性作用。V.Padmanabhan等(1987)亦得到相同結(jié)果，用牛的腺垂體進(jìn)行體外培養(yǎng)，當(dāng)介質(zhì)中加入10∶2～10∶7的GHRH時(shí)，GH的分泌呈線性增加，尤以10∶7時(shí)達(dá)到最高峰，但當(dāng)介質(zhì)中再加入SS時(shí)則腺垂體GH的釋放效應(yīng)受到SS的負(fù)相抑制。GHRH對(duì)GH的釋出脈沖是必要的。體外研究表明，GHRH對(duì)GH的釋放有刺激作用。
雄鼠側(cè)腦室注入微量的人GHRH 2～20ng導(dǎo)致GH分泌的降低和抑制自發(fā)性脈沖釋放，但在側(cè)腦室注入較高量GHRH 0.2～2ug時(shí)于15～20分鐘內(nèi)血漿中出現(xiàn)GH分泌高峰。有人認(rèn)為下丘腦內(nèi)GHRH對(duì)內(nèi)源GHRH和SS分泌有直接作用。Katakani報(bào)道，靜注SS抗血清可阻斷側(cè)腦室注入GHRH對(duì)GH分泌的抑制作用，提示中樞GHRH通過刺激SS的釋放而抑制GH的分泌。目前認(rèn)為SS參與GHRH自身的超短反饋。
GHRH經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)到達(dá)腺垂體，并與嗜酸性細(xì)胞結(jié)合，通過膜內(nèi)cAMP引起生物效應(yīng)?？赡苁荊HRH與膜結(jié)合后成為激素-受體復(fù)合物，先激活一種刺激性G蛋白(Stimulatory G protein，Gs)。G蛋白的激活需要GTP參與，當(dāng)GTP變?yōu)镚DP時(shí)則G蛋白失活。Gs激活膜上AC的催化亞基，使ATP轉(zhuǎn)化為cAMP。通過該過程促進(jìn)GH的合成與釋放。
近年來人們嘗試通過多種方式提高動(dòng)物體內(nèi)GHRH水平，進(jìn)而促進(jìn)垂體GH的合成與分泌，從而實(shí)現(xiàn)提高動(dòng)物的生長速度和胴體瘦肉率。研究表明，注射GHRH可以顯著提高動(dòng)物的生長速度和瘦肉率。但是GHRH的半衰期很短，在體內(nèi)只有十幾分鐘，因此，在實(shí)際的應(yīng)用中，注射GHRH給生產(chǎn)帶來了諸多不便。因此，通過一些促合成能力提高動(dòng)物自身GHRH是大勢(shì)所趨。有的添加生長添加劑來增加動(dòng)物下丘腦中GHRH的合成；有的則是通過真核表達(dá)載體的應(yīng)用增加體內(nèi)GHRH的水平。
由于GHRH可以促進(jìn)肌肉的生長，這就隱含著GHRH的另一個(gè)非常重要的潛能——肌肉萎縮癥的治療。
肌肉萎縮是指橫紋肌營養(yǎng)不良，肌肉體積較正常體積小，肌纖維變細(xì)甚至消失。神經(jīng)肌肉病變性肥大。肌肉營養(yǎng)狀況除肌肉組織本身的病理變化外，更與神經(jīng)系統(tǒng)有密切關(guān)系。脊髓疾病常導(dǎo)致肌肉營養(yǎng)不良而發(fā)生肌肉萎縮，它們是神經(jīng)、肌肉疾病的一種常見癥狀。
肌肉疾病的研究目前已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)中最活躍的領(lǐng)域之一，這是因?yàn)榉肿由飳W(xué)、免疫學(xué)和生物化學(xué)的進(jìn)展使得對(duì)肌肉疾病的分子缺陷、發(fā)病機(jī)制有了進(jìn)一步的研究。
從解剖方面來說，肌肉組織不屬于神經(jīng)系統(tǒng)，可是肌肉是機(jī)體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)下，適應(yīng)和改造客觀世界不可缺少的效應(yīng)器官之一。而且，每一肌肉的收縮，又直接通過運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的支配而進(jìn)行，因此，肌肉疾病是肌肉本身和神經(jīng)肌肉接頭(突觸)處，由于遺傳因素、內(nèi)分泌代謝、炎癥，中毒、病毒感染、免疫及微量元素等原因所致的一組疾病。
肌肉本身的疾病，系由肌纖維化學(xué)成分改變、代謝障礙或不明原因等引起的肌纖維變性、萎縮。近幾年來，有人認(rèn)為肌肉本身的病變亦可能起源于神經(jīng)源性，引起肌肉生化代謝的改變，或由于遺傳基因的突變引起某些相應(yīng)酶系統(tǒng)的合成障礙，繼發(fā)于這些特殊酶系統(tǒng)的紊亂發(fā)生肌肉的變性、萎縮、無力，少數(shù)病人伴有肥胖。這類病人在疾病的進(jìn)展期常有肌肉代謝的酶系統(tǒng)異常，特別是糖代謝異常。近幾年也有文獻(xiàn)報(bào)道，肌病的發(fā)病機(jī)制與免疫因素有關(guān)，常見的肌肉疾病，如重癥肌無力，肌力綜合癥，突發(fā)性肌肉、皮膚炎等的發(fā)病均與免疫能力相關(guān)。
無論何種原因引起的肌病，基臨床表現(xiàn)不外乎肌無力或肌強(qiáng)直，肌肉萎縮，假性肥大，肌肉疼痛等。但在某些神經(jīng)源性疾病中，亦可出現(xiàn)上述共同的相似癥狀。治療該類病癥的一個(gè)重要手段是恢復(fù)肌肉的生長，因此GHRH被視為一種候選的基因治療手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種羊生長激素釋放激素基因及其編碼的羊生長激素釋放激素，該基因在動(dòng)物能得到較好表達(dá)，表現(xiàn)為動(dòng)物生產(chǎn)性狀的顯著提高。
本發(fā)明的羊生長激素釋放激素基因的核苷酸序列為序列表中的1號(hào)序列，由135個(gè)核苷酸組成，它編碼的是序列2的蛋白質(zhì)，由44個(gè)氨基酸殘基組成。
本發(fā)明的目的之二是提供一種替換GHRH自身的引導(dǎo)肽。從而可以確保引導(dǎo)該蛋白分泌到細(xì)胞外，進(jìn)入體液循環(huán)。
肌肉的膜蛋白引導(dǎo)肽核苷酸序列是序列表中的3號(hào)序列，由63個(gè)核苷酸組成。它編碼的是序列4的蛋白質(zhì)，由21個(gè)氨基酸殘基組成。
在本發(fā)明中，序列1與序列3的DNA是連鎖的，序列2與序列4的蛋白質(zhì)也是連鎖的。
為了促進(jìn)本發(fā)明羊生長激素釋放激素基因的核苷酸序列在肌肉內(nèi)的表達(dá)，在本發(fā)明羊生長激素釋放激素基因的兩側(cè)加有驅(qū)動(dòng)調(diào)節(jié)的調(diào)控元件5’及3’側(cè)翼核苷酸序列。
5’側(cè)翼核苷酸序列是序列表中的5號(hào)序列，由2445個(gè)核苷酸組成，稱為5’-flanking。
3’側(cè)翼核苷酸序列是序列表中的6號(hào)序列，由805個(gè)核苷酸組成，稱為3’-flanking。
含有序列1、序列3、序列5、序列6的質(zhì)粒及生物細(xì)胞均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的目的之三是提供一種促進(jìn)生長激素分泌的藥物，該藥物的活性成分是序列1的羊生長激素釋放激素核苷酸或序列2的羊生長激素釋放激素。
本發(fā)明的目的之四是提供一種治療肌肉疾病的藥物，該藥物的活性成分是序列1的羊生長激素釋放激素核苷酸或序列2的羊生長激素釋放激素。
為了提高藥物的效用，在上述藥物中，還包括藥學(xué)上可接受的載體，其中優(yōu)選的是脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體技術(shù)是被喻為“生物導(dǎo)彈”的第四代靶向給藥技術(shù)，脂質(zhì)體屬于納米級(jí)藥物載體，該技術(shù)利用脂質(zhì)體的獨(dú)有特性，將毒副作用大、在血液中穩(wěn)定性差、降解快的藥物包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，由于病灶部位血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大，脂質(zhì)體藥物可透過此間隙到達(dá)病灶部位，在病灶部堆積釋放，達(dá)到定向給藥。
脂質(zhì)體是由磷脂、膽固醇等為膜材包合而成。這兩種成分不但是形成脂質(zhì)體雙分子層的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且本身也具有極為重要的生理功能。按結(jié)構(gòu)和粒徑，脂質(zhì)體可分為單室脂質(zhì)體、多室脂質(zhì)體、含有表面活性劑的脂質(zhì)體。按性能，脂質(zhì)體可分為一般脂質(zhì)體(包括上述單室脂質(zhì)體、多室脂質(zhì)體和多相脂質(zhì)體等)、特殊性能脂質(zhì)體、熱敏脂質(zhì)體、pH敏感脂質(zhì)體、超聲波敏感脂質(zhì)體、光敏脂質(zhì)體和磁性脂質(zhì)體等。按荷電性，脂質(zhì)體可分為中性脂質(zhì)體、負(fù)電性脂質(zhì)體、正電性脂質(zhì)體。
1987年Felgner等首次用人工合成的陽離子脂質(zhì)體N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N1N1N-氧化三甲銨(DOTMA)構(gòu)建小單層脂質(zhì)體，與DNA自發(fā)作用形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，促進(jìn)了DNA的細(xì)胞攝入及胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。后來的研究又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有中性磷脂參與構(gòu)成的陽離子脂質(zhì)體活性更強(qiáng)。Lip即是由陽離子脂質(zhì)(DOTMA)和中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)合成的脂質(zhì)體。適用于將各種核酸導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)。其機(jī)理是陽離子脂質(zhì)體通過靜電引力作用與帶負(fù)電荷的核酸自發(fā)形成復(fù)合物，凈電荷為正的復(fù)合物又很容易結(jié)合到帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面，與細(xì)胞融合，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入胞內(nèi)。因此它與傳統(tǒng)脂質(zhì)體不同，并非將核酸包入脂質(zhì)體囊內(nèi)，而是結(jié)合到表面，只需混合即可俘獲幾乎100％的核酸，而傳統(tǒng)脂質(zhì)體的核酸包裹率不到10％。與硫酸鈣共沉淀法或二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖方法相比，應(yīng)用Lip的核酸轉(zhuǎn)染效率要高出5～100倍。因此陽離子脂質(zhì)體應(yīng)用方便，優(yōu)勢(shì)明顯，近幾年被廣泛用于將DNA，RNA和蛋白質(zhì)導(dǎo)入活細(xì)胞。但關(guān)于應(yīng)用此類脂質(zhì)體介導(dǎo)相對(duì)小分子的反義寡聚脫氧核糖核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染活細(xì)胞的報(bào)道罕見。1989年Stoolman研究發(fā)現(xiàn)，DOTMA可使細(xì)胞攝入ASODN的量增加10倍以上，而且因?yàn)轱@著改變了其在細(xì)胞內(nèi)的情況使ASODN的生物活性增強(qiáng)了100倍。1991年Chiang等首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中證實(shí)陽離子脂質(zhì)體可使ASODN的作用明顯增強(qiáng)。1994年Nestle等將Lip與靶向細(xì)胞間粘合分子1(ICAM-1)mRNA的ASODN混合后作用于角細(xì)胞，使ICAM-1的表達(dá)減少50％，而無Lip介導(dǎo)時(shí)僅減少30％。本發(fā)明發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明人DNA-polαmRNA特異的ASODN在Lip介導(dǎo)下抑制人肝癌細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)了10倍。因此各類脂質(zhì)體特別是Lip可以做為簡單有效的運(yùn)載工具，介導(dǎo)GHRH進(jìn)入體外培養(yǎng)或體內(nèi)細(xì)胞，解決細(xì)胞攝入困難的問題，從而大大提高GHRH的作用效果，減少注射量，降低成本。
另外，為促進(jìn)肌肉細(xì)胞攝入GHRH的效率，在注射時(shí)給予注射部位適當(dāng)?shù)碾娒}沖刺激也將提高GHRH的使用效率。
本發(fā)明依據(jù)GHRH在生理上可以促進(jìn)動(dòng)物生長的調(diào)節(jié)作用，通過設(shè)計(jì)人工的基因序列，實(shí)現(xiàn)由動(dòng)物體自身的肌肉細(xì)胞生產(chǎn)GHRH，并釋放到體液循環(huán)中，參與動(dòng)物生產(chǎn)性狀的調(diào)整。設(shè)計(jì)時(shí)考慮了以下幾個(gè)因素1、確保GHRH基因可以在肌肉細(xì)胞中表達(dá)，要選用肌肉中豐度高的蛋白表達(dá)元件來驅(qū)動(dòng)GHRH基因的表達(dá)。2、為確保在肌肉細(xì)胞中表達(dá)的GHRH可以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入體液循環(huán)，選擇了合適的引導(dǎo)肽。引導(dǎo)GHRH分泌出膜的是肌肉M-Cadherin(muscle calcium-dependent intercellularadhesion)引導(dǎo)肽，M-Cadherin是鈣依賴的細(xì)胞間粘素。羊生長激素釋放激素基因協(xié)同引導(dǎo)肽基因一起人工合成是較理想的方案。肌肉細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白及穿膜蛋白的引導(dǎo)肽均可被用來使用。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例做進(jìn)一步說明。
圖2為本發(fā)明的表達(dá)克隆的構(gòu)建示意圖。
圖3為含有5’側(cè)翼核苷酸序列(2442bp)的質(zhì)粒pGEM-A5F及3’側(cè)翼核苷酸序列(805bp)的質(zhì)粒pGEM-A3F的分別鑒定。
圖4為3’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A3F與5’側(cè)翼核苷酸序列質(zhì)粒pGEM-A5F經(jīng)過Nde I+Nsi I雙切后的結(jié)果。
圖5為表達(dá)載體pGEM-A5F3F構(gòu)建。
圖6為表達(dá)載體質(zhì)粒pGEM-A5F3F的鑒定。
圖7為人工合成的含有引導(dǎo)肽的GHRH序列的拼接鑒定。
圖8-A為表達(dá)質(zhì)粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的構(gòu)建及鑒定。
圖8-B為表達(dá)質(zhì)粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的構(gòu)建及鑒定。
表達(dá)載體與目的基因的連接A、將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEM-A5f3f用Sna B1進(jìn)行酶切，而后補(bǔ)平。進(jìn)而利用SalI對(duì)其進(jìn)行酶切。
B、利用Sal I對(duì)合成的GHRH片段酶切。
C、連接A、B酶切的結(jié)果，形成表達(dá)克隆。
2、試劑及其它材料克隆載體pGEM-T vector、連接酶、瓊脂糖和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶購自Biolab公司及Promega公司，DNA回收試劑盒為上海生工SK 131產(chǎn)品。
質(zhì)粒提取的溶液I、II、III和pH8.0的TE、STE、Tris、EDTA緩沖液等各種緩沖液都是按照科學(xué)出版社出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)中的配方配制。
3、途徑和方法質(zhì)粒的堿裂解法制備是利用質(zhì)粒DNA在通過堿環(huán)境后比基因組DNA更易復(fù)性，并可同時(shí)去除大量蛋白的原理進(jìn)行的。經(jīng)過變性與復(fù)性后，質(zhì)粒可通過乙醇或異丙醇沉淀下來。
(1)質(zhì)粒DNA的大量制備及純化(堿裂解法)將一單菌落接入含Amp的200mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃遙床培養(yǎng)過夜。
↓將細(xì)菌培養(yǎng)液移入50ml的離心管，于4℃ 8000rpm離心5分鐘回收細(xì)菌。
↓倒掉上清，將細(xì)菌沉淀重懸于10ml冰預(yù)冷的STE中，充分振蕩洗滌。
↓4℃，8000rpm離心5分鐘重新回收細(xì)菌。
↓加入1ml冰預(yù)冷的溶液I，劇烈振蕩。
↓加入2ml新配制的溶液II，緩緩地顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，于室溫放置6分鐘。
↓加入1.5ml冰預(yù)冷的溶液III，用混合液緩緩自下而上浸潤離心管全部管壁，盡量避免菌體散落在管壁上，冰上放置10分鐘，管內(nèi)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
↓4℃度12000rpm離心15分鐘。
↓用4層濾紙將上清過濾到另一50ml的離心管中，加0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。
↓室溫，12000rpm離心15分鐘，沉淀核酸。
↓
吸棄上清，于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁數(shù)分鐘。倒出乙醇，用真空裝置吸取管壁及管底液體。
↓用350ul滅菌雙蒸水溶解核酸沉淀。
↓將DNA溶液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，再加入等體積的5Mol/L氯化鋰溶液，充分混勻，于室溫以12000rpm離心10分鐘。
↓將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5ml離心管中，加等量的異丙醇，充分混勻，于室溫以12000rpm離心10分鐘，以回收核酸沉淀。
↓吸棄上清，于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁數(shù)分鐘，倒出乙醇，用真空裝置吸去管壁及底部液體。
↓用100ul滅菌雙蒸水溶解沉淀，加入10ul 10mg/ml無DNase的Rnase，于37℃放置1小時(shí)。
↓補(bǔ)加400ul滅菌雙蒸水，用等體積的酚，酚∶氯仿，氯仿各抽提一遍。
↓將水相轉(zhuǎn)移到另一離心管，加入1/4體積的NaAc(3M，pH5.2)，充分混勻，加入2倍體積的乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12000rpm離心15分鐘，回收質(zhì)粒DNA。
↓吸棄上清，加入1ml 70％的乙醇，洗滌沉淀5分鐘。
↓用真空裝置吸干沉淀，并溶于50ul滅菌雙蒸水。
↓取1ul上樣電泳，檢查提取效果。
(2)質(zhì)粒的純化大規(guī)模的純化主要依賴柱層析法，依靠柱床在不同條件下對(duì)質(zhì)粒的親合度差異，使質(zhì)粒與其他雜質(zhì)分離。
(3)質(zhì)粒DNA濃度及純度的檢測好。此時(shí)的值可反映出樣本的濃度，與濃度之間的關(guān)系是1 OD260＝50ug/ml。實(shí)際應(yīng)用中，OD260/OD280的比值不一定必須為1.8，但是越接近表示純度越好。
實(shí)施例1、表達(dá)克隆的構(gòu)建一、表達(dá)克隆的構(gòu)建元件1、5’側(cè)翼核苷酸序列5’側(cè)翼核苷酸序列是由牛骨骼肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子改造而來引物設(shè)計(jì)如下up CTGGGGAGGAGGGTTTCGTATGTLENGTH 23nt ΔG＝-3.6kcal/mol (G+C)％＝56.5％ Tm＝72Low Sna BILENGTH 28ntΔG＝-6.9kcal/mol(G+C)％＝50.0％Tm＝72以下為通過以上引物PCR獲得的5’側(cè)翼核苷酸序列與報(bào)道的牛骨骼肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列(GENEBANK序列號(hào)為U02285)對(duì)比，同源性為99％。
Upper line通過以上引物PCR獲得的5’側(cè)翼核苷酸序列from 1 to 2445Lower line報(bào)道的牛骨骼肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子from 1 to 24411CTGGGGAGGAGGGTTTCGTATGTGCTTTTATATCCCTCTTCGAGGACCCGCACCTGTCCC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1CTGGGGAGGAGGGTTTCGTATGTGCTTTTATATCCCTCTTCGAGGACCC TCCC61 AGTTGCTGAGTTCCACCACCGAGTTCCTATTCTGGGAACACTTGAGCACATCAGAAAAAT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||61 AGTTGCTGAGTTCCACCACCGAGTTCCTATTCTGGGAACACTTGAGCACATCAGAAAAAT121 GAGTGGTTCCATTCTGGCTCACATCACATCACTGATGCACCCCTTAAAGCATGTCCCTGA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||121GAGTGGTTCCATTCTGGCTCACATCACATCACTGATGCACCCCTTAAAGCATGTCCCTGA181GTTCATTGCAGAAAATTGTTCCTCCTTGTACCTTCCACAGCAAGGTTAGAACTGTTCCCC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||181GTTCATTGCAGAAAATTGTTCCTCCTTGTACCTTCCACAGCAAGGTTAGAACTGTTCCCC241TCAGGGGAAAAAACAGTGAGAAGCACCAACTTAATAACCTCCTCTGACCCCTACTCCACC|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||241TCAGGGGAAAAAACAGTGAGAAGCACCAACTTAATAACCTCCTTTGACCCCTACTCCACC301TTTACCATAAGTAGATCCAAATCCTTCTAGAAAATCAGAAAGACATATCCCCGTGTATCA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| |||||||301TTTACCATAAGTAGATCCAAATCCTTCTAGAAAATCAGAAAGACAGATCCCCATGTATCA361GCGGTATAAATAGAACCGCTCTGCAGACTCTGGTGGACGGTGACTCTCCAAGGTGGATTG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||361GCGGTATAAATAGAACCGCTCTGCAGACTCTGGTGGACGGTGACTCTCCAAGGTGGATTG421 GCCGGCCTTGGCTGGGCATCACCCTCTAAATATAACGATGAGTTTGTTCAGCC||| ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||421GGAAT GCCTTGGCTGGGCATCACCCTCTAAATATAACGATGAGTTTGTTCAGCC481TTTGCAGAAGGGAAAGGTTTTGCCCATCCTAGAGCGCGATGCCCTTGTCCTCCTTACAGG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||481TTTGCAGAAGGGAAAGGTTTTGCCCATCCTAGAGCGCGATGCCCTTGTCCTCCTTACAGG541GAGGAGAGACGGTTGAGGCTTCATCTAGTAAGAGCACTTCTCAGTTCCCATCCTAGGGAT||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| ||||||| |541GAGGAGAGACGGTTGAGGCTTCATCTAGTAAGAGCACCTCTCAGTTCCCACCCTAGGGCT601ATGACACTTGCCTTTCCTCCCCAGGACTGGGAAGTCGGTGAGCCCCGCCAAGGATGCGGG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||601 ATGACACTTGCCTTTCCTCCCCAGGACTGGGAAGTCGGTGAGCCCCGCCAAGGATGCGGG661 AGTAGGGTGCTCAGCTCGGCCTGCCATACTCCAGAGCCGGCCAGTTAGTCACTCAACTTC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||661 AGTAGGGTGCTCAGCTCGGCCTGCCATACTCCAGAGCCGGCCAGTTAGTCACTCAACTTC721 ACTCCCTTCATGAGCTCCCGAGCCCACAACACGTCCCCGAGACGGGCAGCTCTGGGTGTC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||721 ACTCCCTTCATGAGCTCCCGAGCCCACAACACGTCCCCGAGACGGGCAGCTCTGGGTGTC781 CTGGCTCAGTGCCAGAGGCTGCGAGAGCCGCTGCGGGGCCTGTGCCGGGAGCCCAGCGCC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||781 CTGGCTCAGTGCCAGAGGCTGCGAGAGCCGCTGCGGGGCCTGTGCCGGGAGCCCAGCGCC841 TCCTCCCCGGACTCTCCACAGTTGTCCTCGCGACAGGTGCGCGCCCGCCGGCCTCCGGTG|||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| ||||||841 TCCTCCCCGGACTCTCCACAGTTGTCCTCGCGA CGCGCCCGCCGGCCGCCGGTG901 ACCCTCTCCGGTGGGGGTGGGGGCCGACGGTGTCAGCCCTCTGGATTGGGGAGCTCGGGG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||901 ACCCTCTCCGGTGGGGGTGGGGGCCGACGGTGTCAGCCCTCTGGATTGGGGAGCTCGGGG961 TTGGGGGAGAGACCGAGTTCGCTGGGAGTCTGGGGGGAGGGATCGCCTGCCTCCCTGCCC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||961 TTGGGGGAGAGACCGAGTTCGCTGGGAGTCTGGGGGGAGGGATCGCCTGCCTCCCTGCCC1021GGGACTCCGGGAGTGACTCCATCTCCGGTCCTCTTGGCCCCACCACTAGGATATAGAGTC|||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||1021GGGACTCCGGGAGTGACTCCATCTCCGGTCCTCTTGTCCCCACCACTAGGATATAGAGTC1081 CTCCTCGGTGGAGTCACACTTAAGGAGTTGGAGGTGGGGGGTAAGGG ACCCGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| ||||||||1081 CTCCTCGGTGGAGTCACACTTAAGGAGTTGGAGGTGGGGGGTAGGGGTGA CGAA1141 GAAGAGGTGAAATGTGGGCGCACCTTCCCGAGGCTCGGAGAACACCGAATGGCCGGGGGC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1141 GAAGAGGTGAAATGTGGGCGCACCTTCCCGAGGCTCGGAGAACACCGAATGGCCGGGGGC1201 GGGGCGGCTGCGGACAGGTGCAGCCCGGGCGCAGGCTCACTGGCGCACCCCGAACACTCG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1201 GGGGCGGCTGCGGACAGGTGCAGCCCGGGCGCAGGCTCACTGGCGCACCCCGAACACTCG1261 GTGACCCTCGCCGCACCCCAGCCCCTCCGCCAGGCAACCGGGCGGGGTCGGGAGGGGCCG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1261 GTGACCCTCGCCGCACCCCAGCCCCTCCGCCAGGCAACCGGGCGGGGTCGGGAGGGGCCG1321 ACCAGCGGGCAGACACTCCATATACGGCCCGGCCCGTGTTACCTGGGCTCAGGCCAGGCC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1321 ACCAGCGGGCAGACACTCCATATACGGCCCGGCCCGTGTTACCTGGGCTCAGGCCAGGCC1381 TCTCCTTCTTTGGTCAGCGCAGGGGACCCGGGCGGGGACCCAGGCCTTGAACTGGTCGGG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1381 TCTCCTTCTTTGGTCAGCGCAGGGGACCCGGGCGGGGACCCAGGCCTTGAACTGGTCGGG1441 GGAGGGGGCTCTAGTGCCCAACACCCAAATATGGCTCGAGAAGGGGAGCG TGC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1441 GGAGGGGGCTCTAGTGCCCAACACCCAAATATGGCTCGAGAAGGGGAGCGACA.TCCTGC1501 GGGGCGGCGCGAGGGGAGCGCCCGAGGGCTATATAAAACCTGAGCAGGGGGACGAGCGGC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1500 GGGGCGGCGCGAGGGGAGCGCCCGAGGGCTATATAAAACCTGAGCAGGGGGACGAGCGGC1561 CACCGCAGCGGATAGCGCCGAGAGAAGTCTCGCTTCCTTCCCACGGTGACCGGGACCGGA|||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1560 CACCGCAGCGGACAGCGCCGAGAGAAGTCTCGCTTCCTTCCCACGGTGACCGGGACCGGA1621 GCCGGAGAGCCGCAGGTGTAGCCACCCGCCCAGGTAGGCAGGGGCGGGGTGGGGACAGTA|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |1620 GCCGGAGAGCCGCAGGTGTAGCCACCCGCCCAGGTAGGCAGGGGCGGGGTGGGGACAGAA1681 GGACGTGTCCCACCGCGGCAGCCTGGAGAACTCCAGGTAGAGCGCGGCCCCTCACTGCAT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1680 GGACGTGTCCCACCGCGGCAGCCTGGAGAACTCCAGGTAGAGCGCGGCCCCTCACTGCAT1741 CAGCCCCAGCCCCGCGTCCTGTGAGCCGCGCCTCTGGCCCCAGAGTCACGTGTGCTTTAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1740 CAGCCCCAGCCCCGCGTCCTGTGAGCCGCGCCTCTGGCCCCAGAGTCACGTGTGCTTTAA1801 AGAAGAGACAGGAAGCCGGGTCCTTTGGAAAGATCTCCAAATTTATTCCCAGCCCTTTGG|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||1800 AGAAGAGACAGGAAGCCGGGTCCTTTGGAAAGATCTCCAAATTTATTCCCAG.CCTTTGG1861 GGCAGCTCTCCTTGACACTTCGTGCGTGCCGAGGTAGATGAAAGGTTTTGCTTTAGTCCT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||\\||||1859 GGCAGCTCTCCTTGACACTTCGTGCGTGCCGAGGTAGATGAAAGGTTTTGCTTTAGTCCT1921 CCCCAGGGCAGTTCCTTCCCAGCAGAACCAAAGGACAGTAGAAGGGACAATTTCCCCTGG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1919 CCCCAGGGCAGTTCCTTCCCAGCAGAACCAAAGGACAGTAGAAGGGACAATTTCCCCTGG1981 CTCGCCATCAGTTACAAGGGCGCTTCGGCTGAGTCTGAAGTGCCATGGAGGTCCAAAATA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||1979 CTCGCCATCAGTTACAAGGGCGCTTCGGCTGAGTCTGAAGTGCCATGGAGGTCCAAAATA2041 AGCCATTCGTGTCCTGGTGCAGTGCCCAAGCCCTTTCCACGGCGTCTCCTTCCACCCTCA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||2039 AGCCATTCGTGTCCTGGTGCAGTGCCCAAGCCCTTTCCACGGCGTCTCCTTCCACCCTCA2101 CAGTGGCCCAGAAATCAGGGTTCGCGGACCTTGACCCCCATGCGATGCCAGGGAGGGGCG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||2099 CAGTGGCCCAGAAATCAGGGTTCGCGGACCTTGACCCCCATGCGATGCCAGGGAGGGGCG2161 GAGAGGGCGGTGCCTGCAGCGAA.GCAGACAACTCTCGGGTCTGTGTGTCCTGAGTTCCC||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||2159 GAGAGGGCGGTGCCTGCAGCGAAGGCAGACAACTCTCGGGTCTGTGTGTCCTGAGTTCCC2220 AGATGGAGAAACGCTCTCTGTGGTCTCCTCGCAGTAGAGCTCGCAGCAGCGAAGCTCCGC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||2219 AGATGGAGAAACGCTCTCTGTGGTCTCCTCGCAGTAGAGCTCGCAGCAGCGAACGTCCGC2280 CCGCGCGGCTTTGATTGCTTCCCCCGCAGGATGGCGCCGGGCTGCGGGCTGGAGGCTGGA|||||| ||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||2279 CCGCGC.GCTTTGATTGCTTCCCCCGCA.GATGGCGCCGGGCTGCGGGCTGGAGGCTGGA2340 GGTGTCCATAGGTCCCCGGGGAGGGAGGGCGCTCCAGCCAGCGGGGCCTCTTGCGTGAAA|||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||2337 GGTGTCCATAGGTCCCCGGGGA.GGAGGGCGCTCCAGCCAGCGGGGCCTCTTGCCTGAAA2400 CACTGAGCGTCTCCATGGCATTCCTGTCCTTGCAGAAACCAGATAC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||2396 CACTGAGCGTCTCCATGGCATTCCTGTCCTTGCAGAAACCAGATAC表1蛋白結(jié)合位點(diǎn)對(duì)比結(jié)果




由上述序列及表格的比較可以看出，本發(fā)明所使用的通過PCR方法所獲得的5’側(cè)翼核苷酸序列的一些堿基突變導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的改變，其中在強(qiáng)啟動(dòng)區(qū)1491增加了一個(gè)GT-IIC結(jié)合位點(diǎn)。
2、3’側(cè)翼核苷酸序列3’側(cè)翼核苷酸序列由牛骨骼肌肌動(dòng)蛋白poly(A)加尾信號(hào)改造而成up

Nde ILENGTH 28ntΔG＝-10.3kcal/mol (G+C)％＝60.7％Tm＝70Low

Nsi ILENGTH 28ntΔG＝-9.9kcal/mol (G+C)％＝60.7％Tm＝663、包括引導(dǎo)肽的GHRH成熟肽編碼基因(山羊、綿羊)人工合成序列1及序列3的連鎖核苷酸序列，序列3位于序列1的5’端。
二、表達(dá)克隆的構(gòu)建1、載體(pGEM-A5f3f)的構(gòu)建如

圖1所示將PCR擴(kuò)增的5’側(cè)翼核苷酸序列插入到T-vector的多克隆位點(diǎn)之間，記為pGEM-A5F。將pGEM-A5F及3’側(cè)翼核苷酸序列PCR產(chǎn)物均用Nde I及Nsi I酶切，連接構(gòu)成真核表達(dá)載體pGEM-A5F3F。
如圖3所示，為含有5’側(cè)翼核苷酸序列(2442bp)的質(zhì)粒pGEM-A5F及3’側(cè)翼核苷酸序列(805bp)的質(zhì)粒pGEM-A3F的分別鑒定，其中，1、為3’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A3F的Apa I+Sac I雙切結(jié)果，切下的小帶為800bp及一條3kb的載體帶；2、為3’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A3F的Nde I+Nsi I雙切結(jié)果，切下的小帶為800bp及一條3kb的載體帶；3、為3’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A3F的NsiI單切結(jié)果，切下的小帶為800bp及一條3kb的載體帶；4、為3’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A3F的Nde I單切結(jié)果，將質(zhì)粒切為線形，大小為3.8kb，無切下的小帶；5、為5’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A5F的Nde I+Nsi I雙切結(jié)果將質(zhì)粒切為線形，大小為5.5kb；6、為5’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A5F的Nsi I單切結(jié)果將質(zhì)粒切為線形，大小為5.5kb；7、為5’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A5F的Nde I單切結(jié)果將質(zhì)粒切為線形，大小為5.5kb；8、為5’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A5F的Sph I+SnaB I雙切結(jié)果將質(zhì)粒切為兩條帶，大小為2.5kb與3.0kb；9為1kb Marker；10、為3’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A3F；11、為5’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A5F；12、為空的質(zhì)粒，大小為3.0kb；13、為空質(zhì)粒單切，大小為3.0kb(作為對(duì)照)。
如圖4所示，為3’側(cè)翼核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-A3F與5’側(cè)翼核苷酸序列質(zhì)粒pGEM-A5F經(jīng)過Nde I+Nsi I雙切后回收的結(jié)果，其中1、為含有3’-flanking的質(zhì)粒pGEM-A3F經(jīng)過Nde I+Nsi I雙切后大小為800bp的帶的回收電泳；2、為含有5’-flanking的質(zhì)粒pGEM-A5F經(jīng)過Nde I+Nsi I雙切后的結(jié)果，大小為5.5bp；m、為1kbMarker。
如圖5所示，為表達(dá)載體pGEM-A5F3F構(gòu)建，其中，1、為插入5’-flanking(2.5kb)及3’-flanking(800bp)的表達(dá)載體質(zhì)粒pGEM-A5F3F(6.3kb)；2、為只插入5’-flanking(2.5kb)的質(zhì)粒pGEM-A5F(5.5kb)(作為對(duì)照)。
如圖6所示，為表達(dá)載體質(zhì)粒pGEM-A5F3F的鑒定，其中，1、1kb Marker；2、為Nde I單切質(zhì)粒pGEM-A5F3F，大小為6.3kb；3、為SnaB I單切質(zhì)粒pGEM-A5F3F，大小為6.3kb；4、為Nde I+SnaB I雙切質(zhì)粒pGEM-A5F3F的結(jié)果，切下的帶的大小為2.5kb+3.8kb；5、為Nde I+Nsi I雙切質(zhì)粒pGEM-A5F3F的結(jié)果，切下的帶的大小為800bp+5.5kb；6、質(zhì)粒pGEM-A5F3F，大小為6.3kb；7、1kb Marker；8、質(zhì)粒pGEM-A5F，大小為5.5kb。
利用該載體提供的三個(gè)酶切位點(diǎn)Spe I、Not I、Sal I作為外源片段的插入位點(diǎn)。
為保證外源片段的表達(dá)及5-UTR完整，在ATG前需要加一堿基“C”(actine的5-UTR結(jié)尾)。
2、GHRH基因片段合成片段是人工合成的，全長198bp。為便于連接，5’端設(shè)計(jì)為平端，3’端設(shè)計(jì)為帶有Sal I的粘端。
其具體操作中鑒于合成片段的局限，采用分步合成。
全序列CATGGGTTCTGCTCTGCTCCTCGCCCTCGGGCTGCTTGCCCAGAGCCTTGGCCTGTCCTGGGCATACGCTGATGCTATCTTCACCAACTCCTA AAAATCCTGGGCCAGCTGTCCGCTCGGAAGCTGCTGCAGGATATCATGAACCGGCAGCAGGGCGAGCGGAACCAGGAGCAGGGCGCCAAGGTGCGGCTGTAG利用片段內(nèi)中部的一個(gè)特異序列-ccgg-構(gòu)建酶切位點(diǎn)，進(jìn)而連接合成片段。合成第一條鏈GHRH的5’端為頓端，與載體的5-flanking的3’端Sna BI切點(diǎn)補(bǔ)平后連接。CATGGGTTCTGCTCTGCTCCTCGCCCTCGGGCTGCTTGCCCAGAGCCTTGGCCTGTCCTGGGCATACGCTGATGCTATCTTCACCAACTCCT ccg 為Age I位點(diǎn)補(bǔ)為雙連的引物5’ CATGGGTTCTGCTCTGCTCC 3’5’ GGACCGGTAGGAGTTGGTGA 3’合成第二條鏈tct AAATCCTGGGCCAGCTGTCCGCTCGGAAGCTGCTGCAGGATATCATGAACCGGCAGCAGGGCGAGCGGAACCAGGAGCAGGGCGCCAAGGTGCGGCTGTA ttt 為Acc III位點(diǎn) 為Sal I位點(diǎn)，用于插入載體。
補(bǔ)為雙連的引物5’TCTTCCGGAAAATCCTGGG 3’5’AAAGTCGACTAGAGCCGCA 3’
GHRH的3’端為Sal I\Not I\Spe I的粘端，與載體的3-flanking的5’端SalI\Not I\Spe I切點(diǎn)連接。
如圖7所示，為人工合成的含有引導(dǎo)肽的GHRH序列的拼接鑒定，其中，1、Hae IIIMarker；2、擴(kuò)增的片段II(FII)拼接M-cadherin引導(dǎo)肽及GHRH序列的，大小為118bp；3、擴(kuò)增的片段I(FI)拼接M-cadherin引導(dǎo)肽及GHRH序列，大小為105bp。
如圖8-A及8-B所示，均為表達(dá)質(zhì)粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的構(gòu)建及鑒定，其中，圖8-A中，1、1kb Marker；2、為SnaB I+Sal I雙切載體質(zhì)粒pGEM-A5F3F的結(jié)果，切下的帶的大小為6.3kb；3、為引導(dǎo)肽及GHRH序列的片段I與II拼接克隆(FI-II)經(jīng)由Nco I與Sal I雙切的結(jié)果，大小為198bp；4、為Hae III Marker；5、為引導(dǎo)肽及GHRH序列的片段I與II拼接克隆(F I-II)PCR的結(jié)果，大小為213bp。圖8-B中，1、拼接克隆(F I-II)PCR結(jié)果，大小為213bp；2、空白對(duì)照；3、陽性質(zhì)粒PCR結(jié)果為213bp；4、陰性質(zhì)粒對(duì)照；5、表達(dá)質(zhì)粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的PCR結(jié)果，213bp；6、載體質(zhì)粒質(zhì)粒pGEM-A5F3FPCR對(duì)照；7、Hae III Marker；8、1kb Marker；9、陰性質(zhì)粒pGEM-A5F(5.5kb)的Nco I+Nde I雙切對(duì)照；10、表達(dá)質(zhì)粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的Nco I+Nde I雙切結(jié)果為2.4kb\3.8kb\256bp\387bp；11、載體質(zhì)粒pGEM-A5F3F的Nco I+Nde I雙切結(jié)果為2.4kb\3.8kb\387bp。
3、GHRH基因表達(dá)克隆說明如圖2所示，A、將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEM-A5f3f用Sna BI進(jìn)行酶切，而后補(bǔ)平。進(jìn)而利用SalI對(duì)其進(jìn)行酶切。
B、利用Sal I對(duì)合成的GHRH基因片段酶切。
C、連接A、B酶切的結(jié)果，形成表達(dá)克隆。
實(shí)施例2、表達(dá)質(zhì)粒在活體內(nèi)促進(jìn)綿羊生長注射方式一次性臀部兩側(cè)肌肉注入本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒1.2-1.5mg/頭。注射后促生長效果如表2所示。
本實(shí)施例中具體操作方法參見科學(xué)出版社出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)中的相應(yīng)部分。實(shí)驗(yàn)中，公羊、母羊各為半數(shù)，采用隨機(jī)分組。飼養(yǎng)方式基本上為放牧，極少補(bǔ)充精料。
表2表達(dá)質(zhì)?；铙w肌肉注射促生長效果表


其中，實(shí)驗(yàn)前重主要是斷奶時(shí)體重，本發(fā)明注射液使用為羔羊斷奶前5天注射；總提高率指總生產(chǎn)效率的提高，綜合了日增重和產(chǎn)肉率的因素。
從表中的結(jié)果可以看出，本發(fā)明注射液對(duì)于不同種的羊在不同時(shí)期的體重增加均有顯著的促進(jìn)作用。
序列表<160>6<210>1<211>135<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1tacgctgatg ctatcttcac caactcctac cggaaaatcc tgggccagct gtccgctcgg 60aagctgctgc aggatatcat gaaccggcag cagggcgagc ggaaccagga gcagggcgcc 120aaggtgcggc tgtag 135<210>2<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Ile Leu Gly5 10 15Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Asn Arg Gln20 25 30Gln Gly Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala Lys Val Arg Leu35 40 44<210>3<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3atgggttctg ctctgctcct cgccctcggg ctgcttgccc agagccttgg cctgtcctgg 60gca63<210>4<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>4Met Gly Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Gln Ser5 10 15Leu Gly Leu Ser Trp Ala20 21<210>5<211>2445<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5ctggggagga gggtttcgta tgtgctttta tatccctctt cgaggacccg cacctgtccc 60agttgctgag ttccaccacc gagttcctat tctgggaaca cttgagcaca tcagaaaaat120gagtggttcc attctggctc acatcacatc actgatgcac cccttaaagc atgtccctga180gttcattgca gaaaattgtt cctccttgta ccttccacag caaggttaga actgttcccc240tcaggggaaa aaacagtgag aagcaccaac ttaataacct cctctgaccc ctactccacc300tttaccataa gtagatccaa atccttctag aaaatcagaa agacatatcc ccgtgtatca360gcggtataaa tagaaccgct ctgcagactc tggtggacgg tgactctcca aggtggattg420ggagtcagcc ggccttggct gggcatcacc ctctaaatat aacgatgagt ttgttcagcc480tttgcagaag ggaaaggttt tgcccatcct agagcgcgat gcccttgtcc tccttacagg540gaggagagac ggttgaggct tcatctagta agagcacttc tcagttccca tcctagggat600atgacacttg cctttcctcc ccaggactgg gaagtcggtg agccccgcca aggatgcggg660agtagggtgc tcagctcggc ctgccatact ccagagccgg ccagttagtc actcaacttc720actcccttca tgagctcccg agcccacaac acgtccccga gacgggcagc tctgggtgtc780ctggctcagt gccagaggct gcgagagccg ctgcggggcc tgtgccggga gcccagcgcc840tcctccccgg actctccaca gttgtcctcg cgacaggtgc gcgcccgccg gcctccggtg900accctctccg gtgggggtgg gggccgacgg tgtcagccct ctggattggg gagctcgggg960ttgggggaga gaccgagttc gctgggagtc tggggggagg gatcgcctgc ctccctgccc 1020gggactccgg gagtgactcc atctccggtc ctcttggccc caccactagg atatagagtc 1080ctcctcggtg gagtcacact taaggagttg gaggtggggg gtaagggtga acaacccgaa 1140gaagaggtga aatgtgggcg caccttcccg aggctcggag aacaccgaat ggccgggggc 1200ggggcggctg cggacaggtg cagcccgggc gcaggctcac tggcgcaccc cgaacactcg 1260gtgaccctcg ccgcacccca gcccctccgc caggcaaccg ggcggggtcg ggaggggccg 1320accagcgggc agacactcca tatacggccc ggcccgtgtt acctgggctc aggccaggcc 1380tctccttctt tggtcagcgc aggggacccg ggcggggacc caggccttga actggtcggg 1440ggagggggct ctagtgccca acacccaaat atggctcgag aaggggagcg acattcctgc 1500ggggcggcgc gaggggagcg cccgagggct atataaaacc tgagcagggg gacgagcggc 1560caccgcagcg gatagcgccg agagaagtct cgcttccttc ccacggtgac cgggaccgga 1620gccggagagc cgcaggtgta gccacccgcc caggtaggca ggggcggggt ggggacagta 1680ggacgtgtcc caccgcggca gcctggagaa ctccaggtag agcgcggccc ctcactgcat 1740cagccccagc cccgcgtcct gtgagccgcg cctctggccc cagagtcacg tgtgctttaa 1800agaagagaca ggaagccggg tcctttggaa agatctccaa atttattccc agccctttgg 1860ggcagctctc cttgacactt cgtgcgtgcc gaggtagatg aaaggttttg ctttagtcct 1920ccccagggca gttccttccc agcagaacca aaggacagta gaagggacaa tttcccctgg 1980ctcgccatca gttacaaggg cgcttcggct gagtctgaag tgccatggag gtccaaaata 2040agccattcgt gtcctggtgc agtgcccaag ccctttccac ggcgtctcct tccaccctca 2100cagtggccca gaaatcaggg ttcgcggacc ttgaccccca tgcgatgcca gggaggggcg 2160gagagggcgg tgcctgcagc gaagcagaca actctcgggt ctgtgtgtcc tgagttccca 2220gatggagaaa cgctctctgt ggtctcctcg cagtagagct cgcagcagcg aagctccgcc 2281cgcgcggctt tgattgcttc ccccgcagga tggcgccggg ctgcgggctg gaggctggag 2341gtgtccatag gtccccgggg agggagggcg ctccagccag cggggcctct tgcgtgaaac 2401actgagcgtc tccatggcat tcctgtcctt gcagaaacca gatac 2445<210>6<211>805<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6gcctctccga cagccgcgac ttctccccag gacgacgaat ctgctcgcgg cgcaggcggc 60tgacctcgag ccaccgcgca gcagctgctc tccaaccatc agcgttgccg ctgccgcaaa120ctgacacact gtttataatg tgtacataca ttgtttacct cattttgtta tttttaaaac180gaagccctgt ggaaggaaat ggaaaacttg aagcattaaa ctcagccgtt ctgttttgct240gcgtaaagtt gtctgctgtg tttctttgcg ggggcgggga gctgtgcgga taggggagta300aaagggactc cgtcttcctc cgtcactttt cacaatactc taaatgagtg caggccttac360aaggccgtga gttaggtctt ccgcagctca cggccctcgc ctctggctca gatctattcc420tcagactggc acctgcgccg tggcccgact tgacctctgg cgtgtcccct gtgcagggct480atctgccgga ggcgccgggg cggcgctcgg gtggccaggg cgcgcctcgg gcagggcgct540gaccgtggtg ctggcctggg gtcccgagag caaagcgcgc tcccgctcca cccgcggggg600cgtggcctta ctgaagctcg gttccctcct caatctgaga tctaaactga aaagtgtgcg660ttctgcattt gaggaaccag ttctcctttg ttaagtgaag ataacccctt ctcgggaagg720cctttgcttc gtctgggtga cgaagcgccc tttccagagt ggggagggga aggagccgcg780cccagaggtg ggaggaggcg ggaaa 80權(quán)利要求
1.序列1的羊生長激素釋放激素基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于它的5’端還連接有序列3的引導(dǎo)肽基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其特征在于它的5’端還連接有序列5的5’側(cè)翼核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其特征在于它的3’端還連接有序列6的3’側(cè)翼核苷酸序列。
5.序列2的羊生長激素釋放激素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的激素，其特征在于它的氮端還連接有序列4的引導(dǎo)肽。
7.含有序列1的質(zhì)粒。
8.一種促進(jìn)生長激素分泌的藥物，它的活性成分是序列1的羊生長激素釋放激素核苷酸或序列2的羊生長激素釋放激素。
9.一種治療肌肉萎縮性疾病的藥物，它的活性成分是序列1的羊生長激素釋放激素核苷酸或序列2的羊生長激素釋放激素。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為一種羊生長激素釋放激素基因及其表達(dá)產(chǎn)物與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種羊生長激素釋放激素基因及其編碼的羊生長激素釋放激素，該基因在動(dòng)物能得到較好表達(dá)，表現(xiàn)為動(dòng)物生產(chǎn)性狀的顯著提高。本發(fā)明的羊生長激素釋放激素基因的核苷酸序列為序列表中的1號(hào)序列，由135個(gè)核苷酸組成，它編碼的是序列2的蛋白質(zhì)，由44個(gè)氨基酸殘基組成。本發(fā)明的目的之二是提供一種替換GHRH自身的引導(dǎo)肽。從而可以確保引導(dǎo)該蛋白分泌到細(xì)胞外，進(jìn)入體液循環(huán)。肌肉的膜蛋白引導(dǎo)肽核苷酸序列是序列表中的3號(hào)序列。以本發(fā)明為活性成分的藥物可以用于促進(jìn)生長激素分泌提高羊的生產(chǎn)性狀也可用于肌肉萎縮性疾病的治療。
文檔編號(hào)A61K38/22GK1432577SQ0210006
公開日2003年7月30日 申請(qǐng)日期2002年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月14日
發(fā)明者孟慶勇, 李寧 申請(qǐng)人:李寧