專利名稱：：一種大黃魚生長激素基因的優(yōu)化序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種合成大黃魚生長激素基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：畢赤酵母、Pichiei/^astorid表達系統(tǒng)作為一種真核表達系統(tǒng)，不僅具備可高效、嚴格地調(diào)控外源蛋白表達的乙醇氧化酶(AOXl)啟動子，而且可以對外源蛋白進行翻譯后的加工，有利于表達出高產(chǎn)量的活性蛋白，便于工業(yè)化生產(chǎn)。此外分泌型蛋白簡化了純化步驟且糖基化程度低，對人體無明顯的抗原性，同時也適合于臨床治療的用途。iPseudoscraenacroceagrowthhormone,pcGH)具有±曾強食欲、提高飼料轉(zhuǎn)化率和促進魚體生長等作用，且不會對人體產(chǎn)生激素副作用，可望用于解決大黃魚養(yǎng)殖中存在的生長周期長、飼料利用率低、養(yǎng)殖成本高等問題。因此在魚類的水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域有重大的應(yīng)用價值，日益引起人們的關(guān)注。目前已有多種魚類的生長激素被分離、純化和表達，且等同于天然GH的生物活性，通過投喂魚類顯示較強的促生長作用。較之天然的魚類生長激素，基因工程制備的GH具有操作簡單、成本低且產(chǎn)量高等優(yōu)點，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能在畢赤酵母中高效表達的合成大黃魚生長激素基因，該基因能在畢赤酵母中高效表達重組大黃魚生長激素，為高效率的工業(yè)化生產(chǎn)重組大黃魚生長激素提供了可行性，并有助于拓寬重組大黃魚生長激素的應(yīng)用范圍。由于制約外源蛋白表達的主要因素是密碼子的使用頻率和外源基因序列的A+T組成，因此本發(fā)明通過對全基因序列進行優(yōu)化，使得PcGH序列中相對使用度(relativesynonymouscodeusage,RSCU)大于1.0的密碼子達到95%以上，并將AT含量控制在30%-55%之間，使A+T的含量控制在酵母表達的最佳范圍內(nèi)。通過化學(xué)方法合成pcGH基因，構(gòu)建畢赤酵母的表達載體，利用化學(xué)轉(zhuǎn)化技術(shù)，將該基因整合到畢赤酵母X-33菌株的染色體上并得以成功表達，表達量達到340mg/L。該表達量是目前pcGH表達的報道中表達水平最高的。本發(fā)明的特點如下(1)畢赤酵母表達系統(tǒng)較之原核表達系統(tǒng)不僅具有易操作、繁殖快等生產(chǎn)特點，還具備基因表達調(diào)控和蛋白修飾功能，大大提高產(chǎn)物的活性。同時，其高效分泌表達質(zhì)粒在表達外源蛋白過程中可將目的蛋白分泌到胞外，既保持目的蛋白的活性，又簡化了基因工程下游繁瑣而昂貴的分離純化等步驟。(2)利用畢赤酵母表達魚類的生長激素具備應(yīng)用上的優(yōu)勢，酵母本身營養(yǎng)價值高可作為優(yōu)質(zhì)的飼料營養(yǎng)源，有望大規(guī)模應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。(3)考慮到外源基因的密碼子主要在翻譯水平上影響表達，而畢赤酵母具有自身特殊的密碼子偏好。PcGH的密碼子不僅經(jīng)過全面優(yōu)化，而且控制A+T的含量在畢赤酵母表達的最佳范圍內(nèi)。保證更高的表達量滿足生產(chǎn)需要。本發(fā)明的顯著特點是提供優(yōu)化的pcGH序列及其在畢赤酵母中的高效表達重組大黃魚生長激素，有利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用，具有較好的經(jīng)濟效益。圖1為質(zhì)粒圖譜；圖2為構(gòu)建的質(zhì)粒電泳圖3為優(yōu)化的pcGH序列(a考染結(jié)果)和未經(jīng)優(yōu)化的序列(b銀染結(jié)果)在酵母中的表達SDS電泳圖4為不同試驗組大黃魚體重(a)、體長(b)變化的比較。具體實施例方式菌種、載體以及試劑為畢赤酵母菌株(P.pastorisx_33)、大腸桿菌(E.coliDH5a)和質(zhì)粒pPICZaA由福州大學(xué)生物工程研究所保存；大黃魚購自福州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站連江大官坂基地育苗車間；配合飼料為海馬飼料公司生產(chǎn)的大黃魚幼魚粉狀飼料；TaqDNApolymerase,XbaI,XhoI，HindIII,SacI，RNase，T4-DNALigase,1DNA,PlasmidDNAExtractionKit等購自上海Sangon生物工程公司或?qū)毶锕こ坦荆籘ryptone，YeastExtract等購自英國0X0ID公司Jeocin抗生素，購自美國^witrogen公司；瓊脂糖膠回收試劑盒購于Qigen公司；其它均為國產(chǎn)分析純試劑。具體步驟為1.全基因優(yōu)化合成利用DNAMAN5.22軟件分析pcGH基因密碼子組成及分布(NucleicAcidsResearch,1986,volume14,page5134,table2)，按照畢赤酵母密碼子偏好性，選擇畢赤酵母更容易翻譯的同義密碼子相對使用度(relativesynonymouscodeusage，RS⑶)大于1.O的密碼子基因，并將A+T的含量控制在畢赤酵母最佳表達的30%_55%之間，設(shè)計出優(yōu)化的全基因序列。甲醇酵母密碼子使用頻率表中U等價于T，在RNA中使用U,在DNA中使用T。優(yōu)化的基因序列為CTCGAGAAAAGACAACAAATCACTGACTCCCAAAGACTTTTCTCTATCGCCGTTTCCAGAGTTCAACACTTGCACTTGTTGGCTCAAAGATTGTTCTCTGACTTCGAATCTTACTTGCAAACTGAAGAACAAAGACAATTGAACAAGATTTTCTTGCAAGACTTCTGTAACTCTGACTACATCATCTCCCCAATCGACAAGCACGAAACCCAAAGATCTTCTGTTTTGAAGTTGTTGTCTATCTCTTACAGATTGGTCGAATCTTGGGAGTTCCCATCCAGATCCTTGTCCGGTGGTTCTGCCCCAAGAAACCAAATCTCCCCAAAGTTGTCTGAATTGAAGATGGGTATCTTGTTGTTGATCAGAGCTAACCAAGACGCTGTTGAAATTTTCCCAGACAACTCTGCTTTGCAATTGGCTCCATACGGTAACTACTACCAATCTTTGTCTGGTGAAGAATCTTTGAGAAGAACTTACGAATTGTTGGCCTGTTTCAAGAAGGACATGCACAAGGTTGAAACCTACTTGACCGTTGCCAAGTGTAGATTGTCTCCAAAGGCTAACTGTACTTTGTGATCTAGAo2.合成基因包括561bp的pcGH成熟肽核酸序列，上下游煬ol/^al酶切位點，Arg、Lys兩個堿性氨基酸的密碼子，一個終止密碼子TGA。全基因序列插入pBluescriptIISK(+)(pBS)穿梭質(zhì)粒中，設(shè)計的基因序列如下:CTCGAGAAAAGACAACA......CTTTGTGATCTAGA(劃線部分是pcGH的全基因序列)。3.表達質(zhì)粒pPICZaA-GH的構(gòu)建目的基因以及質(zhì)粒的酶切、回收、連接、感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化大腸桿菌以及克隆子的PCR鑒定，方法參見薩姆布普克J，拉塞爾DW.分子克隆實驗指南[M].黃培堂，譯.北京科學(xué)出版社，2002。根據(jù)pcGHcDNA編碼序列及克隆和檢測的需要，設(shè)計相應(yīng)的上、下游引物。上游引物P15，CTCGAGTGCAGCAAATCACAGAC3’(下劃線為IAoI酶切)下游引物P2^yTCTAGACAGGGTGCAGTTAGCTT3’(下劃線為IAaI酶切位點，為了使蛋白融合表達下游的6XHis標簽，在添加一個損al酶切位點后未添加終止密碼子)。引物合成以及陽性克隆子的測序委托上海sangon生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。4.畢赤酵母的轉(zhuǎn)化、鑒定用內(nèi)切酶feci單酶切線性化處理陽性克隆子的質(zhì)粒，PEG1000的方法轉(zhuǎn)入感受態(tài)的p.Pastorisx-^0轉(zhuǎn)化子通過抗生素^OCIN抗性篩選的方法獲得陽性克隆。以抽提的陽性克隆菌體基因組為模板進行PCR分析進一步確定篩選的p.pastoris中含有pcGH的基因。本發(fā)明選用pPICZaA作為表達載體，該載體的核心部分是醇氧化酶基因1(AOXl)的序列，該序列中含有很強的增強子和啟動子，有很強的啟動作用，其編碼的醇氧化酶占分泌蛋白的30%左右，以該基因構(gòu)建表達載體可以獲得外源基因的高效表達。在起始密碼子的下游，緊挨著來源于釀酒酵母的a-Factor信號肽序列，該序列能夠很好地引導(dǎo)外源蛋白在酵母細胞中分泌和正確修飾，從而表達出有功能的蛋白質(zhì)，并且載體中Wkocin抗性基因作為選擇標記，更易于篩選陽性克隆子。構(gòu)建的質(zhì)粒圖譜以及電泳結(jié)果分別見圖1和2。5.大黃魚生長激素的誘導(dǎo)表達將步驟4篩選的陽性克隆子接種在3mL含IOmg/mlZeocin的YPD培養(yǎng)基中搖培過夜(30°C,200r/min),按照10%接種量擴培，待0D_達到1.O時，加入甲醇至終濃度為1.0%，以后每隔24h補加甲醇至終濃度為1.O%,連續(xù)誘導(dǎo)5d。按時間點分別取300ul菌液樣品，離心收集上清和菌體，SDS-PAGE分析目的蛋白的表達。經(jīng)過初步的誘導(dǎo)表達，篩選出較高表達效率的陽性克隆子，于YP培養(yǎng)基(PH=6.0)中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，1%的甲醇誘導(dǎo)6d，取培養(yǎng)液上清SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示，在22.OkD處出現(xiàn)明顯的特異表達帶，這與pcGH理論分子量22.0kD結(jié)果一致，說明pPICZaA-pcGH在陽性克隆子中得到了成功表達。隨著誘導(dǎo)時間的遞增，融合蛋白pcGH的表達水平逐漸增高，通過sensiansys凝膠圖象分析系統(tǒng)定量分析，誘導(dǎo)5d的重組蛋白達到最高的表達量。組蛋白表達量可達上清總蛋白的80%左右。經(jīng)考馬斯亮藍法測定重組蛋白含量為340mg/L，該表達量是目前pcGH表達的報道中表達水平最高的。對未進行密碼子優(yōu)化的重組酵母在同等表達條件下pcGH的克隆和表達，銀染結(jié)果顯示最高表達量只有25ug/L，證實了酵母優(yōu)先利用其偏好密碼子，從而在一定程度上提高了翻譯效率，大大提高了表達量，證明了該發(fā)明方法的優(yōu)勢所在。結(jié)果見圖3。6.大黃魚生長激素的投喂實驗試驗魚類為大黃魚，平均體長10.0士0.5cm，平均體重20.0士5.0g，試驗前馴養(yǎng)10d。實驗將大黃魚分為6組，50尾/組，用表達的大黃魚生長激素與配合飼料混合投喂，喂養(yǎng)周期為45天。研究結(jié)果表明，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組大黃魚生長激素，具有促生長作用。在0.l%pcGH的劑量下，經(jīng)過45天的喂養(yǎng)實驗后，身長10.0士0.5cm、體重20.0士0.5g的幼年大黃魚比對照組平均增重提高27.8%。在這種情況下，縮短了養(yǎng)殖周期并降低了成本。權(quán)利要求1.一種大黃魚生長激素基因的優(yōu)化序列，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一種大黃魚生長激素的表達載體，其特征在于該載體含有權(quán)利要求1所述的優(yōu)化序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征在于將含有權(quán)利要求1所述的優(yōu)化序列的大黃魚生長激素基因克隆到pPICZaA載體中。4.一種如權(quán)利要求2或3所述的表達載體的應(yīng)用，其特征在于所述表達載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，高效表達重組大黃魚生長激素。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達載體的應(yīng)用，其特征在于重組大黃魚生長激素在畢赤酵母細胞的胞內(nèi)表達或者分泌表達。6.一種如權(quán)利要求5所述的重組大黃魚生長激素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其特征在于所述重組大黃魚生長激素的給用方式為注射或口服。全文摘要本發(fā)明提供了一種大黃魚生長激素基因的優(yōu)化序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明還提供了一種含有該優(yōu)化序列的表達載體以及將表達載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，高效表達重組大黃魚生長激素的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)化序列及其在畢赤酵母中的高效表達重組大黃魚生長激素，有利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用，具有較好的經(jīng)濟效益。文檔編號C07K14/61GK102242129SQ20111013528公開日2011年11月16日申請日期2011年5月24日優(yōu)先權(quán)日2011年5月24日發(fā)明者劉樹滔,陳菁,饒平凡,黃曉南申請人:福州大學(xué)