專利名稱：胰高血糖素樣肽-1類似物的制作方法
本申請要求2000年6月16日提交的美國臨時申請60/212,171，及2000年10月13日提交的美國臨時申請60/240,349的益處。
胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一個含有37個氨基酸的、可對食物攝入作出應(yīng)答的肽，是由腸L-細胞分泌的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-1可刺激胰島素分泌(促胰島素活性)，從而引起細胞對葡萄糖的吸收和血清葡萄糖水平下降(見如Mojsov，S.，Int.J.PeptideProtein Research，40333-343(1992))。然而，GLP-1(1-37)活性很低，所以人們的注意力集中在截短的類似物上，例如比GLP-1具有更強生物學活性的GLP化合物。其例子包括GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)NH2、Gly8-GLP-1(7-37)OH及Ser34-GLP-1(7-37)OH。由于他們具有刺激胰島素分泌的能力，GLP化合物顯示出作為在糖尿病、肥胖癥和相關(guān)狀況的治療劑方面的巨大潛力。
GLP-1化合物至少能以兩種不同形式存在。第一種形式是生理活性的，并在生理pH(7.4)下可迅速溶解在水溶液中。相反，第二種形式具有很少或沒有促胰島素活性，且基本上不溶于pH7.4的水中。偏巧當將GLP-1水溶液攪動、暴露于疏水表面或具有大的空氣/水界面時很容易形成非活性形式。轉(zhuǎn)化為不溶形式的趨勢使得商業(yè)用量的活性GLP-1化合物的生產(chǎn)復雜化了。在大批量生產(chǎn)過程中，利用泵來進行混合操作或連續(xù)操作是很普遍的，并且這些操作可引起攪動、空氣/水界面和/或與疏水表面接觸，從而形成不溶形式。在貯存中或?qū)颊呓o藥后也可能轉(zhuǎn)化為非活性形式，這進一步將利用這些化合物作為藥物復雜化了。因此，對較現(xiàn)有GLP-1化合物不易轉(zhuǎn)化為不溶形式的生物活性GLP-1類似物需求很大。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，相對于GLP-1(7-37)OH，在位點11、12、16、22、23、24、25、27、30、33、34、35、36或37中的一或多個位點進行了修飾的多種GLP-1類似物在聚集傾向方面顯示出很大的下降。
這樣的多種類似物保留有GLP-1受體活化作用，這與已知的GLP-1化合物如GLP-1(7-37)OH和Val8-GLP-1(7-37)OH相當或在某些方面要強。例如，Val8-Glu22-GLP(7-37)OH的聚集時間比GLP-1(7-37)OH長20倍以上，并且其GLP-1受體活化作用要比GLP-1(7-37)OH約高25％。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明公開了新穎的GLP-1化合物和利用新穎的GLP-1化合物進行的治療方法。
本發(fā)明的一個實施方案是具有式I(SEQ ID NO1)的氨基酸序列的多肽His-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Ala-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Ala-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-R式I(SEQ ID NO1)其中Xaa8是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa11是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；Xaa12是His，Trp，Phe，或Tyr；Xaa16是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，GLu，或Ala；Xaa22是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；Xaa23是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；Xaa24是Glu，His，Ala，或Lys；Xaa26是Asp，Lys，Glu，或His；Xaa27是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；Xaa30是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；Xaa33是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；Xaa34是Glu，Lys，或Asp；Xaa35是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；Xaa36是Arg，Glu，或His；R是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被刪除。
前提是多肽不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是多肽不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，或Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala11-Glp-1(7-37)OH，Ala11-Glp-1(7-36)NH2，Ala16-G1p-1(7-37)OH，Ala16-Glp-1(7-36)NH2，Ala27-Glp-1(7-37)OH，Ala27-Glp-1(7-36)NH2，Glu27-Glp-1(7-37)OH，Glu27-Glp-1(7-36)NH2，Ala33-Glp-1(7-37)OH，或Ala33-Glp-1(7-36)NH2。
本發(fā)明的另一個實施方案是具有式II(SEQ ID NO2)的氨基酸序列的多肽His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa35-Arg-R式II(SEQ ID NO2)其中Xaa8是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa12是His，Trp，Phe，或Tyr；Xaa16是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；Xaa22是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；Xaa23是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；Xaa26是Asp，Lys，Glu，或His；Xaa30是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；Xaa35是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；R是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被刪除。前提是多肽不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是多肽不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala16-GLP(7-37)OH，或Ala16-Glp-1(7-36)NH2。
本發(fā)明的另一個實施方案是具有式III(SEQ ID NO3)的氨基酸序列的多肽His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R式III(SEQ ID NO3)其中Xaa8是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa22是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；Xaa23是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；Xaa27是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或LysXaa30是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；RisLys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被刪除。
前提是多肽不含有GLP-1(7-37)(OH)或GLP-1(7-36)-NH2序列，以及前提是多肽不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala16-Glp-1(7-37)OH，Ala16-Glp-1(7-36)NH2，Glu27-Glp-1(7-37)OH，或Glu27-Glp-1(7-36)NH2。
本發(fā)明的另一個實施方案是具有式IV(SEQ ID NO4)的氨基酸序列的多肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R(SEQ ID NO4)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或α-甲基組氨酸；Xaa8是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。優(yōu)選地，Xaa8是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；
Xaa22是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸或半胱磺酸。
R是-NH2或Gly(OH)。
本發(fā)明的另一實施方案是第8位具有除丙氨酸之外的氨基酸及第22位具有除甘氨酸之外的氨基酸的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)化合物。
本發(fā)明的另一實施方案是在需要GLP-1受體刺激的受試者中刺激GLP-1受體的方法。此方法包括對受試者給藥以有效劑量的此處描述的GLP-1化合物或含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽。
而本發(fā)明的另一實施方案是此處描述的GLP-1化合物或含有SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、或SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽，它可在需要GLP-1受體刺激的受試者中用于刺激GLP-1受體。
本發(fā)明中的GLP-1化合物保留有GLP-1受體活化能力，此外，相對于其他GLP-1化合物，他們具有降低的聚集趨勢。這樣，就可對這些化合物溶液進行攪動而使轉(zhuǎn)化為不溶的非活性形式的量最少。這一優(yōu)點大大簡化了生產(chǎn)過程。此外，我們期望在對患者給藥后很少或不發(fā)生體內(nèi)聚集，從而提高活力并減少副作用。此外，這些GLP-1化合物可抵抗二氨基肽酶IV降解并與鋅結(jié)合，因此我們相信它們可提供更長的體內(nèi)作用時間。


圖1展示了Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO5)，Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQID NO6)，Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO7)和Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO8)的氨基酸序列。
圖2展示了Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO9)，Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQID NO10)，Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO11)和Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO12)的氨基酸序列。
圖3展示了Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO13)，Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(SEQID NO14)，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO15)，和Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO16)的氨基酸序列。
圖4展示了Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO17)和Val8-Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO18)的氨基酸序列。
GLP-1化合物是含有約25-39個天然或非天然氨基酸的多肽。它與GLP-1(7-37)OH具有充分的同源性，因此顯示促胰島素活性。非天然氨基酸的實例包括α-甲基氨基酸(如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、組氨酸樣氨基酸(如2-氨基組氨酸，β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或α-甲基組氨酸)、側(cè)鏈中含有一額外亞甲基的氨基酸(“高”氨基酸)以及側(cè)鏈中的羧酸官能團由磺酸基團取代了的氨基酸(如半胱磺酸)。然而，除非此處特別提出，本發(fā)明中的GLP-1化合物優(yōu)選僅僅包含天然氨基酸。
GLP-1化合物一般包括含有GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-37)OH類似物、GLP-1(7-37)OH片段或GLP-1(7-37)OH類似物片段的氨基酸序列的多肽。GLP-1(7-37)OH含有SEQ ID NO19的氨基酸序列7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly(SEQ ID NO19)按照本領(lǐng)域中的習慣，GLP-1(7-37)OH的氨基末端定為第7位殘基，而羧基末端定為第37位殘基。對多肽中的其他氨基酸依次進行編號，如SEQ ID NO19中所示。例如，第12位為苯丙氨酸而第22位為甘氨酸。在沒有特別指出的情況下，C-末端一般是傳統(tǒng)羧基形式。
“GLP-1片段”是在GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH類似物的N-末端或C-末端截掉一或多個氨基酸后得到的多肽。用于描述GLP-1(7-37)OH的術(shù)語涵蓋GLP-1片段。例如，GLP-1(9-36)OH表示在N-末端截掉2個氨基酸和在C-末端截掉1個氨基酸后得到的GLP-1。此片段中的氨基酸是用與GLP-1(7-37)OH中對應(yīng)氨基酸的數(shù)字來表示的。例如，GLP-1(9-36)OH中的N-末端谷氨酸在第9位；第12位是苯丙氨酸；而第22位是甘氨酸，這與GLP-1(7-37)OH相同。
“GLP-1化合物”也包括在GLP-1(7-37)OH或其片段的N-末端和/或C-末端添加一或多個氨基酸后得到的多肽。這類GLP-1化合物含有的氨基酸最多可達約39個?！把娱L的”GLP-1化合物中的氨基酸是用與GLP-1(7-37)OH中對應(yīng)氨基酸的數(shù)字來表示的。例如，通過在GLP-1(7-37)OH的N-末端添加兩個氨基酸得到的GLP-1化合物的N-末端氨基酸在第5位；而通過在GLP-1(7-37)OH的C-末端添加一個氨基酸得到的GLP-1化合物的C-末端氨基酸在第38位；因此，與GLP-1(7-37)OH中的序號相同，在這兩類“延長的”GLP-1化合物中第12位是苯丙氨酸；而第22位是甘氨酸?！把娱L的”GLP-1化合物的1-6位氨基酸優(yōu)選與GLP-1(7-37)OH中相應(yīng)的氨基酸相同，或是對GLP-1(7-37)OH中相應(yīng)氨基酸的保守取代?！把娱L的”GLP-1化合物的第38-45位氨基酸優(yōu)選的與胰高血糖素或exendin-4中相應(yīng)的氨基酸相同，或是對胰高血糖素或exendin-4中相應(yīng)氨基酸的保守取代。
“GLP-1類似物”與GLP-1(7-37)OH或其片段具有充分的同源性，從而這些類似物也具有促胰島素活性。優(yōu)選地，GLP-1類似物包含有GLP-1(7-37)OH或其片段的氨基酸序列，對其進行修飾，這樣其氨基酸序列中有1、2、3、4或5個氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH片段中相應(yīng)位置上的氨基酸不同。在此處用來命名GLP-1化合物的命名法中，取代氨基酸及其位置與母結(jié)構(gòu)相同。例如，Glu22-GLP-1(7-37)OH表示一個GLP-1化合物，其中GLP-1(7-37)OH正常的第22位甘氨酸由谷氨酸取代；Val8-G1u22-GLP-1(7-37)OH表示一個GLP-1化合物，其中GLP-1(7-37)OH正常的第8位丙氨酸和第22位甘氨酸分別由纈氨酸和谷氨酸取代。
一般來講，GLP-1化合物的N-末端不進行取代，但可進行烷基化或酰基化作用(優(yōu)選的是C1-C20)。正如在GLP-1(7-37)OH中一樣，C末端也不進行取代，但也可與-NH2、-NHR或-NRR′進行酰胺化或與-OR″進行酯化。R和R′是獨立的，可為烷基或?；?優(yōu)選C1-C20)。R”是烷基(C1-C20)。GLP-1(7-36)-NH2是“酰胺化GLP化合物”的一個例子。優(yōu)選地，本發(fā)明中的GLP-1化合物具有不為-NH2取代或為-NH2取代的C-末端。
本發(fā)明中，優(yōu)選的GLP-1化合物包括GLP-1類似物或GLP-1類似物的片段，其中這些類似物或其片段的主鏈含有除第8位丙氨酸(8位類似物)外的其他氨基酸。主鏈的第7位也可包括L-組氨酸、D-組氨酸或以修飾過的形式存在的組氨酸如脫氨基組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸或α-甲基組氨酸。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些第8位類似物優(yōu)選的含有在11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36和37位上進行的一或多個額外改變。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些第8位類似物更優(yōu)選含有在12、16、22、23、26、30、35和37位上進行的一或多個額外改變。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些第8位類似物甚至更優(yōu)選含有在22、23、27、30和37位上進行的一或多個額外改變。
與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些類似物也優(yōu)選含有6個或少于6個改變。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些類似物更優(yōu)選含有5個或少于5個改變或含有4個或少于4個改變。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些類似物甚至更優(yōu)選的含有3個或少于3個改變。與天然GLP-1(7-37)OH中的相應(yīng)氨基酸相比，這些類似物最優(yōu)選含有2個或少于2個改變。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些取代降低了GLP-1化合物聚集并產(chǎn)生不溶形式的傾向。利用如實施例3中描述的聚集檢驗來進行檢測可發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的GLP-1化合物的聚集速度一般來講要較GLP-1(7-37)OH至少慢5倍，優(yōu)選至少慢20倍，更優(yōu)選至少要慢40倍，更優(yōu)選至少要慢約50倍，甚至更優(yōu)選至少要慢約60倍，以及甚至更優(yōu)選至少要慢約65倍。優(yōu)選地，此處描述的GLP-1化合物是GLP-1(7-36)NH2或GLP-1(7-37)OH的類似物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中的GLP-1化合物第22位上的氨基酸具有一個側(cè)鏈，此側(cè)鏈含有至少兩個碳原子和一個極性或帶電的官能團。含有亞甲基和羧基碳的天冬氨酸包括在內(nèi)。更優(yōu)選的，第22位氨基酸的側(cè)鏈是一含有2-6個碳原子和一個帶電官能團，如羧酸、胺、胍基或磺酸基的直鏈或支鏈烷基。因此，第22位氨基酸的優(yōu)選實例包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸。當?shù)?2位氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或賴氨酸時，第8位氨基酸優(yōu)選為甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，而更優(yōu)選是纈氨酸或甘氨酸。側(cè)鏈具有磺酸基的氨基酸的實例是半胱磺酸(-NH-CH(CH2SO3)-CO-，縮寫為“Cya”)。當?shù)?2位是磺酸如半胱磺酸時，第8位優(yōu)選為甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，而更優(yōu)選為纈氨酸或甘氨酸。
在另一優(yōu)選的實施方案中，第8位的氨基酸優(yōu)選的是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，更優(yōu)選是纈氨酸或甘氨酸，而30位是谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸或組氨酸，更優(yōu)選的為谷氨酸。
在另一優(yōu)選的實施方案中，第8位氨基酸優(yōu)選的是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，更優(yōu)選為纈氨酸或甘氨酸，而第37位是組氨酸、賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，而更優(yōu)選的是組氨酸。
在另一優(yōu)選實施方案中，第8位氨基酸優(yōu)選的是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，更優(yōu)選的為纈氨酸或甘氨酸，而第22位是谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸或精氨酸，更優(yōu)選的是谷氨酸或賴氨酸，而第23位是賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和組氨酸，更優(yōu)選的是賴氨酸或谷氨酸。
在另一優(yōu)選實施方案中，第8位氨基酸優(yōu)選的是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，更優(yōu)選的為纈氨酸或甘氨酸，而第22位是谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸或精氨酸，更優(yōu)選的是谷氨酸或賴氨酸，而第27位是丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或組氨酸，更優(yōu)選的是丙氨酸。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明中的GLP-1組合物的第8位氨基酸和選自11位、12位、16位、22位、23位、24位、26位、27位、30位、33位、34位、35位、36位及37位氨基酸的1、2或3個氨基酸與天然的GLP-1(7-37)OH中相應(yīng)位置的氨基酸不同。
在另一優(yōu)選實施方案中，除第8位氨基酸之外，本發(fā)明中的GLP-1化合物中選自11位、12位、16位、22位、23位、24位、26位、27位、30位、33位、34位、35位、36位及37位氨基酸的1或2個氨基酸與原始的GLP-1(7-37)OH中相應(yīng)位置的氨基酸不同。
正如上文所描述的，在含有與GLP-1(7-37)或GLP-1(7-37)的片段相應(yīng)位置上的氨基酸不同的8、11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36和37位氨基酸之外，本發(fā)明中的GLP-1化合物也可以含有其他的氨基酸。GLP化合物中，除與GLP-1(7-37)OH相應(yīng)位置上的氨基酸不同的8、11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36和37位氨基酸之外的氨基酸優(yōu)選為保守取代的氨基酸，而更優(yōu)選的是高度保守取代的氨基酸。
優(yōu)選地，除與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH片段相應(yīng)位置上的氨基酸不同的第8位和第22位氨基酸外，本發(fā)明中的GLP-1化合物含有0、1、2或3個氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH相應(yīng)位置上的氨基酸不同。在一個實例中，除第8和22位氨基酸之外，在GLP-1化合物第7、21和27位的1或多個氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH片段相應(yīng)位置上的氨基酸不同。
優(yōu)選地，僅僅第7、8和22位氨基酸與GLP-1(7-37)OH(或其片段)相應(yīng)位置上的氨基酸不同。我們期望，通過利用此處所述的合適的氨基酸來取代已知的、具有生物活力的GLP-1化合物中第22位甘氨酸和優(yōu)選第8位丙氨酸來制備具有降低的聚集特性的GLP-1化合物。在Hoffman等的美國專利NO.5,977,071和Buckeley等的美國專利NO.5,545,618，Adelhorst，et al.，J.Biol。Chem.2696275(1994)中公開有已知的、具有生物活性的GLP-1化合物，在此處對其全文引用作為參考。
“保守取代”是指利用另一個與被取代氨基酸具有相同凈電荷和具有大約相同大小和形狀的氨基酸來取代此氨基酸。當它們側(cè)鏈上的碳原子和雜原子總數(shù)相差不超過4個時，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸側(cè)鏈的氨基酸大致上是大小相同的。當它們側(cè)鏈上的分支數(shù)目相差不超過1個時，它們大致具有相同的形狀。側(cè)鏈上具有苯基或取代苯基的氨基酸可認為是大小和形狀相同的。下面列出的是氨基酸的5個組。利用同一組中的一個氨基酸取代此組中的另一個氨基酸可導致保守取代
組I甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱磺酸，以及具有C1-C4脂肪族側(cè)鏈或C1-C4羥基取代的脂肪族側(cè)鏈(直鏈或單支鏈)的非天然氨基酸。
組II谷氨酸、天冬氨酸及具有羧酸取代的C1-C4脂肪族側(cè)鏈(無分支或一個分支點)的非天然氨基酸。
組III賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸及具有酰胺或胍基取代的C1-C4芳香族側(cè)鏈(無分支或一個分支點)的非天然氨基酸。
組IV谷氨酰胺、天冬酰胺及具有酰胺取代的C1-C4脂肪族側(cè)鏈(無分支或一個分支點)的非天然氨基酸。
組V苯丙氨酸、苯甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。
除非特別指明，保守取代優(yōu)選的通過天然氨基酸來進行。
“高度保守取代”是指利用另一個與被取代氨基酸在側(cè)鏈上具有相同的官能團并具有幾乎相同大小和形狀的氨基酸來取代此氨基酸。當它們側(cè)鏈上的碳原子和雜原子總數(shù)相差不超過2個時，具有脂肪族氨基酸或取代的脂肪族氨基酸側(cè)鏈的氨基酸大致上是大小相同的。當它們側(cè)鏈上具有相同的分支數(shù)目時，它們大致具有相同的形狀。高度保守取代的實例包括纈氨酸取代亮氨酸、蘇氨酸取代絲氨酸、天冬氨酸取代谷氨酸，苯甘氨酸取代苯丙氨酸。非高度保守取代的實例包括丙氨酸取代纈氨酸、丙氨酸取代絲氨酸和天冬氨酸取代絲氨酸。
本發(fā)明中的GLP-1化合物的一個實例是含有SEQ ID NO1中的氨基酸序列的多肽。在一優(yōu)選實例中，除Xaa8是Gly或Val、Xaa22是Glu或Lys及Xaa23是Glu或Lys外，此GLP-1化合物是GLP-1(7-37)OH。在另一實例中，除Xaa8是Gly或Val、Xaa30是Glu外，此GLP-1化合物是GLP-1(7-37)OH。另一實例中，除Xaa8是Gly或Val、Xaa37是His外，此GLP-1化合物是GLP-1(7-37)OH。
本發(fā)明中的GLP-1化合物的另一個實例是含有SEQ ID NO4中的氨基酸序列的多肽。在一優(yōu)選實例中，Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸和α-甲基組氨酸，Xaa8是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，優(yōu)選地，Xaa8是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；R是-NH2或Gly(OH)，而Xaa22是SEQ ID NO4中的賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸。在更優(yōu)選的實例中，Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是甘氨酸或纈氨酸，Xaa22是賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸，而R是Gly(OH)。作為選擇，SEQ ID NO4中的Xaa7、Xaa8和R與上文所描述的相同，而Xaa22是具有側(cè)鏈的氨基酸，其中此側(cè)鏈包含有磺酸基如半胱磺酸。
在本發(fā)明的GLP-1化合物的另一實例中，當?shù)?2位氨基酸具有C1-C2烷基側(cè)鏈、C1-C2羥基化烷基側(cè)鏈或C1-C2硫醇化的烷基鏈(如半胱磺酸)時，第8位氨基酸不是D-氨基酸，并且不含甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或β-丙氨酸側(cè)鏈。在本發(fā)明的GLP-1化合物的一個優(yōu)選實例中，當?shù)?2位氨基酸具有C1-C4烷基側(cè)鏈、C1-C4羥基化烷基側(cè)鏈或C1-C4硫醇化烷基鏈(如半胱磺酸)時，第8位氨基酸不是D-氨基酸，并且不含甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或β-丙氨酸側(cè)鏈。
在本發(fā)明的GLP-1化合物的另一實例中，第8位氨基酸是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸或色氨酸；而第22位氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或組氨酸。
本發(fā)明的GLP-1化合物的具體實例包括Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO20)，Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO21)，Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO22)，Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO23)，Cya22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO24)，Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQID NO5)，Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO6)，Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO7)，Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO8)，Val8-Cya22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO25)，Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO9)，Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO10)，Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO11)，Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO12)，Gly8-Cya22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO26)，Glu22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ IDNO27)，Asp22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO28)，Arg22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO29)，Lys22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO30)，Cya22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO31)，Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO32)，Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO33)，Val8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO34)，Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO35)，Val8-Cya22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO36)，Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO37)，Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO38)，Gly8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO39)，Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ IDNO40)and Gly8-Cya22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO41)，Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO42)，Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO43)，Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO44)，Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO45)，Val8-His35-GLP-l(7-37)OH(SEQ ID NO46)，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO47)，Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO48)，Val8-Glu22-Glu23-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO49)，Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO50)，Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO51)，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO52)，Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO53).
正如此處所用到的，術(shù)語‘GLP-1’化合物也包括藥學上可接受的、此處所描述的化合物的鹽。本發(fā)明中的GLP-1化合物可含有充足的酸性、堿性官能團或兩者兼具，并因此與多種無機堿、無機酸和有機酸進行反應(yīng)形成鹽。通常用于形成酸加成鹽的酸是無機酸，如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等，和有機酸如對甲苯磺酸、甲烷磺酸、草酸、對溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等。這些鹽的實例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、丁烯-1，4-二酸鹽、己烯-1，6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、苯二甲酸鹽、磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、甘醇酸鹽、酒石酸鹽、甲烷磺酸鹽、丙烷磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、扁桃酸鹽等。
GLP-1化合物可用于治療具有多種疾病和狀況的患者。我們相信，GLP-1化合物，包括本發(fā)明中的這些化合物在內(nèi)，可通過作用于稱為‘GLP-1受體’(見Thorrens的美國專利NO.6,670,360)來發(fā)揮他們的生物學效用。因此，可利用本發(fā)明中的GLP-1化合物來治療患有可對GLP-1受體刺激和/或?qū)LP-1化合物給藥作出有益應(yīng)答的疾病或狀況的患者。這些患者被稱作“需要利用GLP-1化合物進行治療”或“需要GLP-1受體刺激”。這樣的患者包括患有胰島素非依賴型糖尿病、胰島素依賴型糖尿病、卒中(見Efendic的WO 00/16979)、心肌梗塞(見Efendic的WO 98/08531)、肥胖癥(見Efendic的WO98/19698)、手術(shù)后分解代謝改變(見Efendic的美國專利.NO 6,006,753)、功能性消化不良和腸激惹綜合征(見Efendic的WO99/64060)的患者。也包括需要利用GLP-1化合物進行預(yù)防性處理的患者，如具有發(fā)生胰島素非依賴型糖尿病危險性的患者(見WO00/07617)。葡萄糖耐受異?；蚩崭蛊咸烟钱惓５氖茉囌?、體重超出相對于患者身高和體格來講的正常體重25％的受試者、進行了部分胰切除手術(shù)的受試者、雙親中有一或多個患有胰島素非依賴型糖尿病的受試者、患有妊娠期糖尿病的受試者及患有急或慢性胰腺炎的受試者具有患胰島素非依賴型糖尿病的危險性。
GLP-1化合物的‘有效量’是指對需要GLP-1受體刺激的患者給藥時，在不造成不能接受的副作用的條件下，能夠產(chǎn)生所需治療和/或預(yù)防效果的量?！璧闹委熜Чㄏ铝械囊换蚨鄠€方面1)與疾病和狀況相關(guān)的癥狀的改善；2)延緩與疾病或狀況相關(guān)的癥狀的出現(xiàn)；3)與沒有進行治療的情況相比壽命增加；以及4)相對于沒有進行治療的情況具有更高的生活質(zhì)量。例如，用于治療糖尿病的GLP-1化合物的‘有效量’指與沒有進行治療的情況相比，能對血糖濃度進行更大程度上的控制，從而延緩糖尿病并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病或腎病出現(xiàn)的量。用于預(yù)防糖尿病的GLP-1化合物的‘有效量’指與沒有進行治療的情況相比，能延緩升高的血糖水平出現(xiàn)的量，而血糖水平升高是需要用抗高血糖藥物如磺脲類、噻唑烷二酮、胰島素和/或氯苯呱哌嗪來進行治療的。
對患者給藥以GLP-1化合物的‘有效量’也依賴于疾病的類型和嚴重程度，以及依賴于患者的特點，如一般的健康程度、年齡、性別、體重和對藥物的耐受程度。在這些因素和其他的影響因素基礎(chǔ)之上，本領(lǐng)域技術(shù)人員就能確定適當?shù)膭┝?。一般情況下，對成年人來講，GLP-1化合物的有效治療量約為0.01-1000mg/天。優(yōu)選地，此劑量為約0.1-100mg/天，更優(yōu)選的是約1.0-10mg/天。
本發(fā)明的GLP-1化合物可進行如口服給藥、經(jīng)鼻給藥、吸入或腸胃外給藥。腸胃外給藥包括，如全身給藥，例如經(jīng)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射?？蓪LP-1化合物與作為藥物組合物一部分的藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑聯(lián)合給藥以治療上述疾病。如果進行腸胃外給藥，那此藥物組合物可以溶液，或以GLP-1懸浮液，或以與二價金屬陽離子進行復合的GLP-1化合物懸浮液形式存在。適當?shù)乃幬镙d體可含有惰性成分，這些惰性成分不與肽或肽衍生物相互作用。可應(yīng)用標準的藥物制劑技術(shù)，如在Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中所描述的技術(shù)。用于腸胃外給藥的適當?shù)乃幬镙d體包括，如無菌水、生理鹽水、抑菌鹽水(含有約0.9mg/ml苯甲醇的鹽水)、磷酸緩沖液、Hank’s溶液、Ringer’s乳酸鹽等。適當?shù)馁x形劑的實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇和甘露醇。
‘受試者’指哺乳動物，優(yōu)選人，但也可以是動物，如寵物(如狗、貓、等)、飼養(yǎng)動物(如牛、綿羊、豬、馬等)以及實驗室動物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
本發(fā)明中的GLP-1化合物可與適當?shù)亩r金屬陽離子進行復合。一般情況下，GLP-1化合物的二價金屬復合物在生理pH附近是不溶于水的。因此，這些復合物可用于以懸浮液的形式進行皮下給藥，其在體內(nèi)展示了降低的釋放率，從而延長了化合物的作用時間。適當?shù)亩r金屬陽離子的實例包括Zn++、Mn++、Fe++、Ca++、Co++、Cd++、Ni++等，優(yōu)選的是Zn++。
為了獲得本發(fā)明中的GLP-1化合物與二價金屬陽離子形成的復合物，在金屬鹽存在的條件下將GLP-1溶解在適當?shù)木彌_液中。在環(huán)境溫度下對此混合物進行孵育來使復合體進行沉淀。適當?shù)木彌_液是那些可以維持混合物的pH約為3.0-9.0且不干擾復合反應(yīng)的緩沖液。緩沖液的實例包括磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液和Goode’s緩沖液，如HEPES、Tris和Tris乙酸鹽。適當?shù)慕饘冫}是其中的金屬可用于復合作用的金屬鹽。適當?shù)匿\鹽的實例包括氯化鋅、乙酸鋅、氧化鋅和硫酸鋅。優(yōu)選地，提供的二價金屬陽離子鹽如氯化鋅是過量的，其摩爾比最多可達對每個GLP-1化合物分子提供約50個二價金屬陽離子分子。
‘促胰島素活性’指對升高的血糖水平做出應(yīng)答，刺激胰島素的分泌，從而細胞對血糖的攝取和血清葡萄糖水平下降?？衫帽绢I(lǐng)域中已知的方法對促胰島素活性進行檢測，這些方法包括利用體內(nèi)實驗和體外檢測來測定GLP-1受體結(jié)合活力或受體活化，如Gelfand等的EP619,322和美國專利No.5,120,712分別描述的利用胰島細胞或胰島素瘤細胞進行檢測。這些文獻的全部內(nèi)容在此處引用作為參考。
可利用固相肽合成技術(shù)的標準方法來制備本發(fā)明中的GLP-1化合物。肽合成儀可從如位于Foster City的Applied Biosystems商業(yè)購得。用于固相合成的試劑可從如Midwest Biotech(Fishers，IN)商業(yè)購得。利用固相肽合成儀，可按照生產(chǎn)說明書來阻斷干擾基團、保護要進行反應(yīng)的氨基酸、偶合、去偶合及對未反應(yīng)的氨基酸進行加帽。
一般來講，在室溫下，在惰性溶劑如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯啉或二氯甲烷中，在偶合試劑如二環(huán)己基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑及堿如二異丙基乙胺存在的條件下，樹脂上生長中肽鏈上的α-N-氨基甲?；Ｗo的氨基酸和N-末端氨基酸進行偶合。利用試劑如三氟乙酸或哌啶從生成的肽樹脂中去除α-N-氨基甲?；Ｗo基團，并通過將下一個所需的N-末端保護了的氨基酸添加到肽鏈上來重復偶合反應(yīng)。適當?shù)陌繁Ｗo基團在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且在如Green和Wuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，John Wiley和sons，1991中有描述，此處全文引用作為參考。其實例包括叔丁氧羰基(tBoc)和芴基甲氧羰基(Fmoc)。
利用進行了適當?shù)膫?cè)鏈保護的叔丁氧羰基或芴基甲氧羰基-α-氨基酸，也可按照標準的自動化固相合成規(guī)程來合成肽段。合成完成后，從固相支持物上將肽段切掉，同時利用標準的氟化氫法對側(cè)鏈進行去保護反應(yīng)。隨后，在Vydac C18色譜柱中、利用0.1％三氟乙酸(TFA)中的乙腈梯度進行反相色譜對粗肽進一步純化。為了去除乙腈，需要對含有0.1％TFA、乙腈和水的溶液進行冷凍干燥，從而得到肽段。通過分析反相色譜來檢驗其純度。肽段的成分可利用質(zhì)譜來進行檢驗。在中性pH下可將肽段溶解在水相緩沖液中。
本發(fā)明是通過下列實施例來進行說明的，但這些實施例并沒有以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1-利用固相t-Boc化學制備本發(fā)明中的GLP-1化合物將約0.5-0.6g(0.38-0.45mmol)Boc Gly-PAM樹脂置于標準的60ml反應(yīng)容器中，在Applied Biosystems ABI430A肽合成儀上進行雙偶合。從Midwest Biotech(Fishers，IN)購得下列側(cè)鏈保護的氨基酸(BOC氨基酸的2mmol cartridge)并用于合成Arg-甲苯磺?；?TOS)、Asp-δ-環(huán)己基酯(CHXL)、Glu-δ-環(huán)己基酯(CHXL)、His-芐氧基甲基(BOM)、Lys-2-氯芐氧羰基(2Cl-Z)、Met-亞砜(O)、Ser-O-芐基醚(Obzl)、Thr-O-芐基醚(Obzl)、Trp-甲酰(CHO)和Tyr-2-溴芐氧羰基(2Br-Z)及Boc Gly PAM。三氟乙酸(TFA)、二異丙基乙胺(DIEA)、溶于DMF中的0.5M羥基苯并三唑(HOBt)及溶于二氯甲烷中的0.5M二環(huán)己基碳亞胺(DCC)是從PE-AppliedBiosystems(Foster City，CA)購得的。二甲基甲酰胺(DMF-Burdickand Jackson)和二氯甲烷(DCM-Mallinkrodt)購自Mays ChemicalCo.(Indianapolis，IN)。
標準雙偶合是利用對稱的酸酐或HOBt酯來進行的，這兩種試劑都是利用DCC來制得的。第二組雙偶合(沒有進行TFA去保護)是利用Trp31、Thr13和Thr11進行的。在合成完成時，去除N-末端Boc基團，利用溶于DMF中的20％哌啶處理肽基樹脂以對Trp側(cè)鏈進行去甲?；?。利用DCM洗滌后，將樹脂轉(zhuǎn)移到TEFLON反應(yīng)容器中并真空干燥。
對含有Met的類似物來講，需要利用TFA/10％二甲亞砜(DMS)/2％濃縮鹽酸來進行樹脂上還原。將反應(yīng)容器附于HF(氫氟酸)儀器(Perninsula Laboratories)上進行切割。加入1ml m-甲酚/g樹脂并將10ml HF(購自AGA，Indianapolis，IN)冷凝到預(yù)冷過的容器中。甲硫氨酸存在時要添加1ml DMS/g樹脂。冰浴中攪拌反應(yīng)1小時并真空去除HF。殘余物懸浮于乙醚中，對固體物進行過濾，并用乙醚沖洗。將肽提取到乙酸水溶液中，將其進行冷凍干燥或者直接移入反相色譜柱中。
利用緩沖液A(0.1％三氟乙酸水溶液，B0.1％TFA乙腈溶液)，在2.2×25cm VYDAC C18柱上進行純化。在280nm(4.0)下利用UV進行檢測，用20-90％的B緩沖液在HPLC(Waters)上進行120分鐘的梯度洗脫，流速10ml/min，并收集1min的級分。將適當?shù)募壏趾喜?、冰凍并凍干。利用HPLC(0.46×15cm METASIL AQ C18)和MALDI質(zhì)譜對干燥產(chǎn)品進行分析。
實施例2-利用固相F-Moc化學制備本發(fā)明中的GLP-1化合物在9 6孔反應(yīng)板中的每個孔內(nèi)加入約114mg(50mmol)FMOC Gly WANG樹脂(購自NovaBiochem，LaJolla，CA)，并利用Advanced ChemTech396肽合成儀進行雙偶合。具有C-末端酰胺的類似物是利用75mg(50μm)Rink Avmide AM樹脂(NovaBiochem，LaJolla，CA)進行制備的。
以下FMOC氨基酸購自Advanced ChemTech(Louisville，KY)、NovaBiochem(LaJolla，CA)和Midwest Biotech(Fishers，IN)Arg-2，2，4，6，7-五甲基二羥基苯并呋喃-5-磺?；?Pbf)、Asn-三苯甲基(Trt)、Asp-β-叔丁酯(tBu)、Glu-δ-叔丁酯(tBu)、Gln-三苯甲基(Trt)、His-三苯甲基(Trt)、Lys-叔丁氧羰基(Boc)、Ser-叔丁酯(OtBu)、Thr-叔丁酯(OtBu)、Trp-叔丁氧羰基(Boc)、Tyr-叔丁酯(OtBu)。
溶劑二甲基甲酰胺(DMF-Burdick and Jackson)、N-甲基吡咯烷酮(NMP-Burdick and Jackson)、二氯甲烷(DCM-Mallinkrodt)購自Mays Chemical Co.(Indianapolis，IN)。
羥基苯并三唑(HOBt)、二異丙基碳二亞胺(DIC)、二異丙基乙胺(DIEA)及哌啶(Pip)購自Aldrich Chemical Co(Milwaukee，WI)。
將所有氨基酸溶解在0.45M HOBt的NMP溶液中，利用20％Pip/DMF進行20分鐘去保護反應(yīng)，然后進行50分鐘DIC/HOBt活化的偶合反應(yīng)。在去保護和偶合后，利用DMF洗滌每個樹脂。最后一個偶合和去保護反應(yīng)后，利用DCM洗滌肽基樹脂并在反應(yīng)板中進行真空干燥。
在適當集中反應(yīng)/切割板之后，將2ml K試劑添加到每個孔中，切割反應(yīng)混合2小時[K試劑＝0.75gm苯酚、0.5ml苯硫基甲烷、0.25ml乙硫醇、0.5ml水/10ml三氟乙酸(TFA)，所有這些試劑都購自AldrichChemical Co.，Milwaukee，WI]。將TFA濾液添加到40ml乙醚中，將沉淀物在2000rpm下離心2分鐘。輕輕倒出上清液，片狀沉淀物重新懸浮在40ml乙醚中，重新離心，重新傾倒上清液，在氮氣中干燥，然后進行真空干燥。
將每種產(chǎn)物0.3-0.6mg溶于1ml 0.1％TFA/乙腈(CAN)溶液中，取20ul進行HPLC分析
。
利用緩沖液A(0.1％三氟乙酸水溶液，B0.1％TFA乙腈溶液)，在2.2×25cm VYDAC C18柱上進行純化。在280nm(4.0)下利用UV進行檢測，用20-90％的B緩沖液在HPLC(Waters)進行120分鐘的梯度洗脫，流速10ml/min，并收集1min的級分。將適當?shù)募壏趾喜?、冰凍并凍干。利用HPLC(0.46×15cm METASIL AQ C18)和MALDI質(zhì)譜對干燥后的產(chǎn)品進行分析。
實施例3-GLP聚集檢測對本發(fā)明中的GLP肽在溶液中聚集的可能性進行分析。一般情況下，在升高的溫度下，在適當?shù)木彌_液中，對肽溶液進行攪拌，同時記錄其在350nm的濁度作為時間的函數(shù)。測量開始聚集的時間來對給定的GLP-1分子在這些特殊強調(diào)的條件下的聚集進行定量。
程序首先在堿性條件下(pH10.5)將GLP-1化合物溶解30分鐘，這樣就可將已經(jīng)聚集的物質(zhì)也溶解掉。然后將溶液pH調(diào)節(jié)到7.4并過濾。具體地，將4mg冷凍干燥的GLP-1化合物溶解在3ml 10mM磷酸鹽/10ml檸檬酸鹽中。將pH調(diào)節(jié)為10.0-10.5，并維持30分鐘。利用鹽酸將此溶液pH調(diào)節(jié)到7.4并利用適當?shù)倪^濾器，如Millex GV注射濾器(Millipore Corporation，Bedford，MA)進行過濾。然后將此溶液在10mM檸檬酸鹽、10mM磷酸鹽、150mMNaCl中，稀釋為含有0.3mg/ml蛋白的最終樣品，并調(diào)節(jié)為pH7.4-7.5。在37℃的石英杯中孵育此樣品。利用AVIV 14DS UV-VIS型分光光度計(Lakewood，NJ)，在350nm下每隔5分鐘測定溶液的濁度。在測定前30秒和測定中要利用購自Starna Cells，Inc.(Atascadero，CA)的磁力攪拌棒對溶液進行攪拌。在35)nm處的OD值增加說明有GLP-肽聚集。按照Drake的方法(Arvinte T，Cudd A，and Drake AF.(1993)J.Bio.Chem.268，6415-6422)。開始聚集的時間大約在生長前和生長相的曲線交叉點上。
在實驗間要用苛性肥皂溶液(如Contrad-70)清洗石英杯。
表1中的實驗結(jié)果報告了本發(fā)明中的多個GLP-1化合物聚集所需的時間，這些時間是以小時為單位給出的。我們可以看出，相對于以前領(lǐng)域中已知的GLP-1化合物，本發(fā)明中的化合物表現(xiàn)出延長的聚集時間。
實施例4-利用本發(fā)明中的GLP-1化合物進行的GLP-1受體活化作用本發(fā)明中的GLP-1化合物活化GLP-1受體的能力是利用體內(nèi)檢測，如在Gelfand等的EP619,322和美國專利No.5,120,712中分別描述的方法進行測定。這些參考文獻的全部內(nèi)容在此引用作為參考。相對于GLP-1(7-37)OH的活性，這些化合物的活性在表1中有報告。從這些結(jié)果中可以看出，本發(fā)明中的GLP-1化合物的活性通常與GLP-1(7-37)OH的活性相同或比GLP-1(7-37)OH的活性高。
表1以小時表示的 GLP-1受體GLP-1化合物聚集時間活化GLP-1(7-37)OH 11.0Val8-GLP-1(7-37)OH 0.9±0.2 0.47(n＝6)Gly8-His11-GLP-1(7-37)OH9*0.282Val8-Ala11-GLP-1(7-37)OH10 0.021Val8-Lys11-GLP-1(7-37)OH13 0.001Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)OH60.81Val8-Glu16-GLP-1(7-37)OH12 0.047Val8-Ala16-GLP-1(7-37)OH16 0.112Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH51.175Val8-Lys20-GLP-1(7-37)OH50.33Gln22-GLP-1(7-37)OH 70.42Val8-Ala22-GLP-1(7-37)OH19 0.56Val8-Ser22-GLP-1(7-37)OH22 0.50Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH＞90 0.40
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH72 1.29Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH100，54 0.58Val8-Pro22-GLP-1(7-37)OH＞750.01Val8-His22-GLP-1(7-37)OH＞750.14Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH224 0.53Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2＞65 1.0Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH19 1.07Val8-G1u23-GLP-1(7-36)OH65 0.28Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH＞45 0.18Val8-His24-GLP-1(7-37)OH3 0.007Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH22 0.02Ala8-His26-GLP-1(7-37)OH＞24 0.8Ala8-Glu26-GLP-1(7-37)OH＞24 0.7Val8-His27-GLP-1(7-37)OH10 0.37Val8-A1a27-GLP-1(7-37)OH2 0.47Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH＞40 0.29Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH30 0.29
Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH ＞45 0.15Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH 80.19Val8-His30-GLP-1(7-37)OH 13 0.19Val8-Glu33-GLP-1(7-37)OH ＞70 0.039Val8-Ala33-GLP-1(7-37)OH 20 0.1Val8-Gly33-GLP-1(7-37)OH 90.01Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH ＞40*0.17Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH 14 0.094Val8-His35-GLP-1(7-37)OH ＞45，30 0.41Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH 63 0.15Val8-Glu36-GLP-1(7-37)OH ＞45 0.11Val8-His36-GLP-1(7-37)OH 80.22Val8-His37-GLP-1(7-37)OH ＞40 0.33Val8-Leu16-Glu26-GLP-1(7-37)OH＞20 0.23Val8-Lys22-Glu30-GLP-1(7-37)OH40.37Val8-Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH＞30 0.35Val8-Glu22-Gln23-GLP-1(7-37)OH＞20 0.47
Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH ＞45 1.02Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH ＞65 1.43Val8-Lys33-Val34-GLP-1(7-37)OH 22 0.08Val8-Lys33-Asn34-GLP-1(7-37)OH ＞48 0.09Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH 27 0.34Val8-Gly36-Pro37-GLP-1(7-37)NH220.53*聚集時間是在30℃下測定的。
實施例5-GLP-1化合物的鋅沉淀如實施例1或2中所述制備各個GLP-1化合物。在pH10.5下，將3mg冷凍干燥過的各個GLP分子溶解在3ml 0.1M HEPES緩沖液中。隨后利用0.2N NaOH將此溶液的pH值調(diào)節(jié)為10.0和10.5。在環(huán)境溫度下，攪拌此溶液30分鐘，隨后用0.2N HCl調(diào)節(jié)其pH為7.4。利用適當?shù)淖⑸錇V器，如Millex GV注射濾器(Millipore Corporation，Bedford，MA)對此溶液進行過濾，利用分光光度計，如Beckman DU640在280nm下測定其吸光度，以此估計GLP-1化合物的濃度。隨后，將溶解在pH7.4的HEPES緩沖液中的蛋白的濃度調(diào)節(jié)為200uM。
在ELISA平板(如Falcom MicrotestTM96)中，將過濾后的GLP-1溶液(100μl)利用100μl含有多種氯化鋅水平的、pH7.4的0.1M HEPES緩沖液稀釋，這樣就得到了200μl含有多種氯化鋅水平和100μM GLP-1化合物的溶液。將這些溶液在環(huán)境溫度(22℃)下孵育18小時，隨后進行離心，例如利用具有微量反應(yīng)板適配器的Jouan CR412離心機進行離心。隨后將離心后的150ul上清液轉(zhuǎn)移到UV可讀的ELISA微量滴定板(如Costar UV滴定板)中，并在微量滴定板閱讀器(如MolecularDevices SPECTRAmax PLUS，SOFTmax PRO)上測定OD280。實驗結(jié)果如表2所示。A280值是從兩次獨立實驗得到的。
表2
表2(續(xù))
這些結(jié)果表明，僅僅需要很少量的鋅就可與這些稀釋液中的GLP-1化合物的很大部分進行復合并使這些化合物沉淀下來。
等同方案雖然本發(fā)明是參考其優(yōu)選的實施方案的來特別展示和描述，但本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員應(yīng)該明白，在不偏離所附權(quán)利要求所規(guī)定的精神和范圍基礎(chǔ)上，在形式和細節(jié)上可對其進行多種變化。本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員僅利用常規(guī)實驗就可識別和確定此處特別描述的、本發(fā)明的特定實施方案的多種等同方案。這樣的等同方案也包括在權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表<110>伊萊利利公司<120>胰高血糖素樣肽-1類似物<130>X-13989<160>53<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>變體<222>(5)..(5)<223>第5位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；<220><221>變體<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；<220><221>變體<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；<220><221>變體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>變體<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；<220><221>變體<222>(18)..(18)<223>第18位的Xaa是Glu，His，Ala，或Lys；<220><221>變體<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；<220><221>變體<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；<220><221>變體<222>(25)..(25)<223>第25位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<220><221>變體<223>第27位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；<220><221>變體<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；<220><221>變體<223>第29位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；<220><221>變體<222>(30)..(30)<223>第30位的Xaa是Arg，Glu，或His；<220><221>變體<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被刪除<400>1His Xaa Glu Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Phe Ile Ala Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30<210>2<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>變體<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；<220><221>變體<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；<220><221>變體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>變體<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；<220><221>變體<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；<220><221>變體<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<220><221>變體<222>(29)..(29)<223>第29位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，
Gly，Pro，His，or Glu；<220><221>變體<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被刪除<400>2His Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Xaa Arg Xaa20 25 30<210>3<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>變體<223>第16位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>變體<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是 His，Asp，Lys，Glu，或Gln；<220><221>變體<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；<220><221>變體<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<221>變體<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或is deleted.<400>3His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Xaa Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30<210>4<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2氨基-組氨酸β-羥基-組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基-組氨酸或α-甲基-組氨酸；<220><221>變體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>變體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Asp，Glu，Gln，Asp，Lys，Arg，或Cys；<220><221>變體<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是-NH2或Gly.<400>4Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30<210>5<211>31<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>5His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>6<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>6His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>7<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>7His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>8<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>8His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30<210>9<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>9His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>10<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>10His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>11<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>11His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>12<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>12His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>13<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>13His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>14<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>14His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>15<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>15His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His20 25 30<210>16<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>16His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His20 25 30<210>17<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>17His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Ala Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His20 25 30<210>18<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>18His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1 5 10 15Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His20 25 30<210>19<211>31<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>20<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>20His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>21<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>21His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>22<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>22His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>23<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>23His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>24<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>24His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>25<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>25His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Len Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>26<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>26His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>27<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>27His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>28<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>28His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>29<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>29His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>30<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>30His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>31<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>31His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>32<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>32His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>33<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>33His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>34<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>34His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>35<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>35His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>36<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>36His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>37<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>37His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>38<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>38His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>39<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>39His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>40<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>40His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>41<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>變體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>41His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>42<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>42His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>43<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>43His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Ala Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>44<211>31<212>PRT<213>人工序列<223>合成構(gòu)建體<400>44His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>45<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>45His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>46<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>46His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys His Arg Gly20 25 30<210>47<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>47His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His20 25 30<210>48<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>48His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>49<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>49His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>50<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>50His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Ala Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>51<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>51His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser SerTyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Gly Lys Arg Gly20 25 30<210>52<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>52His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His20 25 30<210>53<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>53His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His20 25 30
權(quán)利要求
1.一種含有式I(SEQ ID NO1)的氨基酸序列的GLP-1化合物His-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Ala-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-R式I(SEQ ID NO1)其中Xaa8是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa11是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；Xaa12是His，Trp，Phe，或Tyr；Xaa16是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；Xaa22是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；Xaa23是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；Xaa24是Glu，His，Ala，或Lys；Xaa26是Asp，Lys，Glu，或His；Xaa27是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；Xaa30是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；Xaa33是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；Xaa34是Glu，Lys，或Asp；Xaa35是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；Xaa36是Arg，Glu，或His；R是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被刪除，前提是該GLP-1化合物不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是該GLP-1化合物不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，或Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala11-Glp-1(7-37)OH，Ala11-Glp-1(7-36)NH2，Ala16-Glp-1(7-37)OH，Ala16-Glp-1(7-36)NH2，Ala27-Glp-1(7-37)OH，Ala27-Glp-1(7-36)NH2，Glu27-Glp-1(7-37)OH，Glu27-Glp-1(7-36)NH2，Ala33-Glp-1(7-37)OH，或Ala33-Glp-1(7-36)NH2。
2.一種含有式II(SEQ ID NO2)的氨基酸序列的GLP-1化合物His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa35-Arg-R式II(SEQ ID NO2)其中Xaa8是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa12是His，Trp，Phe，或Tyr；Xaa16是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；Xaa22是Gly，Asp，Glu，Gln，Ash，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；Xaa23是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；Xaa26是Asp，Lys，Glu，或His；Xaa30是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；Xaa35是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，His，或Glu；R是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被刪除，前提是該GLP-1化合物不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是該GLP-1化合物不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，Thr8-GLP-1(7-3 6)NH2，Ala16-GLP(7-37)OH，或Ala16-Glp-1(7-36)NH2。
3.一種含有式III(SEQ ID NO3)的氨基酸序列的GLP-1化合物His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R式III(SEQ ID NO3)其中Xaa8是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa22是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；Xaa23是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；Xaa27是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或LysXaa30是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；RisLys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被刪除，前提是該GLP-1化合物不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是該化合物不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala16-Glp-1(7-37)OH，Ala16-Glp-1(7-36)NH2，Glu27-Glp-1(7-37)OH，或Glu27-Glp-1(7-36)NH2。
4.權(quán)利要求1、2或3的任一項的GLP-1化合物，其中該GLP-1化合物中不超過6個氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相應(yīng)位置上的氨基酸不同。
5.權(quán)利要求4的GLP-1化合物，其中該GLP-1化合物中不超過5個氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相應(yīng)位置上的氨基酸不同。
6.權(quán)利要求5的GLP-1化合物，其中該GLP-1化合物中不超過4個氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相應(yīng)位置上的氨基酸不同。
7.權(quán)利要求6的GLP-1化合物，其中該GLP-1化合物中不超過3個氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相應(yīng)位置上的氨基酸不同。
8.權(quán)利要求7的GLP-1化合物，其中該GLP-1化合物中不超過2個氨基酸與GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相應(yīng)位置上的氨基酸不同。
9.權(quán)利要求1-8的任一項的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或纈氨酸。
10.權(quán)利要求4-8的任一項的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或纈氨酸，并且Xaa30是丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸或組氨酸。
11.權(quán)利要求10的GLP-1化合物，其中Xaa30是谷氨酸。
12.權(quán)利要求4-8的任一項的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或纈氨酸，并且Xaa37是組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸或賴氨酸。
13.權(quán)利要求1 2的GLP-1化合物，其中Xaa37是組氨酸。
14.權(quán)利要求4-8的任一項的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或纈氨酸，并且Xaa22是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸或半胱磺酸。
15.權(quán)利要求14的GLP-1化合物，其中Xaa22是天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸或精氨酸。
16.權(quán)利要求15的GLP-1化合物，其中Xaa22是谷氨酸。
17.權(quán)利要求4-7的任一項的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或纈氨酸，Xaa22是谷氨酸或賴氨酸，并且Xaa23是谷氨酸或賴氨酸。
18.權(quán)利要求4-7的任一項的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或纈氨酸，Xaa22是谷氨酸，并且Xaa27是丙氨酸。
19.一種胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)化合物，其氨基酸序列的第8位不是丙氨酸，第22位不是甘氨酸。
20.權(quán)利要求19的GLP-1化合物，其中除第8位和第22位氨基酸之外，該GLP-1化合物含有不超過3個與GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相應(yīng)位置上的氨基酸不同的氨基酸。
21.權(quán)利要求20的GLP-1化合物，其中除第8位和第22位氨基酸之外，該GLP-1化合物含有不超過2個與GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相應(yīng)位置上的氨基酸不同的氨基酸。
22.權(quán)利要求21的GLP-1化合物，其中除第8位和第22位氨基酸之外，該GLP-1化合物含有不超過1個與GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相應(yīng)位置上的氨基酸不同的氨基酸。
23.權(quán)利要求20-22的任一項的GLP-1化合物，其中與GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相應(yīng)位置上的氨基酸不同的氨基酸是對GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相應(yīng)位置上的氨基酸的保守取代。
24.權(quán)利要求19-23的任一項的GLP-1化合物，其中第22位氨基酸的側(cè)鏈含有至少兩個碳原子和一個極性或帶電官能團。
25.權(quán)利要求19-23的任一項的GLP-1化合物，其中a)第8位氨基酸是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸或色氨酸；及b)第22位氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或組氨酸。
26.權(quán)利要求19-23的任一項的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)化合物，其中第22位氨基酸具有直鏈或支鏈烷基側(cè)鏈，該側(cè)鏈含有2-6個碳原子并且被帶電官能團取代。
27.權(quán)利要求26的GLP-1化合物，其中第22位氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸或精氨酸。
28.權(quán)利要求19-23的任一項的GLP-1化合物，其中第8位氨基酸是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸。
29.權(quán)利要求28的GLP-1化合物，其中第8位氨基酸是甘氨酸或纈氨酸。
30.權(quán)利要求19-23的任一項的GLP-1化合物，該GLP-1化合物的第22位氨基酸具有含有磺酸基的側(cè)鏈。
31.權(quán)利要求29的GLP-1化合物，其中具有側(cè)鏈的氨基酸是半胱磺酸，并且其中第8位氨基酸不是丙氨酸。
32.含有SEQ ID NO4的氨基酸序列的GLP-1化合物Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R(SEQ ID NO4)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸和α-甲基組氨酸；Xaa8是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa22是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸或半胱磺酸；以及R是NH2或Gly(OH)。
33.權(quán)利要求32的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
34.權(quán)利要求33的GLP-1化合物，其中Xaa22是賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸。
35.權(quán)利要求34的GLP-1化合物，其中Xaa7是L-組氨酸，Xaa8是甘氨酸或纈氨酸，并且R是Gly(OH)。
36.權(quán)利要求34的GLP-1化合物，其中該GLP-1化合物選自a)Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO5)；b)Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO6)；c)Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO7)；和d)Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO8)。
37.權(quán)利要求34的GLP-1化合物，其中該GLP-1化合物選自a)Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO9)；b)Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO10)；c)Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO11)；和d)Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO12)。
38.權(quán)利要求1-37的任一項的GLP-1化合物，其中該GLP-1化合物與二價金屬陽離子復合。
39.權(quán)利要求38的GLP-1化合物，其中該GLP-1化合物與二價鋅陽離子復合。
40.一種對有需要的受試者進行GLP-1受體刺激的方法，該方法包括給予受試者有效量的權(quán)利要求1-39中任一項的GLP-1化合物的步驟。
41.權(quán)利要求40的方法，其中受試者正在接受對胰島素非依賴型糖尿病的治療。
42.權(quán)利要求41的方法，其中受試者正在接受對胰島素非依賴型糖尿病的預(yù)防性處理。
43.權(quán)利要求40的方法，其中受試者正在接受對肥胖癥、卒中、心肌梗塞、手術(shù)后分解代謝改變或腸激惹綜合征的治療。
44.權(quán)利要求1-39的任一項所要求保擴的GLP-1化合物在制備用于治療非胰島素依賴型糖尿病的藥物中的用途。
45.權(quán)利要求1-39的任一項所要求保護的GLP-1化合物在制備用于治療肥胖癥、卒中、心肌梗塞、手術(shù)后分解代謝改變或腸激惹綜合征的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開的是在下列一或多個位點進行了修飾的胰高血糖素樣肽－1(GLP－1)化合物，其中這些位點是11、12、16、22、23、24、25、27、30、33、34、35、36或37位。也公開了處理這些GLP－1化合物的方法。
文檔編號A61K38/26GK1468258SQ01811213
公開日2004年1月14日 申請日期2001年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月16日
發(fā)明者W·格萊斯納, W 格萊斯納, R·L·米利坎, 米利坎 申請人:伊萊利利公司