專利名稱：抗霍亂弧菌、其毒素雞卵黃抗體及其制備與應(yīng)用的制作方法
(二)、技術(shù)背景霍亂是由霍亂弧菌所引起的烈性腸道傳染病。發(fā)病急、傳播快，是亞洲、非洲大部分地區(qū)腹瀉的重要原因?？砂l(fā)生世界性大流行，屬國(guó)際檢疫傳染病。在我國(guó)《傳染病防治法》中列為甲類?；魜y的傳染源是病人和帶菌者，帶菌者和輕癥病人遠(yuǎn)較典型(中、重型)病人為多，因此霍亂更具隱蔽性，控制和消除的難度也更大。這也可能是霍亂世界性大流行迄今未能控制的重要原因之一。人群對(duì)霍亂普遍易感，感染后是否發(fā)病取決于人體免疫狀態(tài)(抵抗力)及感染病原菌的數(shù)量。本病隱性感染占75％，即無(wú)癥狀者，顯性感染(有癥狀者)占25％。因此霍亂的治療措施一直是人們關(guān)注的領(lǐng)域，目前主要治療措施是補(bǔ)液療法和抗菌藥物治療，而在預(yù)防的研究中主要是采用口服滅活菌苗、口服減毒基因工程菌苗和自然減毒活菌苗等措施，但目前所用菌苗的效果均不理想，較為有效的腸道免疫制劑目前正在研究之中。
霍亂病原菌(包括古典生物型霍亂弧菌、埃爾托生物型霍亂弧菌流行株、O139群霍亂弧菌)具有獨(dú)特的分子生物學(xué)特征和毒力特性?；魜y發(fā)病機(jī)制是霍亂病原菌進(jìn)入人體小腸后，粘附于腸道粘膜，大量繁殖并產(chǎn)生致瀉極強(qiáng)的腸毒素(CT)。CT由A、B兩個(gè)亞單位組成，其結(jié)構(gòu)組成為一個(gè)A亞單位(CTA，Mr27.2×103)，位于毒素的中心部位，周圍連接5個(gè)呈環(huán)狀的B亞單位(CTB，Mr11.6×103)，B亞單位可以和小腸粘膜細(xì)胞上的GM1受體結(jié)合，有利于A亞單位進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮毒性作用；A亞單位可以激活胞內(nèi)的腺苷環(huán)化酶，使胞內(nèi)cAMP濃度升高，細(xì)胞分泌增加，大量腸液積聚，形成嚴(yán)重的水樣腹瀉綜合癥，故CT毒素分子是霍亂弧菌的主要致病因子。
雞卵黃抗體(IgY)是來(lái)自雞血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的結(jié)構(gòu)與IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空間構(gòu)象。研究表明IgY具有高度的穩(wěn)定性，對(duì)熱、酸、堿環(huán)境中具有優(yōu)良的耐受性，同時(shí)IgY還具有成本低、易于形成規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)已有病毒、細(xì)菌等顆粒性抗原誘導(dǎo)雞卵黃表達(dá)特異性抗體的研究報(bào)告。
現(xiàn)有技術(shù)中未見有通過采用霍亂弧菌及其毒素作為抗原，免疫健康母雞，收集其所產(chǎn)的卵，再?gòu)穆阎刑崛】?VcIgY和抗-CTIgY方法的報(bào)道。
(三)、發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明通過以Vc或提取Vc細(xì)胞毒素蛋白CT，以它們?yōu)榭乖?，免疫健康產(chǎn)蛋母雞，提取活性成分(抗-VcIgY、抗-CTIgY、抗-CTIgY)。為治療Vc感染提供一條新思路和新方法，并為進(jìn)一步制備抗Vc的免疫生物制劑奠定基礎(chǔ)。因此本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種具有抗體活性的抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供上述抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)的制備方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三是提供上述抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)在制備用于因感染霍亂弧菌引起的烈性腸道傳染病的預(yù)防或治療的藥物制劑或保健品應(yīng)用，以及在制備用于霍亂弧菌的臨床診斷或檢測(cè)的檢測(cè)試劑的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題之一所提供的抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)，其特征在于所述抗-VcIgY、抗-CTIgY按YSDS-PAGE電泳(7.5％分離膠)檢測(cè)，圖譜呈現(xiàn)單一區(qū)帶；經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈藍(lán)色；免疫印記Western-blotting檢測(cè)中高分子量帶處出現(xiàn)清晰單一的特異性酶染條帶；用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定以計(jì)算出蛋白濃度(mg/ml)為(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題之二是通過采用這樣的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，即一種制備抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)的方法，其特征在于采用如下的步驟完成1.制備Vc菌體抗原產(chǎn)霍亂病原菌(古典生物型霍亂弧菌、埃爾托生物型霍亂弧菌流行株、O139群霍亂弧菌)菌株，涂布于TCBS瓊脂上，37C培養(yǎng)24h，得純菌種后，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24h。收集菌體的Vc菌液，超聲波破碎，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。
2.制備CT毒素抗原(1)提取法①.Vc細(xì)胞株的培養(yǎng)產(chǎn)霍亂病原菌菌株，涂布于TCBS瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24h。收集培養(yǎng)上清，通過超濾和親和層析分離得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得CT毒素抗原。
②.毒性蛋白的制備A.超濾法根據(jù)已經(jīng)知道的CT的分子量(78000)、采用膜過濾的方法制備。B、層析分離法參考Kelstein等的方法，采用親和層析柱分離提取CT毒素，最后冷凍干燥保存。
或(2)合成法構(gòu)建含有CT細(xì)胞毒素A亞單位和B亞單位的基因表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，制備CT毒素A亞單位(CTA)和B亞單位(CTB)毒素，單獨(dú)CTB或按重量比1∶1混合作為免疫抗原，加入等體積的福氏佐劑，乳化混勻得CT毒素抗原。
3.將菌體抗原和CT毒素抗原按以下的步驟制備抗體(1).對(duì)產(chǎn)卵母雞的免疫選用產(chǎn)卵母雞(健康)隔離飼養(yǎng)。進(jìn)行雞皮下多點(diǎn)注射，如五點(diǎn)，菌體為109CFU/ml，毒素蛋白量相當(dāng)于1010CFU/ml細(xì)菌所產(chǎn)生。以后每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次；于7天后開始收集雞蛋，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> (2).卵黃抗體的提?、?采用水溶法提取卵黃抗體。從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調(diào)整適當(dāng)PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-VcIgY、抗-CTIgY?；颌诓捎媚み^濾法提取卵黃抗體。分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD-200KD的蛋白物質(zhì)，冷凍干燥得到抗-VcIgY、抗-CTIgY。
本發(fā)明所提供的上述抗-VcIgY和抗-CTIgY產(chǎn)品由霍亂弧菌及其毒素免疫產(chǎn)卵母雞而得，具有特異性，對(duì)防治霍亂弧菌感染引起的烈性腸道傳染病具有良好的效果。本發(fā)明采用母雞所產(chǎn)雞卵為載體，安全無(wú)毒，易于產(chǎn)業(yè)化。
(四)、附圖
的說明附圖給出了本發(fā)明制備方法的工藝流程圖。
實(shí)施例2Vc菌體抗原的制備，產(chǎn)霍亂病原菌菌株，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24h。收集菌體的Vc菌液，超聲波破碎，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。
實(shí)施例3細(xì)胞毒素CT抗原的制備，分離得到產(chǎn)毒素的CT菌株，涂布于TCBS瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)上清，通過超濾和層析分離得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得CT毒素抗原。
實(shí)施例4構(gòu)建含有CT細(xì)胞毒素A亞單位和B亞單位的基因表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，制備CT毒素A亞單位(CTA)和B亞單位(CTB)毒素，單獨(dú)CTB或按重量比1∶1混合作為免疫抗原，加入等體積的福氏佐劑，乳化混勻得CT毒素抗原。
實(shí)施例5采用如下方式分離提取抗-VcIgY和抗-CTIgY從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調(diào)整適當(dāng)PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-VcIgY和抗-CTIgY。
實(shí)施例6分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD-200KD的蛋白物質(zhì)，冷凍干燥得到抗-VcIgY和抗-CTIgY。
實(shí)施例7取實(shí)施例1、5、6中的產(chǎn)品進(jìn)行IgY純度檢查用PAGE電泳檢測(cè)純化的卵黃抗體的純度，電泳中只出現(xiàn)一條電泳帶，即為提純的卵黃抗體。
實(shí)施例8取實(shí)施例1、5、6中的產(chǎn)品進(jìn)行IgY濃度檢查將提取的用PBS作5-10倍的稀釋，然后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定以計(jì)算出蛋白濃度。
蛋白濃度(mg/ml)＝(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)實(shí)施例9取實(shí)施例1、5、6中的產(chǎn)品進(jìn)行IgY效價(jià)測(cè)定采用奧氏雙擴(kuò)散方法進(jìn)行IgY效價(jià)測(cè)定，IgY效價(jià)為1∶640-1∶25600。
實(shí)施例10采集抗-VcIgY免疫蛋50個(gè)，分離得到800ml蛋黃，加水稀釋至5000ml，離心得到清液4000ml，采用中空纖維超濾提取，最后濃縮至400ml待用，其中含有精提(即指純度在99.5％以上的IgY抗-VcIgY)12克。將麥芽糖10克加入5ml水溶解，100℃滅菌30分鐘，將處理過的輔料與50ml超濾液混合均勻，冷凍干燥，無(wú)菌粉碎包裝成袋，每小袋內(nèi)含0.5克，用于治療因CT感染引起的烈性腸道傳染病。
實(shí)施例11采集抗-CTIgY免疫蛋50個(gè)，分離得到800ml蛋黃，加水稀釋至5000ml，離心得到清液4000ml，采用中空纖維超濾提取，最后濃縮至400ml待用，其中含有精提(即指純度在99.5％以上的IgY抗-CTIgY)10克。將醫(yī)用淀粉10克加入5ml水溶解，100℃滅菌30分鐘，將處理過的輔料與50ml超濾液混合均勻，冷凍干燥，無(wú)菌粉碎包裝成袋，每小袋內(nèi)含0.5克，用于治療因CT感染引起的烈性腸道傳染病。
實(shí)施例12采集抗-VcIgY免疫蛋100個(gè)，得到1600ml蛋黃，加2倍PBS稀釋液，并加入3.5％PEG6000攪拌靜置2小時(shí)，離心得到清液3500ml，再加PEG6000至終濃度為12％，靜置2小時(shí)，離心收集沉淀。以100ml蒸餾水溶解IgY沉淀，通過細(xì)菌過濾器除菌，冷凍干燥，以每個(gè)普通膠囊裝200mg粗提抗-VcIgY進(jìn)行灌裝，所得產(chǎn)品用于預(yù)防CT感染，人體服用方法每天2-3次，每次3粒膠囊。
實(shí)施例13采集抗-CTIgY免疫蛋100個(gè)，得到1600ml蛋黃，加2倍PBS稀釋液，并加入3.5％PEG6000攪拌靜置2小時(shí)，離心得到清液3500ml，再加PEG6000至終濃度為12％，靜置2小時(shí)，離心收集沉淀。以100ml蒸餾水溶解IgY沉淀，通過細(xì)菌過濾器除菌，冷凍干燥，以每個(gè)普通膠囊裝250mg粗提抗-CTIgY進(jìn)行灌裝，所得產(chǎn)品用于預(yù)防CT感染，人體服用方法每天2-3次，每次4粒膠囊。
實(shí)施例14體外實(shí)驗(yàn)①.分子量檢測(cè)SDS-PAGE電脈，分離膠長(zhǎng)度8％，濃縮膠濃度5％，穩(wěn)流11mA電脈5h，Marker采用低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，取下凝膠用于常規(guī)銀染色法和電轉(zhuǎn)移電脈。
②.純度分析免疫印跡，參照文獻(xiàn)進(jìn)行。
③.活性檢測(cè)ELISA間接試驗(yàn)，操作方法參照常規(guī)ELISA間接法，所用抗原、抗-VcIgY(或抗-CTIgY)、酶標(biāo)抗體均按棋盤滴定法確定工作濃度，毒素抗原濃度為100ug/ml，包被板每孔加樣100ml，被測(cè)抗-VcIgY濃度為5ug/ml(抗-CTIgY為8ug/ml)，每孔加樣100ml，辣板過氧化物酶標(biāo)抗IgY-IgG(Sigma公司)工作稀釋度為1∶1000，底物為OPD，2ml/濃硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀492nm下測(cè)定OD值。
實(shí)施例15CT細(xì)胞毒素對(duì)IEC細(xì)胞株毒性及IgY抗體保護(hù)作用①.形態(tài)學(xué)觀察正常IEC細(xì)胞呈貼壁的多形性生長(zhǎng)，且折光良好。CT毒素作用后，細(xì)胞球形變，胞漿內(nèi)出現(xiàn)多顆粒，當(dāng)濃度＞50ug/ml時(shí)，IEC細(xì)胞多以裂解，殘余細(xì)胞體積明顯皺縮。透時(shí)電鏡呈現(xiàn)類似改變。
②.生化檢測(cè)通過測(cè)定細(xì)胞MTT、LDH(乳酸脫氫酶)、cAMP也發(fā)現(xiàn)CT毒素作用后，MTT呈進(jìn)行性下降，而LDH和cAMP濃度持續(xù)增高。
③.細(xì)胞因子(炎癥介質(zhì))的釋放IL-6(白介素-6)TNF-2(腫瘤壞死因子-2)的活性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)都有不同程度的升高。
實(shí)施例16抗-CTIgY體外拮抗毒素生物活性實(shí)驗(yàn)抗-CTIgY(10ug～200ug/ml)與CT毒素(30～90ug/ml)在無(wú)菌條件下1∶1混合。37℃2h后，取0.1ml上清加入IEC細(xì)胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)IgY濃度在100～200ug/ml可完全阻斷CT毒素對(duì)IEC細(xì)胞的毒性作用；其后的系列稀釋，其保護(hù)活性亦隨之減低，顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察亦獲得相同結(jié)果正常IEC細(xì)胞呈貼壁的多形性生長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)顆粒，且折光良好。CT毒素作用后，細(xì)胞球形變，胞漿內(nèi)出現(xiàn)多顆粒，當(dāng)濃度＞50ug/ml時(shí)，IEC細(xì)胞多以裂解，殘余細(xì)胞體積明顯皺縮。拮抗毒素后，細(xì)胞的形態(tài)改變減輕。
實(shí)施例17抗-VcIgY和抗-CTIgY在體生物學(xué)活性觀察參照相關(guān)文獻(xiàn)建立嚙齒類動(dòng)物Vc感染的模型，試驗(yàn)分為治療組(低劑量(10mg/Kg)、中劑量(25mg/Kg)、高劑量(50mg/Kg)抗-VcIgY)，對(duì)照組；治療10、20、30天后，觀察動(dòng)物的腹瀉情況，腸粘膜病理學(xué)檢查，Vc細(xì)菌檢測(cè)和CT毒素含量測(cè)定等指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中、高劑量組在治療5天后，腹瀉癥狀減輕，粘膜毒素含量明顯下降，10天后動(dòng)物的腸粘膜病理學(xué)檢查指標(biāo)有明顯改善，毒素含量為進(jìn)一步降低。
實(shí)施例18抗-VcIgY和抗-CTIgY與抗生素聯(lián)合應(yīng)用生物學(xué)活性觀察參照相關(guān)文獻(xiàn)建立嚙齒類動(dòng)物Vc感染的模型，試驗(yàn)分為單純抗-VcIgY治療組、單純抗-CTIgY治療組、單純抗生素(復(fù)方磺胺甲噁唑)治療組、聯(lián)合組。治療5、10、15天后，觀察動(dòng)物腹瀉情況，腸粘膜病理學(xué)檢查，Vc細(xì)菌檢測(cè)和CT毒素含量測(cè)定等指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組較兩單純組在治療5天后，動(dòng)物的腹瀉情況，腸粘膜病理學(xué)改善、粘膜毒素含量和Vc數(shù)量均有明顯下降；單純抗-CTIgY治療組的腸粘膜毒素含量小于單純抗生素治療組和單純抗-VcIgY治療組。
權(quán)利要求
1.一種抗霍亂弧菌及其毒素的雞卵黃抗體(抗-VcIgY和抗-CTIgY)，其特征在于上述抗體按YSDS-PAGE電泳(7.5％分離膠)檢測(cè)，圖譜呈現(xiàn)單一區(qū)帶；經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈藍(lán)色；免疫印記Western-blotting檢測(cè)中高分子量帶處出現(xiàn)清晰單一的特異性酶染條帶；用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定以計(jì)算出蛋白濃度(mg/ml)為(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)。
2.一種制備抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體，即抗-VcIgY和抗-CTIgY的方法，其特征在于采用如下的工藝步驟(1)制備菌體抗原產(chǎn)霍亂病原菌(古典生物型霍亂弧菌、埃爾托生物型霍亂弧菌流行株、O139群霍亂弧菌)菌株，涂布于TCBS瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24h；收集菌體的VC菌液，超聲波破碎，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。(2)制備CT毒素抗原①.提取法產(chǎn)毒霍亂病原菌菌株在TCBS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)上清，通過超濾和親和層析分離得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得CT毒素抗原。或②.合成法構(gòu)建含有CT細(xì)胞毒素A亞單位和B亞單位的基因表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，制備CT毒素A亞單位(CTA)和B亞單位(CTB)毒素，單獨(dú)CTB或按重量比1∶1混合作為免疫抗原，加入等體積的福氏佐劑，乳化混勻得CT毒素抗原。(3)再將所得的菌體和CT毒素抗原按以下的步驟制備抗體①.對(duì)產(chǎn)卵母雞的免疫選用產(chǎn)卵母雞(健康)隔離飼養(yǎng)，進(jìn)行雞皮下注射，菌體為109CFU/ml，毒素蛋白量相當(dāng)于1010CFU/ml細(xì)菌所產(chǎn)生，以后每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共計(jì)免疫8次，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?；?卵黃抗體的提取A.采用水溶法提取卵黃抗體；從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調(diào)整適當(dāng)PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-VcIgY和抗-CTIgY；或B.采用膜過濾法提取卵黃抗體分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD-200KD的蛋白物質(zhì)，冷凍干燥得到抗-VcIgY和抗-CTIgY。
3.抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體，即抗-VcIgY和抗-CTIgY在制備用于治療因霍亂弧菌感染引起的相關(guān)疾病藥物或保健品中的應(yīng)用。
4.抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體，即抗-VcIgY和抗-CTIgY在制備用于檢測(cè)因霍亂弧菌感染引起的相關(guān)疾病的制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗體活性的抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗－VcIgY、抗－CTIgY)、制備該抗體的方法及其在制備用于治療因霍亂弧菌感染引起的相關(guān)疾病藥物或保健品中和在制備用于檢測(cè)因霍亂弧菌感染引起的相關(guān)疾病的制劑中的應(yīng)用。上述抗體經(jīng)IgY純度檢查:用PAGE電泳檢測(cè)純化的卵黃抗體的純度,電泳中只出現(xiàn)一條電泳帶;用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定以計(jì)算出蛋白濃度(mg/ml)為:(1.45×OD
文檔編號(hào)A61P31/04GK1362418SQ0113372
公開日2002年8月7日 申請(qǐng)日期2001年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者陳君, 雁杰 申請(qǐng)人:重慶和潤(rùn)實(shí)業(yè)(集團(tuán))有限公司