專利名稱：Hcv疫苗的制作方法
HCV疫苗
本發(fā)明涉及用于預(yù)防HCV感染和用于治療HCV感染的患者(特別 是慢性肝炎患者)的疫苗和疫苗接種策略。
大約3。/。的世界人口(約170百萬人)存在慢性丙型肝炎病毒(HCV) 感染的情況。丙型肝炎病毒(HCV)是一種黃病毒科的一員，目前有至 少6種HCV基因型，并且已經(jīng)對(duì)50多種亞型進(jìn)行了描述。在美國、歐 洲和日本，基因型1、 2和3是最普通的。HCV基因型的地理分布變化 極大，其中基因型la主要分布于美國和西歐的部分地區(qū)，而基因型 lb主要分布在歐洲南部和中歐地區(qū)。HCV通過腸胃外途徑或經(jīng)皮途徑 傳播，并在肝細(xì)胞中復(fù)制。大約15%的患者經(jīng)歷過與病毒清除和康復(fù) 有關(guān)的急性自限型肝炎。大約85%的感染者成為慢性攜帶者。感染過 程通常在無癥狀表現(xiàn)的情況下以緩慢的進(jìn)程持續(xù)若干年，然而最終， HCV主要導(dǎo)致肝硬變、晚期肝病和肝癌。CD4+輔助性T細(xì)胞(HTL) 和CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)這二者的應(yīng)答的強(qiáng)度和質(zhì)量決定了患者 是康復(fù)(自發(fā)的或是經(jīng)過治療后的結(jié)果)還是發(fā)展成慢性感染。在丙 型肝炎的自然發(fā)展過程中，在20-30年內(nèi)，大約25%的患者發(fā)展成肝 硬變，而大約5%的患者發(fā)展成肝細(xì)胞癌。對(duì)這些慢性丙型肝炎的后遺 癥(包括肝移植)進(jìn)行治療導(dǎo)致大量的費(fèi)用產(chǎn)生。
目前，基于a干擾素和利巴韋林的結(jié)合治療是針對(duì)慢性丙型肝炎 患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。然而，在大約50%的患者中，以及在僅僅43% 至46。/。的感染了在歐洲、美國和加拿大最普遍的、基因型為1型的丙 型肝炎病毒的患者中，都對(duì)所述治療產(chǎn)生了持續(xù)應(yīng)答(SR)，其中所 述持續(xù)應(yīng)答可定義為在停止治療后的6個(gè)月內(nèi)，不存在可檢測(cè)的病毒 血癥。這種治療方法的低的可耐受能力以及相當(dāng)大的副作用無疑使新 的治療干預(yù)(包括治療疫苗)成為必要。因此，對(duì)新的治療方式進(jìn)行 評(píng)價(jià)是有根據(jù)的?；赼干擾素的治療具有相當(dāng)大的副作用，例如類流感綜合癥、 發(fā)燒、頭痛、關(guān)節(jié)痛、肌痛、抑郁、體重減輕、脫發(fā)、白血球減少以 及血小板減少。這些副作用通常非常明顯，并且可以對(duì)生命的品質(zhì)或 工作能力造成限制。干擾素治療方法特別受到血液副作用(血小板減 少癥)的限制，并且在許多已經(jīng)患有血小板減少癥(由于肝硬變?cè)斐桑?并伴有脾腫大)的患者中是不當(dāng)?shù)摹?br> 利巴韋林也具有多種副作用，并且這些副作用在臨床上是重大的。 利巴韋林會(huì)誘導(dǎo)溶血作用和顯著的貧血，這可以導(dǎo)致向組織傳遞氧的 過程降低，并且利巴韋林與冠心病患者的心肌梗塞有關(guān)。此外，施用 利巴韋林會(huì)潛在地引起畸形、導(dǎo)致突變和致癌。因此，在對(duì)育兒期的 男性和女性患者進(jìn)行利巴韋林的治療期間，必需進(jìn)行避孕措施。
諸如HCV特異性蛋白酶、聚合酶或解旋酶抑制劑之類的其他可能 的治療策略還處于臨床前階段或早期臨床研發(fā)階段。目前，還不能預(yù) 見這些方法的臨床實(shí)用性。
由于所述標(biāo)準(zhǔn)的治療方法一方面存在這種有限的效力而另一方面 又存在著嚴(yán)重的副作用，所以迫切地需要用于丙型肝炎的新的治療方 式。
一直以來所從事的研究策略在于研發(fā)出基于肽的疫苗。已經(jīng)顯示 出這種途徑可能會(huì)成功的方法在(例如)專利文獻(xiàn)W0 01/24822、 W0 2004/024182、 W0 2005/04910或PCT/EP2005/054773中有所描述。
因此，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的方 法，其中每兩周對(duì)人類個(gè)體進(jìn)行HCV疫苗給藥至少3次，所述HCV疫
苗包含
-有效量的至少一種HCV T細(xì)胞抗原，以及 -含有肽鍵的聚陽離子化合物。
根據(jù)本發(fā)明，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)含有HCV T細(xì)胞抗原的HCV疫苗的 效力高度取決于給藥頻率。諸如給藥途徑、疫苗劑量的總數(shù)或每劑量 中使用的抗原的量之類的其他給藥參數(shù)也是重要的，但是對(duì)于最佳效 力而言，這些參數(shù)不如給藥頻率重要。對(duì)于待接種疫苗的人類個(gè)體而言，高效的給藥頻率會(huì)反應(yīng)出疫苗應(yīng)答與該個(gè)體的耐受能力之間的平 衡。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，與(例如)每天、每周或每月(四周)的給藥
頻率相比，所述的每兩周施用HCV T細(xì)胞疫苗的方式所產(chǎn)生的總效力 是優(yōu)異的。這可以通過比較臨床試驗(yàn)(在健康志愿者以及患者(特別是 慢性HCV患者)中)得到證實(shí)。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是盡可能嚴(yán)格地將每兩周的給藥頻率保持為 14天的時(shí)間間隔。然而，疫苗的給藥頻率還可以為IO天至20天的時(shí) 間間隔，優(yōu)選為11天至18天的時(shí)間間隔，特別為12天至16天的時(shí) 間間隔(這種給藥頻率由于諸如可行性和患者的健康狀況之類的實(shí)際 環(huán)境而成為必要)，鑒于此類疫苗接種策略的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施方法，所以上 述給藥頻率也被認(rèn)為是滿足所述的"每2周"進(jìn)行給藥的要求的。
雖然進(jìn)行2次或3次的每兩周給藥沒有消除疫苗的效力，但是優(yōu) 選的是，根據(jù)本發(fā)明的HCV疫苗每2周給藥至少進(jìn)行4次，優(yōu)選為至 少6次，特別為至少8次。已經(jīng)證實(shí)，這種為期12至16周的疫苗接 種策略對(duì)于慢性HCV患者而言是特別有效的。還可以采用間斷的疫苗 接種策略，例如在最初接種疫苗后，在中斷一段較長的時(shí)間后再進(jìn)行 強(qiáng)化注射。例如，在初期疫苗接種階段(采用進(jìn)行3、 4、 5、 6、 7或 8次的每2周疫苗接種方式)之后，接著進(jìn)行后期的強(qiáng)化接種，例如 在所述的每2周疫苗接種之后進(jìn)行1至12個(gè)月的強(qiáng)化接種，優(yōu)選為2 至6個(gè)月的強(qiáng)化接種。
優(yōu)選的是，將根據(jù)本發(fā)明的HCV疫苗中的HCV T細(xì)胞表位與合適 的佐劑、免疫刺激物質(zhì)等結(jié)合，以便能夠針對(duì)應(yīng)施用所述疫苗的個(gè)體 的免疫系統(tǒng)，增進(jìn)或確保HCVT細(xì)胞抗原適當(dāng)?shù)爻蔬f。因此，除了 HCV 抗原以外，根據(jù)本發(fā)明的疫苗還包含含有肽鍵的聚陽離子化合物。優(yōu) 選地，根據(jù)本發(fā)明的含有肽鍵的聚陽離子化合物選自堿性多肽、有機(jī) 聚陽離子化合物、堿性聚氨基酸及其混合物。優(yōu)選的含有肽鍵的聚陽 離子化合物包含鏈長為至少4個(gè)氨基酸殘基的肽鏈。
因此，優(yōu)選的是選自以下物質(zhì)中的聚陽離子化合物，所迷物質(zhì)包 括在多于8個(gè)、特別是多于20個(gè)的氨基酸殘基中含有多于20%、特
8別是多于50%的堿性氨基酸的多肽；特別是聚精氨酸或聚賴氨酸；聚 陽離子型抗微生物肽；含有至少2個(gè)KLK基序(其由具有3至7個(gè)疏 水性氨基酸的連接體隔開)的肽；或其混合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明 的含有肽鍵的聚陽離子化合物含有20至500個(gè)氨基酸殘基，特別是含 有30至200個(gè)氨基酸殘基。
這些聚陽離子化合物可以以化學(xué)方式或重組方式制備，或者可以 得自天然來源。
陽離子(多)肽還可是抗微生物肽。這些(多)肽可以來源于原 核生物，或者來源于動(dòng)物或植物，或者可以以化學(xué)方式或重組方式制 備。所述肽還可以屬于防衛(wèi)素的種類。這些肽的序列可以在(例如) 合適的綜述文獻(xiàn)(例如Curr Pharm Des. 2002; 8 (9) : 743-61 )中或 在以下網(wǎng)址所示的抗微生物序列數(shù)據(jù)庫中找到，所述網(wǎng)址為 http: //www, bbcm. univ. trieste. it/~ tossi/pag2. html。
這種宿主防衛(wèi)肽或防御物質(zhì)也是根據(jù)本發(fā)明的聚陽離子聚合物的 優(yōu)選形式?？傮w而言，可以作為終產(chǎn)物活化(或下調(diào))合適的免疫系 統(tǒng)(優(yōu)選通過APC (包括樹突細(xì)胞)介導(dǎo))的化合物用作聚陽離子聚 合物。
特別優(yōu)選的用作本發(fā)明的聚陽離子化合物的是由抗菌肽 (cathelicidin)衍生的抗微生物肽或其衍生物(參見國際專利申請(qǐng) W0 02/13857,該專利文獻(xiàn)以引用方式并入本文)，特別是由哺乳動(dòng)物 的抗菌肽衍生的抗微生物肽，所述抗菌肽優(yōu)選得自人、?；蛐∈?。
由天然來源衍生的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT (衍 生所得的陽離子肽、觸角肽(antennapedia peptide)、脫乙酰殼多糖、 或殼多糖的其他衍生物)，或者釆用生物化學(xué)制備方法或重組制備方 法由所述這些肽或蛋白質(zhì)衍生的其他的肽。其他優(yōu)選的聚陽離子化合 物為抗微生物肽前體(cathelin)或與抗微生物肽前體相關(guān)的或由抗 微生物肽前體衍生的物質(zhì)。例如，小鼠的抗微生物肽前體是氨基酸序 列為NH2-RLAGLLRKGGBKIGEKLKKIG0KIOFFQKLVPQPE-C00H的肽。相關(guān)
的或衍生的抗微生物肽前體物質(zhì)具有全部或部分(具有至少15-20個(gè)氨基酸殘基)的抗微生物肽前體的序列。所述衍生物可以包括由非20 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的氨基酸對(duì)天然氨基酸進(jìn)行取代或修飾而得的產(chǎn)物。 此外，其他的陽離子殘基可以被引入到這種抗微生物肽前體分子中。 這些抗微生物肽前體分子優(yōu)選地與抗原相結(jié)合。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在 未加入其他佐劑的條件下，這些抗微生物肽前體分子還可以有效地作 為用于抗原的佐劑。因此，在含有或不含有其他免疫活化物質(zhì)的條件 下，都可以使用根據(jù)本發(fā)明的含有肽鍵的聚陽離子化合物(例如所述 的抗微生物肽前體分子)作為疫苗配制物中的有效的佐劑。
根據(jù)本發(fā)明使用的另一種優(yōu)選的聚陽離子化合物是這樣的合成 肽，該合成肽含有至少2個(gè)KLK基序，并且該至少2個(gè)KLK基序被具 有3至7個(gè)疏水性氨基酸的連接體所隔開(參見國際專利申請(qǐng)W0 02/32451，該專利文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。因此，優(yōu)選的HCV疫 苗進(jìn)一步含包含序列為RrXZXzNXZX-R2的肽，其中N為3至7的整數(shù)， 優(yōu)選為5;X為帶正電荷的天然和/或非天然的氨基酸殘基；Z為選自L、 V、 I、 F和/或W中的氨基酸殘基；Rt和R2互相獨(dú)立地選自-H、-冊(cè)2、 -COCH;、 -COH、具有至多20個(gè)氨基酸殘基的肽、或者含有或不含有肽 的肽反應(yīng)性基團(tuán)或肽連接體；X-R2可以是所述多肽的C末端氨基酸殘 基的酰胺、酯或硫代酯。
根據(jù)本發(fā)明的聚陽離子化合物還可以與其他免疫物質(zhì) (inmmniser)相結(jié)合。對(duì)于所述的這種其他免疫物質(zhì)的優(yōu)選實(shí)例在專 利文獻(xiàn)WO 01/93905和WO 02/095027中有所公開(含I或含U的寡脫 氧核苷酸(1-或U-ODN);其中根據(jù)本發(fā)明，I-ODN還可以特別用作TLR 的配體或拮抗劑(參見下文))。優(yōu)選地，I-或U-ODN可以與根據(jù)專利 文獻(xiàn)WO 02/32451中所述的分子(特別是KLKLLLLLKLK)或聚精氛酸 結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明使用的HCV T細(xì)胞抗原應(yīng)為得自HCV蛋白的保守區(qū)域 的T細(xì)胞抗原。因此，優(yōu)選地使用衍生自HCV蛋白質(zhì)的保守多肽的表 位，已知該表位是患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的靶位。為了減少病毒逃脫的 情況，應(yīng)該優(yōu)選采用在最普遍的林系中保守的肽的庫。這保護(hù)了對(duì)HCV特異性的T細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)過程。所述肽與MHC分子結(jié)合，從而被T 細(xì)胞受體識(shí)別。由于HU-A2是白種人中最普通的MHC分子(在MHC 為I類的情況下)，因此僅選出了與這種HLA等位基因產(chǎn)物相互作用 的多肽。因此，對(duì)于在這種人群中應(yīng)該具有最佳效力的HCV疫苗而言， 根據(jù)本發(fā)明應(yīng)該將帶有對(duì)HLA型特異的T細(xì)胞表位的這種HCV疫苗接 種到對(duì)某種HLA型(例如HLA-A2 )呈陽性的個(gè)體中。本發(fā)明使用的HCV T細(xì)胞抗原的長度是不重要的。應(yīng)該考慮的是所需多肽的最佳的合成 方法、最佳的溶解性、每個(gè)多肽中T細(xì)胞表位的最佳的數(shù)目等。優(yōu)選 地，HCV T細(xì)胞表位以由7至50個(gè)氨基酸殘基、優(yōu)選為由8至45個(gè) 氨基酸殘基、特別是由8至20個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽形式提供，其 中每個(gè)多肽都包含至少1個(gè)T細(xì)胞表位。
根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選的HCV T細(xì)胞抗原可以選自作為有效的表 位而在專利文獻(xiàn)WO 01/24822、 WO 2004/024182、 WO 2005/004910和 /或PCT/EP2005/054773中公開的那些。優(yōu)選地，T細(xì)胞抗原選自
KFPGGG(2工VGGVYUuPRRGPRIjGVRATRK,
GYKVLVLNPSVAAT,
AYAAQG YKVLVIiN P SVAAT,
DLMGYIP(A/L)VGAPL,
GEVQWSTATQSFLATCINGVCWTV,
HMWNFISGIQYIAGIiSTIjPGNPA,
VDYPYR薩YPCT (V/I)N (F/Y) TIFK (V/I)證VGG麗RL,
AAWYEIiTPAETTVRLR,
GQGWRUjAPITAYSQQTRGKLGCIV,
I GLGKVIiVD工IAG YGAGVAGAIiVAFK,
FTDNSSPPAVPQT FQV,
LEDRDRSEI)SPLLLSTTEW,
YLVAYQATVCARAQAPPPSWD,
MSTNPKPQRKTKR訓(xùn)R,
L工訓(xùn)GSW畫RTALNCNDSIi,TTILGIGTVLDQAET,
FDS(S/V〉VLCECYDAG(A/C)AWYE,
ARL工VFP DLGVRVCEKMALY,
AFCSAMYVGDLCGSV,
GVIiFG3LAYFSMVGNW,
WCCSMS YTWTGAL工TPC,
TRVPYFVRAQGURA和
TTIiIjFNIILGGWVAAQ,.或者它們的片段，其中所述片段都包含至少7個(gè)、優(yōu)選為至少8 個(gè)、特別是至少9個(gè)氨基酸殘基，并且所述氨基酸殘基含有至少1個(gè) T細(xì)胞表位。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的HCV疫苗具有至少3個(gè)T細(xì)胞表 位，并且每個(gè)T細(xì)胞表位都得自不同的熱點(diǎn)表位，其中所述熱點(diǎn)表位 被定義為含有選自以下肽的表位AYAAQGYKVLVLNPSVAAT 、 GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA。此外， 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的HCV疫苗進(jìn)一步包含熱點(diǎn)表位 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK和DLMGYIP (A/L) VGAPL中的至少1 種的表位。優(yōu)選地，所述至少3個(gè)表位中的每個(gè)表位都選自以下三組
GYKVLVLNPSVAAT 、AYAAQGYKVL或AYAAQGYKVLVLNPSVAAT ， C工NGVCWTV 、 GEVQWSTATQSFLAT 或 GEVQWSTATQSFLATCINGVCWTV ; 和
HMWNFISGIQYIiAGLSTIiPGNPA,、 MWNFISGIQYIAGIjSTLPGN 、 NFISGIQYLAGIjST:LPGNPA、 QYLAGLSTL或HMWNF工SGI。此外，優(yōu)選的是進(jìn)一步包含選自以下的至 少1種表位KFPGGGQIVGGVYIjLPRRGPRIjGVRATRK、 KFPGGGQIVGGVY:L:LPRRGPRIi、 YLLPRRGPRL 、 LPRRGPRL, GPRLGVRAT 或 RLGVRATRK ; 或 者 DLMGY工PAV, GYIPLVGAPL或DLMGYIPLVGAPL 。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選HCV疫苗包含以下表位中的至少2個(gè)表位
KFPGGGQIVGGVY:LLPRRGPR:LGVRATRK, DLMGY工PAV, LEDRDRSEIjSPIiliSTTEW, DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV, GYKVIiVLNPSVAAT, C工NGVCWTV, AAWYELT-PAETWRIiR, YLVAYQATVCARAQAPPPSWD, TAYSQQTRGLLG, HMWNFISGIQY-LAGLSTLPGNPA, IGLGKVLVDILAGYGAGVAGAIiVAFK和 SMSYTWTGALITP,
優(yōu)選地，HCV疫苗包含至少4個(gè)、優(yōu)選為至少5個(gè)、至少6個(gè)、 至少8個(gè)上述表位，或者包含所有上述12個(gè)表位。
根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選的HCV疫苗包含以下表位中的至少2個(gè) 表位
KFPGGGQ工VGGVY;LIjPRRGPRIjGVRATRK, dypy薩hypctvnftifkv
AAWYELTPAETTVRLR, TAYSQQTRGLLG, ,NF工SG工QYIAG:LST:LPGNPA, IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSY窗GALITP。優(yōu)選地,這種HGV疫
苗包含至少4個(gè)、至少5個(gè)、特別是包含所有上述7個(gè)表位。
本發(fā)明的HCV疫苗優(yōu)選包含至少1個(gè)A2表位和至少1個(gè)DR1表位。 本發(fā)明的HCV疫苗優(yōu)選包含至少1個(gè)DR7表位。以下表位的組合被認(rèn)為是特別有效的(至少l組上文所述的表位
是得自(1)至(5)組中的至少3組中的表位)
(1) KFPGGGQIVGGVYIiiLPRRGPRLGVRATRK或 KFPGGGQIVGGVYI/LPRRGPRIi或 YLLPRRGPRLGVRATRK或YLLPRRGPRL或LPRRGPRL或,LPRRGPRLGVRATRK
成GPRLGVRATRK成RLGVRATRK ,成KFPGGYLLPRRGPRLGVRATRK,
(2) AYAAQGYKVIiVLNPSVAAT 或'AYAAQGYKV!L 或AAQGYKVIiVLNPSVAAT 或 KVLVLNPSVAAT 或 GYKVLVLNPSVAAT 或' AYAAQGYKVLVLNPSV 或' AYAAQGYKVLVLNPSVAA或AAQGYKVLVLNPSVA或 AYAAQGYKVLPSVAAT 或 AYAAQGYKVLAAT,
(3) DLMGYIP(A/L)VGAPL 或DLMGYIPALVGAPL 或'DLMGY工P(A/L)VG或 DLMGYIP(A/L)VGAP或DLMGYIP(A/L)V 或DLMGY工PLVGAPL或 DLMGY-IPLVGA或DLMGYIPLV,
(4) GEVQWSTATQSFLATCINGVCWTV 或 GEVQWSTATQSFLAT 或 C工NGVCWTV 或 VSTATQSFLMCINGVCWTV 或TQSETJVTCINGVCWTV 或GEVQWSTATQSFIAT-CING或GEVQWSTATQSFLAT,(5) HMWNFISGIQYIAGIiSTLPGNPA 或 MWNFISG工QYLAGLST!LPGNPA 或 HMWNF工SGI或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN 或 NFISG工QYLAGIiST!LPGN或 QY-LAGLSTL或 HMW諮SGIQYLAGIiSTIi 或HMWNFISGISTLPGNPA或 H,Y-LAGLSTLPG鵬或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN特別是，已經(jīng)證明含有表位
GYKVLVLNPSVAAT、DLMGYIPAV、CINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA 的HCV疫苗是特別有效的。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的每2周給藥的疫苗包含由多于單——種 抗原形成的混合物("庫")。優(yōu)選地，所述疫苗包含至少3種、優(yōu) 選至少4種、特別是至少5種不同的HCV T細(xì)胞抗原。在其他實(shí)施方 案中或者如果(例如)對(duì)較大范圍內(nèi)的人群進(jìn)行疫苗接種，則所述混 合物可以包含5至20個(gè)、優(yōu)選8至15個(gè)不同(即，具有不同的氨基 酸序列)的表位。
已經(jīng)證明，被提議用于注射的肽抗原的量在之前公開的劑量范圍 內(nèi)仍是有效的。因此，根據(jù)本發(fā)明的HCV疫苗的優(yōu)選劑量(即，合并 在一起的肽的總量)為每份給藥劑量中包含1至20mg、優(yōu)選3至10mg、 特別是4至6mg的HCV T細(xì)胞抗原。
如上所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)給藥途徑對(duì)于達(dá)到最佳的效力也是重要的。 已報(bào)道的T細(xì)胞疫苗的有效給藥途徑也適用于本發(fā)明。優(yōu)選地，每2 周對(duì)根據(jù)本發(fā)明的HCV疫苗進(jìn)行皮下給藥或皮內(nèi)給藥，特別是進(jìn)行皮內(nèi)給藥(在本說明書中，術(shù)語真皮內(nèi)(i.d.)和皮內(nèi)(i.C.)可互換使用)。
根據(jù)本發(fā)明的HCV疫苗可以進(jìn)一步包含免疫刺激化合物，以用于 進(jìn)一步刺激對(duì)HCV抗原的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的藥物制 劑中進(jìn)一步包含的免疫刺激化合物選自免疫刺激脫氧核苷酸、a 1 umn、 弗羅因德完全佐劑、弗羅因德不完全佐劑、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、神經(jīng)活 性物質(zhì)、特別是人類生長激素、或它們的組合。免疫刺激脫氧核苷酸 為(例如)天然或人工合成的含有CpG的DNA，由無脊推動(dòng)物衍生的 一小段伸長的DM，或是在某一堿基位置處含有非曱基化的胞嘧啶-鳥 噪呤二核苷酸(CpG)的短的寡核苷酸(ODN)形式及含有肌苷和/或尿 苷的0DN ( I-0DN、 U-0DN)形式，如專利文獻(xiàn)W0 01/93905和W0 02/095027所述。神經(jīng)活性物質(zhì)，例如與聚陽離子化合物結(jié)合的神經(jīng) 活性物質(zhì)在專利文獻(xiàn)WO 01/24822中有所描述。
在本發(fā)明的研究過程中，發(fā)現(xiàn)如果將根據(jù)本發(fā)明的HCV疫苗與免 疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(優(yōu)選與toll樣受體(TLR)7拮抗劑或配體、特別是與 toll樣受體(TLR)7拮抗劑)結(jié)合給藥，就可以獲得優(yōu)異的效果。免疫 應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(IRM)是一種選擇性地活化toll樣受體(TLR)的獨(dú)特的 合成分子，其中所述toll樣受體對(duì)于刺激先天的和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過 程是重要的。免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑具有范圍廣泛的、潛在且重要的應(yīng)用范 圍，包括增強(qiáng)對(duì)疫苗抗原的免疫應(yīng)答以及疾病特異性的單一療法。IRM 的獨(dú)特的TLR活化特征鐠(例如TLR3、 TLR7、 TLR8或TLR7和8、 TLR9 ) 使得可以選擇性地激活多種細(xì)胞因子，例如干擾素a(IFN)、白細(xì)胞 介素-12、 IFN-Y和腫瘤壞死因子a。由IRM誘導(dǎo)的一系列細(xì)胞因子增 強(qiáng)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過程，并使免疫過程發(fā)展成強(qiáng)化了它們作為疫苗 佐劑的能力的Thl應(yīng)答。IRM在(例如)專利文獻(xiàn)US 4， 689， 338、 US 5,238,944、 US 6,083,505、 US 2004/0076633、 WO 03/080114和W0 2005/025583中有所公開。
優(yōu)選地，HCV疫苗與1-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺 (咪喹莫特)結(jié)合給藥，優(yōu)選地，作為局部施用的制劑，特別是作 為骨狀物。這種含有咪喹莫特的骨狀物的實(shí)例為購自Aldara，的商品。
14AldaraTM是含有咪喹莫特的貪狀物的商品名。每克5%的骨狀物在 水包油狀雪花骨底料中含有50mg的咪喹莫特，其中所述底料由異硬脂 酸、十六醇、十八醇、白凡士林、聚山梨醇酯60、脫水山梨糖醇單硬 脂酸酯、甘油、黃原膠、純凈水、苯甲醇、羥苯甲酯和鞋苯丙酯構(gòu)成。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，將本發(fā)明的HCV疫苗以皮下或皮內(nèi) (特別是皮內(nèi))的方式進(jìn)行給藥，并且將咪喹莫特以骨狀物(優(yōu)選為 含量為5 (重量)％的骨狀物)的形式直接施用在注射位點(diǎn)上。咪者莫 特(AldaraTM)作為第一種市售的IRM分子被批準(zhǔn)用于治療病毒引起的 狀況、外部生殖器和肛周尖銳濕疣。其他適應(yīng)征包括光化性角化病和 基底細(xì)胞癌。IRM，特別是咪喹莫特，表現(xiàn)出活化朗格漢斯細(xì)胞并增強(qiáng) 它們向淋巴結(jié)遷移的能力。最近，咪喹莫特還被研制作為人類試驗(yàn)中 用于黑素瘤多肽疫苗的佐劑。
優(yōu)選地，為了增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的HCV疫苗的免疫原性，可以在每 次接種疫苗之后都將所述的骨狀物直接施用在注射位點(diǎn)(大約3x3 cm 二9cm"上，并且在至少8小時(shí)后，可以對(duì)注射位點(diǎn)進(jìn)行溫和的清洗。 所述的骨狀物還可以在注射之后的某一時(shí)間施用，例如在最初注射后 的4至24小時(shí)之后，優(yōu)選為6至18小時(shí)，特別是10至16小時(shí)。可 選擇地，所述骨狀物可以在接種疫苗之前施用，例如在接種疫苗之前 的24小時(shí)施用。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及至少1種HCV T細(xì)胞抗原和含有肽 鍵的聚陽離子化合物在制備HCV疫苗中的用途，其中所述HCV疫苗通 過每2周給藥、至少進(jìn)行3次來治療和預(yù)防HCV感染。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于治療和預(yù)防HCV感染的試劑盒，該 試劑盒含有如本文所定義的至少4個(gè)劑量的HCV疫苗以及用于每2周 給藥的給藥工具。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包含如本文所定義的免疫應(yīng) 答調(diào)節(jié)劑。
對(duì)根據(jù)本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行特別設(shè)計(jì)，以用于每2周給藥。因此， 優(yōu)選地本發(fā)明的試劑盒還包含用于幫助患者或負(fù)責(zé)進(jìn)行每2周給藥的醫(yī)務(wù)人員的裝置(工具)，例如用于進(jìn)行每2周給藥處理的給藥手冊(cè)、 用于進(jìn)行每2周給藥處理的日歷、具有每2周的鬧鐘功能的電子提醒 日歷、或它們的組合。
在以下的實(shí)施例和附圖
中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但是這些 描述不限定本發(fā)明。
圖l顯示，與皮下注射相比，在HLA-A的201轉(zhuǎn)基因小鼠中真皮內(nèi) 施用HCV疫苗誘導(dǎo)出更強(qiáng)的HCV肽特異性的T細(xì)胞應(yīng)答，該應(yīng)答可以 通過共同施用AldaraTM而進(jìn)一步增強(qiáng)(免疫刺激劑咪壹莫特)。
圖2和3顯示，在HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠中增加的注射次數(shù)增強(qiáng) 了 HCV肽的特異性免疫應(yīng)答，并且施用額外的免疫刺激劑產(chǎn)生更快且 更顯著的針對(duì)某種HCV特異性的MHC I類限制性表位的應(yīng)答(CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答)。
圖4示出對(duì)HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行間隔注射方法會(huì)對(duì)短期應(yīng) 答產(chǎn)生影響，并且共同施用其他的免疫刺激劑會(huì)誘導(dǎo)持續(xù)的針對(duì)某種 HCV特異性的MHC I類限制性表位的應(yīng)答。
圖5示出了根據(jù)實(shí)施例5至7的臨床研究方案。
圖6示出了對(duì)釆用最佳時(shí)間表的IC41疫苗產(chǎn)生的千擾素Y酶聯(lián)免 疫斑點(diǎn)應(yīng)答的時(shí)間過程圖。圖中示出了在5個(gè)處理組中應(yīng)答者的總酶 聯(lián)免疫斑點(diǎn)應(yīng)答(CD4和CD8 T細(xì)胞)(A)和CD8 T細(xì)胞應(yīng)答(B ) 的中位數(shù)(用于計(jì)算疫苗的總量以及I類斑點(diǎn)的總數(shù)，參見實(shí)施例5 至7) 。 (C)采用最佳的和老式的時(shí)間表的重要的CD8+ I類T細(xì)胞 應(yīng)答。圖中示出了在所有的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)I類應(yīng)答者中I類斑點(diǎn)的總 數(shù)的中位數(shù)。
實(shí)施例
實(shí)施例1:
施用位點(diǎn)對(duì)HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠中的HCV肽特異性T細(xì)胞應(yīng)答 的影響
小鼠HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠(HHD. 2) 疫苗臨床批號(hào)PD03127 (批號(hào)K)對(duì)每只小鼠使用的10(Vl體積的注射物包含
抗原Ipep 83 (KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL) 200pg， Ipep 84 (GYKVLVLNPSVAAT) 20(Vg， Ipep 87 (DLMGYIPAV) 200ng, Ipep 89 (CINGVCWTV) 200ng， Ipep 1426 (HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA) 200ng;
佐劑平均聚合度(使用多角度激光散射儀進(jìn)行測(cè)定(MALLS))為 40至50個(gè)精氨酸殘基的聚-L-精氨酸，批號(hào)113K7277, Sigma Aldrich 公司，楊pg;
其他佐劑含有5%咪喹莫特的Aldara , —種通過TLR7起作用 的免疫刺激劑，3M Health Care有限公司，劑量為大約20mg/只小
鼠；
配制緩沖劑5mM磷酸鹽/ 270mM山梨醇。 實(shí)驗(yàn)設(shè)定每組IO只小鼠
1. 皮下注射入側(cè)腹，
2. 真皮內(nèi)注射入背部，
3. 真皮內(nèi)注射入背部，然后在注射區(qū)域立即施用Aldara "*骨狀物。
在第0、 14和28天時(shí)，在如上所述的不同位置處，向小鼠注射總 量為lOOpl /只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列出的物質(zhì)。在 第35天時(shí)，取得各實(shí)驗(yàn)組中的小鼠的脾，并采用磁選分離技術(shù)(MACS) 富集CD4+T細(xì)胞。除去了 CD4+T細(xì)胞的脾細(xì)胞用于測(cè)定CD8+T細(xì)胞 的應(yīng)答。采用IFN-y酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法測(cè)定MHC II類限制性T細(xì) 胞(CD4+ T細(xì)胞)和MHC I類限制性T細(xì)胞(CD8+ T細(xì)胞)對(duì)各種單 一的HCV衍生肽的應(yīng)答情況?？傮w而言，用非相關(guān)肽進(jìn)行的再刺激不 能產(chǎn)生IFN-y 。
結(jié)果
如圖l所示，在進(jìn)行皮下注射之后，可以檢測(cè)到MHC I類限制性 CD8+ T細(xì)胞對(duì)Ipeps 84、 87和89做出的應(yīng)答，以及MHC II類限制 性CD4+ T細(xì)胞對(duì)Ipeps 84和1426 ^t出的應(yīng)答。這些應(yīng)答可以通過真 皮內(nèi)施用疫苗而進(jìn)一步增強(qiáng)。此外，在進(jìn)行真皮內(nèi)注射之后直接共同施用AldaraTM會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)所檢測(cè)到的應(yīng)答，特別是匪C I類限制性 CD8+ T細(xì)胞對(duì)Ipep 87做出的應(yīng)答。
總之，與皮下注射相比，真皮內(nèi)施用HCV疫苗會(huì)誘導(dǎo)出更強(qiáng)的HCV 肽特異性T細(xì)胞的應(yīng)答，這種應(yīng)答可通過共同施用AldaraTM而進(jìn)一步 增強(qiáng)。
實(shí)施例2:
在經(jīng)過1次、2次或3次注射之后，在HLA-A的201轉(zhuǎn)基因小鼠中
產(chǎn)生的HCV肽特異性MHC 1類限制性008+ T細(xì)胞的應(yīng)答情況 小鼠HLA-A"201轉(zhuǎn)基因小鼠(HHD. 2) 疫苗對(duì)每只小鼠使用的10(^1體積的注射物包含 抗原Ipep 83 200pg, Ipep 84 200|iig， Ipep 87 200pg, Ipep 89
200|ag， Ipep 1426 200pg;
佐劑平均聚合度(使用MALLS進(jìn)行測(cè)定)為40至50個(gè)精氨酸
殘基的聚-L-精氨酸，批號(hào)113K7277， Sigma Aldrich公司，400jug; 其他佐劑含有5%咪喻莫特的Aldara TM， 一種通過TLR7起作用
的免疫刺激劑，3M Health Care有限公司，劑量為大約20mg/只小
鼠；
配制緩沖劑5mM磷酸鹽/ 270mM山梨醇。 實(shí)驗(yàn)設(shè)定每組30只小鼠(10只/分析的時(shí)間點(diǎn))
1. 真皮內(nèi)注射入背部，
2. 真皮內(nèi)注射入背部，然后在注射區(qū)域立即施用Aldara 骨狀物。
在第0、 14和28天時(shí)，以真皮內(nèi)注射的方式向小鼠注射總量為 100^1 /只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列出的物質(zhì)。在第7、 21和35天時(shí)，取得各實(shí)驗(yàn)組中的小鼠的脾，并采用磁選分離技術(shù) (MACS)除去CD4+T細(xì)胞。釆用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法測(cè)定在使用單一 的HCV衍生肽進(jìn)行再刺激后由MHC I類限制性CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-
y?？傮w而言，用非相關(guān)肽進(jìn)行的再刺激不能產(chǎn)生IFN-y。
此外，進(jìn)行體內(nèi)CTL檢測(cè)，以測(cè)定在進(jìn)行單--次注射之后或在進(jìn)行強(qiáng)化注射之后MHC I類限制性CD8+ T細(xì)胞的效應(yīng)物功能。簡言之， 由首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠制備的抗原呈遞細(xì)胞(APC)或者載有Ipep 87 并用CFSE^示記，或者(為了進(jìn)行對(duì)照)栽有Ipepl247 (非相關(guān)肽) 并用CFSE申標(biāo)記，或者未載有肽，其用CFSE"標(biāo)記。將這些APC混合 在一起(1: 1: 1)，并在第6、 20或34天時(shí)通過靜脈注射將其適當(dāng)?shù)?轉(zhuǎn)移到接種了疫苗的小鼠體內(nèi)。 一天后(即，第7、 21或35天)，進(jìn) 行FACS分析，以測(cè)定經(jīng)轉(zhuǎn)移的載有相關(guān)肽的APC是否存在(如果所述 APC不存在，則表示發(fā)生了由疫苗誘導(dǎo)的殺死行為)。在任何實(shí)驗(yàn)中 都不能觀察到未負(fù)載的APC的殺死行為。 結(jié)果
如圖2中上部的圖所示，在經(jīng)過單--次真皮內(nèi)注射或強(qiáng)化的真
皮內(nèi)注射之后，可以檢測(cè)到由MHC I類限制性CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生的HCV 肽特異性IFN-y ，其差別在于對(duì)于某些肽的應(yīng)答強(qiáng)度不同。
詳細(xì)而言，在經(jīng)過單--次真皮內(nèi)注射之后，只檢測(cè)到對(duì)Ipep89
的應(yīng)答，而在經(jīng)過2次注射后，以相當(dāng)?shù)膹?qiáng)度誘導(dǎo)出對(duì)Ipep84、 87 和89的應(yīng)答。這種應(yīng)答可通過第3次注射而進(jìn)一步增強(qiáng)，其中清楚地 示出對(duì)Ipep87的應(yīng)答要優(yōu)于對(duì)Ipep89和84的應(yīng)答。
與此形成對(duì)比的是，通過共同施用AldaraTM在單--次注射后已
經(jīng)誘導(dǎo)出對(duì)所有3種肽的應(yīng)答。在第2次施用之后，已經(jīng)可以看出占 有優(yōu)勢(shì)的對(duì)Ipep87的應(yīng)答。第3次施用進(jìn)一步增強(qiáng)了 Ipep87特異性 應(yīng)答的強(qiáng)度。
如圖2中下部的圖所示，需要進(jìn)行2次注射來誘導(dǎo)MHC I類限制 性CD8+ T細(xì)胞的Ipep87特異性效應(yīng)物的功能。此外，在共同施用 AldaraTM之后，效應(yīng)物的功能顯著且強(qiáng)烈地增強(qiáng)。
總之，結(jié)果顯示，注射次數(shù)的增加會(huì)增強(qiáng)HCV特異性的免疫應(yīng)答。 此外，其他免疫刺激劑(AldaraTM)的施用會(huì)產(chǎn)生更快且更明顯的針對(duì) 某些MHC 1類限制性008+ T細(xì)胞表位的應(yīng)答。
實(shí)施例3:
在經(jīng)過3次或6次注射之后，在HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的HCV肽特異性MHC I類限制性CD8+ T細(xì)胞的應(yīng)答情況
小鼠HLA-A"201轉(zhuǎn)基因小鼠(HHD. 2)
疫苗臨床批號(hào)PD03127 (批號(hào)K)
對(duì)每只小鼠使用的100]Lil體積的注射物包含
抗原Ipep 83 200pg, Ipep 84 200pg， Ipep 87 200pg， Ipep 89 200jug， Ipep 1426 200jng;
佐劑平均聚合度(使用MALLS進(jìn)行測(cè)定)為40至50個(gè)精氨酸 殘基的聚-L-精氨酸，批號(hào)113K7277， Sigma Aldrich公司，400^ig;
其他佐劑含有5°/。咪喹莫特的Aldara TM， 一種通過TLR7起作用 的免疫刺激劑，3M Health Care有限公司，劑量為大約20mg/只小 鼠；
配制緩沖劑5mM磷酸鹽/ 270mM山梨醇。 實(shí)驗(yàn)設(shè)定每組20只小鼠(10只/分析的時(shí)間點(diǎn))
1. 皮下注射入側(cè)腹，
2. 真皮內(nèi)注射入背部，
3. 真皮內(nèi)注射入背部，然后在注射區(qū)域立即施用Aldara頂骨狀物。
在第0、 14、 28、 43、 58和71天時(shí)，在如上所述的不同位置處， 向小鼠注射總量為100nl /只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列 出的物質(zhì)。在第35或78天時(shí)，取得各實(shí)驗(yàn)組中的小鼠的脾，并采用 磁選分離技術(shù)(MACS )除去CD4+ T細(xì)胞。采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法測(cè) 定在使用單一的HCV衍生肽進(jìn)行再刺激后由MHC I類限制性CD8+ T 細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-y?？傮w而言，用非相關(guān)肽進(jìn)行的再刺激不能產(chǎn)生 IFN-y 。
結(jié)果
圖3示出了在經(jīng)過6次及3次注射之后由所得的MHC I類限制性 CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-y 。特別針對(duì)Ipep87產(chǎn)生的應(yīng)答可通過進(jìn)行 額外的疫苗接種而得到增強(qiáng)，并且與施用位點(diǎn)無關(guān)。最強(qiáng)烈的應(yīng)答總 是在共同施用疫苗和Aldara 之后觀察到。
20總之，數(shù)據(jù)表明，注射次數(shù)的增加會(huì)增強(qiáng)HCV特異性的免疫應(yīng)答。 此外，其他免疫刺激劑(Aldara )的施用會(huì)產(chǎn)生更明顯的針對(duì)某些 MHC I類限制性CD8+ T細(xì)胞表位的應(yīng)答。
實(shí)施例4:
基于不同的注射時(shí)間間隔，在經(jīng)過3次注射之后，在HLA-A的201
轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的短期及長期的HCV肽特異性MHC I類限制性008+
T細(xì)胞的應(yīng)答情況
小鼠HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠(HHD. 2 )
疫苗對(duì)每只小鼠使用的lOOnl體積的注射物包含
抗原Ipep 83 200jig， Ipep 84 20(Vg, Ipep 87 200jig， Ipep 89
20(Vg, Ipep 1426 2(%g;
佐劑平均聚合度(使用MALLS進(jìn)行測(cè)定)為40至50個(gè)精氨酸
殘基的聚-L-精氨酸，批號(hào)114K7276， Sigma Aldrich公司，400pg; 其他佐劑含有5V米喹莫特的Aldara ， 一種通過TLR7起作用
的免疫刺激劑，3M Health Care有限公司，劑量為大約20mg/只小
鼠；
配制緩沖劑5mM磷酸鹽/ 270mM山梨醇。 實(shí)驗(yàn)設(shè)定每組20只小鼠(10只/分析的時(shí)間點(diǎn))
1. 皮下注射入側(cè)腹，
2. 真皮內(nèi)注射入背部，
3. 真皮內(nèi)注射入背部，然后在注射區(qū)域立即施用Aldara 7"骨狀物。
基于1周、2周或4周的時(shí)間間隔，在如上所述的不同位置處， 向小鼠注射總量為10(^1 /只小鼠的疫苗3次，其中所述疫苗含有上 文列出的物質(zhì)。在第3次注射后的第7天和第IIO天時(shí)，取得各實(shí)驗(yàn) 組中的小鼠的脾，并采用磁選分離技術(shù)(MACS)除去CD4+T細(xì)胞，采 用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法測(cè)定在使用單一的HCV衍生肽進(jìn)行再刺激后由 MHC I類限制性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-y ?？傮w而言，用非相關(guān)肽進(jìn)
行的再刺激不能產(chǎn)生IFN-y。結(jié)果
如圖4中上部的圖所示，可以觀察到，在各個(gè)施用位置處，與注 射時(shí)間間隔為l周或4周的情況相比，在注射時(shí)間間隔為2周的情況 下，在經(jīng)過皮下注射或真皮內(nèi)注射之后所產(chǎn)生的匪C 1類限制性008+ T細(xì)胞的應(yīng)答要稍微強(qiáng)一些。在共同施用疫苗和AldaraTM之后，沒有 觀察到由于注射時(shí)間間隔的影響所導(dǎo)致的顯著差別。
圖4中下部的圖示出了不同的注射時(shí)間間隔沒有對(duì)HCV肽特異性 腦c i類限制性008+T細(xì)胞的應(yīng)答的持續(xù)性產(chǎn)生影響。但是，圖中數(shù) 據(jù)清楚地表明，與真皮內(nèi)或皮下單獨(dú)注射疫苗的情況相比，在共同施 用AldaraTM之后，能夠更優(yōu)異地誘導(dǎo)出對(duì)Ipep 87和Ipep 89特異性 的MHC I類限制性CD8+ T細(xì)胞的應(yīng)答。
總之，數(shù)據(jù)表明，注射的時(shí)間間隔會(huì)對(duì)短期應(yīng)答產(chǎn)生影響，并且 共同施用其他的免疫刺激劑(AldaraTM)會(huì)誘導(dǎo)出極為穩(wěn)定的針對(duì)某些 HCV特異性MHC I類限制性表位的應(yīng)答。
實(shí)施例5至7:
臨床試驗(yàn)
臨床試驗(yàn)是用HCV T細(xì)胞抗原庫進(jìn)行的(其中所述疫苗被命名為 "IC41",并且是由代表了 HCV的保守T細(xì)胞表位的合成肽與作為合 成的T細(xì)胞佐劑的聚-L-精氨酸形成的混合物構(gòu)成的；IC41包含得自 HCV多肽的不同區(qū)域的5個(gè)肽，i.a.以下3個(gè)表位 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、 CINGVCWTV和DLMGYIPAV)。因此，IC41 含有5個(gè)主要衍生自非結(jié)構(gòu)區(qū)域NS3和NS4的合成肽，已知，NS3和 NS4是患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的靶物。它們含有至少4個(gè)HLA-A的201限 制性CTL表位和3個(gè)高度混雜的CD4+輔助性T細(xì)胞表位，并且已經(jīng)顯 示，在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療產(chǎn)生應(yīng)答或由HCV發(fā)生自發(fā)康復(fù)的患者中，所述的 所有這些表位都是被靶向的。在基因型1中，有l(wèi)個(gè)例外的多肽的序 列是高度保守的。IC41含有聚-L-精氨酸作為合成佐劑，在動(dòng)物研究 中，聚-L-精氨酸已經(jīng)顯示能夠增強(qiáng)Thl/Tcl (IFN-y )的應(yīng)答。I(Ml 的臨床數(shù)據(jù)表明，施用所述疫苗是安全的并且耐受性良好，并且在健康志愿者以及慢性HCV患者中，IC41能夠誘導(dǎo)HCV特異性的Thl/Tcl 應(yīng)答。
采用如上所述的有效的T細(xì)胞檢測(cè)法來讀取疫苗的免疫原性(y 干擾素酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法、T細(xì)胞增殖檢測(cè)法、HLA四聚體/FACS檢 測(cè)法)。這些檢測(cè)法允許對(duì)由治療性HCV疫苗IC41所誘導(dǎo)的表位特異 性T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行可靠的測(cè)定。所述疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答起到 了效力的替代參數(shù)的作用。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法可以對(duì)諸如人類血液 之類的生物樣品中的肽特異性功能性(即，分泌細(xì)胞因子的)T細(xì)胞 進(jìn)行定量。所述檢測(cè)的基礎(chǔ)在于T細(xì)胞在受到由T細(xì)胞受體特異性 識(shí)別的肽的刺激之后，會(huì)分泌諸如IFN-Y之類的細(xì)胞因子。該反應(yīng)可 以在96孔板上進(jìn)行。在此類板的過濾器孔中涂敷對(duì)IFN-Y特異性的 Mab。結(jié)果，每個(gè)分泌IFN-y的細(xì)胞都會(huì)留下IFN-y斑點(diǎn)，該斑點(diǎn)可 以通過隨后進(jìn)行的顯色反應(yīng)而顯現(xiàn)出來。這些斑點(diǎn)可以使用自動(dòng)化的 多孔板讀取器計(jì)數(shù)。所得的數(shù)目為樣品中肽特異性的、分泌IFN-y的 T細(xì)胞的個(gè)數(shù)的量度。分別對(duì)IC41中的5個(gè)肽的每一個(gè)肽進(jìn)行酶聯(lián)免 疫斑點(diǎn)檢測(cè)，此外，分別對(duì)較長的肽中所包含的3個(gè)HLA-A2表位進(jìn)行 測(cè)定。
在臨床實(shí)驗(yàn)IC41-102 (健康志愿者)、IC"-201 (慢性非應(yīng)答患 者，PCT/EP2005/054773 )和IC41-103 (疫苗應(yīng)用達(dá)到最佳的健康志 愿者)中，對(duì)每個(gè)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)板都采用外標(biāo)物，這樣可以對(duì)由 這些臨床實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行直接的比較(對(duì)IC41-102、 IC41-201 和IC41-103進(jìn)行的臨床研究的設(shè)計(jì)如圖6所示)。
實(shí)施例5:
得到改善的應(yīng)答者的應(yīng)答速率
如果在接種疫苗過程中或在接種疫苗之后的任何時(shí)間點(diǎn)，所測(cè)定 的任何肽都比基線值高至少3倍，或者如果基線值為0，而所測(cè)定的 任何肽至少明顯呈陽性，則對(duì)該應(yīng)答評(píng)分。
與采用每4周進(jìn)行接種、進(jìn)行4次的時(shí)間表的IC41-102中的情況
相比，IC41-103中所有組都顯示改善的應(yīng)答速率。在采用最頻繁(每周1次)的時(shí)間表的第3組中，得到了 CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的最高的應(yīng)答 速率。 一種可能的解釋為至少部分CD4+ T輔助性細(xì)胞不依賴于通過強(qiáng) 烈且頻繁的疫苗刺激而活化的CD8+ T細(xì)胞。
表1:與IC41-102的第K組相比，在IC41-103研究的第1-5組 中的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的應(yīng)答者速率
(NRE:在酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)中的非應(yīng)答者；REIV: CD8+ T細(xì)胞 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)應(yīng)答者；REV: CD4+T細(xì)胞應(yīng)答者)
組別 所分析的N值
NRE
1
3
4
102-K
8
7
8
9 9
12
CD8+ (REIV)
7
5
8 7
6 5
CD4+ (REV) 8
5
7
8
6
。細(xì)
88% 71% 簡 78% 67% 42%
%CD4
100%
71%
63%
78%
89%
50%
實(shí)施例6:
疫苗的總量與增多的I類酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的總數(shù)
為了定量地評(píng)估由IC41疫苗接種引起的IFN-Y T細(xì)胞應(yīng)答情況， 對(duì)每個(gè)肽測(cè)定酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的應(yīng)答的時(shí)程通過增加酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)來 計(jì)算疫苗的總量，其中所述酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)是在背景被減掉(即，減去 非相關(guān)的HIV肽)之后針對(duì)IC41的5個(gè)肽中的每個(gè)肽分別測(cè)定的酶聯(lián) 免疫斑點(diǎn)。通過增加斑點(diǎn)來計(jì)算I類酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的總數(shù)，其中所述 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)是在背景被減掉(即，減去非相關(guān)的HIV肽)之后針對(duì) IC41的5個(gè)HLA-A2表位中的每個(gè)表位分別測(cè)定的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)。測(cè) 定出疫苗的最大總量以及I類斑點(diǎn)的最大總數(shù)(通常，在最后接種疫 苗后記錄這2個(gè)值)，并測(cè)定出每組中所有應(yīng)答者的中位數(shù)(參見表 2)。
24表2:通過IC41得到的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的總數(shù)。為了測(cè)定疫苗的總 量和I類斑點(diǎn)的總數(shù)，參見下表，n表示為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)應(yīng)答者的數(shù)
IC41治療在所有酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)應(yīng)答者 中，疫苗總量的中位數(shù)(每l 百萬個(gè)PBMC中的斑點(diǎn)數(shù))在所有I類酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)應(yīng) 答者中，I類(CD8+ T細(xì)胞) 斑點(diǎn)的總數(shù)的中位數(shù)(每1 百萬個(gè)PBMC中的斑點(diǎn)數(shù))
所有的IC41-102和35-40 (n=37 )20 (n=23)
201的ve醒組
第1組(n=8 )100 (n-8)45 (n=7)
第2組(n=7 )60 (n=5)50 (n=5)
笫3組(n=8 )45 (n=8)35 ( n=8)
第4組(n=9 )90 (n=8 )60 (n=7)
第5組(n-9 )95 (n=8)105 (n=6)
在IC41-201中，在多個(gè)患者中觀察到I型(分泌IFN-y ) CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答與HCV的RNA減少相關(guān)可利用的數(shù)據(jù)表明，為了使HCV的 RNA快速減少1個(gè)loglO以上，需要每l百萬個(gè)PBMC至少50個(gè)的CD8+ T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的閾值水平。因此，最佳研究結(jié)果的一個(gè)目標(biāo)是
在至少一部分疫苗中取得所述水平的免疫原性。
如表2所示，在IC41-103的第1、 2和4組中，在酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)
的I類應(yīng)答者中，I類斑點(diǎn)的總數(shù)的中位數(shù)達(dá)到了所述的閾值，而第3 組和采用老式的每4周進(jìn)行接種，進(jìn)行4次(IC41-102)或6次 (IC41-201)時(shí)間表的所有應(yīng)答者沒有達(dá)到所述的閾值。清楚地是， IC41-103的第5組是最佳的，其取得了為所需閾值的2倍以上的免疫 斑點(diǎn)數(shù)。
第1至5組中所述疫苗總量的中位數(shù)和I類斑點(diǎn)總量的中位數(shù)的 時(shí)程如圖6A和B所示。重要的CD8+ I類T細(xì)胞應(yīng)答急劇增加的情況 與老式的每4周進(jìn)行接種，進(jìn)行4次(IC41-102 )或6次(IC41-201 ) 的時(shí)間表中所產(chǎn)生的情況的比較如圖6C所示。
實(shí)施例7:
經(jīng)改善的重要的I類(CD8+) T細(xì)胞的應(yīng)答范圍為了防止諸如表位發(fā)生突變而逃脫的逃脫機(jī)制，另一個(gè)目標(biāo)是取
得廣泛的應(yīng)答，即，在相同的時(shí)間且在同一個(gè)體中，T細(xì)胞同時(shí)對(duì)1 種以上的I類表位產(chǎn)生應(yīng)答。在之前結(jié)束的、采用了老式的每4周進(jìn) 行接種進(jìn)行4次(IC41-102)或6次(IC41-201)的時(shí)間表的2個(gè)研 究中，最多由l種主要的CD8+ T細(xì)胞表位誘導(dǎo)應(yīng)答。
為了對(duì)比I類應(yīng)答的范圍，在每組中的所有酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)I類應(yīng) 答者中，測(cè)定增強(qiáng)了某一受試對(duì)象中的應(yīng)答的CD8+T細(xì)胞表位的數(shù)目 的中位數(shù)(參見表3)。
如表3所示，在IC41-103的第1、 3和4組中，增強(qiáng)了某一受試 對(duì)象中的應(yīng)答的CD8+ T細(xì)胞表位的數(shù)目的中位數(shù)可以為2倍。此外， IC41-103的第5組是最佳的，其取得了在某一受試對(duì)象中同時(shí)靶向3 (中位數(shù))個(gè)(得自5個(gè)可行的CD8+ T細(xì)胞表位)CD8+ T細(xì)胞表位。
表3:重要的I類(CD8+)T細(xì)胞的應(yīng)答范圍?？倲?shù)N表示接受治 療的受試對(duì)象/患者的數(shù)量，n表示為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)I類應(yīng)答者的數(shù)量。
IC41治療總數(shù)N在某一受試對(duì)象中的CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞表 位的數(shù)量的中位數(shù)
所 有 的1201 (n=23)
IC41-102 和
201的ve頭組
第1組82 (n=7 )
第2組71 U=5 )
第3組82 (n=8 )
第4組92 (n=7 )
笫5組93 ( n-6 )
這些臨床和臨床前的結(jié)果表明，在干擾素Y酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)應(yīng)答的 強(qiáng)度和范圍方面(參見表2和3)，確定IC41的最佳應(yīng)用為第5組， 其注射時(shí)間間隔為最優(yōu)選的2個(gè)星期。注射時(shí)間間隔為l個(gè)星期的情 況要比注射時(shí)間間隔為2個(gè)星期的情況差一些，注射時(shí)間間隔為4個(gè) 星期的情況明顯更差。皮內(nèi)(真皮內(nèi))治療比皮下治療(在第1組(s.c.) 和第4組(i.d.)之間沒有差別)稍微優(yōu)異一些，但是最好的效果為第 5組。局部施用AldaraTV咪喹莫特( 一種toll樣受體7拮抗劑)使得 臨床效果得以改善。第3組(時(shí)間間隔為1個(gè)星期，s. c.)顯示出，產(chǎn)生100%的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答，但是僅為63%的CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答(參見表1所示的應(yīng)答 者速率)。這可解釋為CD4+T細(xì)胞不依賴于通過頻繁(每星期1次) 施用而產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞活化。通過第l組(s.c.)和第4組(i.d.)的 對(duì)比表明，關(guān)于施用途徑?jīng)]有明顯的差別。此外，還顯示出，絕對(duì)的 注射次數(shù)似乎不能增強(qiáng)強(qiáng)度(表2:第2組和第3組進(jìn)行了 16次疫苗 接種而其他各組進(jìn)行了 8次疫苗接種；圖5的上部在第8周(相當(dāng)于 在進(jìn)行4次疫苗接種后或第2組和第3組中的8次疫苗接種后)時(shí)情況 已經(jīng)穩(wěn)定)。最后，CD8+應(yīng)答的范圍-在第5組中達(dá)到最佳的、在單個(gè) 受試對(duì)象/患者中對(duì)多種I類表位(需要對(duì)在較長序列內(nèi)含有最少的I 類表位的"熱點(diǎn)，，肽(W0 2004/024182)進(jìn)行處理)同時(shí)產(chǎn)生應(yīng)答的情況。
權(quán)利要求
1. 用于預(yù)防或治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其中每2周對(duì)人類個(gè)體進(jìn)行HCV疫苗給藥，至少3次，所述HCV疫苗包含-有效量的至少一種HCV T細(xì)胞抗原，以及-含有肽鍵的聚陽離子化合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每2周進(jìn)行HCV疫苗給藥， 至少4次，優(yōu)選至少6次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每2周進(jìn)行HCV疫苗給藥， 至少8次。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的含 有肽鍵的聚陽離子化合物選自堿性多肽、有機(jī)聚陽離子化合物、堿性 聚氨基酸和它們的混合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所迷的含 有肽鍵的聚陽離子化合物包含鏈長為至少4個(gè)氨基酸殘基的肽鏈。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的含 有肽鍵的聚陽離子化合物選自在多于8個(gè)、特別是多于20個(gè)的氨基 酸殘基中含有多于20%、特別是多于50%的堿性氨基酸的多肽，特別是 聚精氨酸或聚賴氨酸，聚陽離子型抗微生物肽，含有至少2個(gè)由具有 3至7個(gè)疏水性氨基酸的連接體隔開的KLK基序的肽，或它們的混合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的含 有肽鍵的聚陽離子化合物含有20至500個(gè)氨基酸殘基，特別是含有30至2Q0個(gè)氨基酸殘基。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的 HCV T細(xì)胞抗原為由7至50個(gè)氨基酸殘基、優(yōu)選為8至45個(gè)氨基酸 殘基、特別是8至20個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽，其中每個(gè)所述肽都包 含至少1個(gè)T細(xì)胞表位。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的 HCV T細(xì)胞抗原選自以下的一個(gè)或多個(gè)KFPGGGGIVGGVYLIiPRRGPRIiGVRATRK, GY跳VIiNPSVAAT,ayaaqgykviivlnpsvaat,dlmgyip(a/l)vgapl,gevqwstatqsflatc工ngvcwtv,hmwnfisg工qy:laglstijPgnpa,vdypyrlwhypct (v/i) n (f/y) tifk (v/工)麗vggvehrl,aawyelt paettvrlr,gqgwrklapitaysqqtrgklgciv,iglgkvlvdi lagygagvagaiivafk,ft dn s s p pavpqt fqv,ledrdrselsplllsttew,ylvayqatvcaraqap p p swd,mstnpkpgrktkrntnr,lintngswh工nrtalncnds:l,TT工LGIGTVIjDQAET,fds(s/v)vlcecydag(a/c)awye,arlivfpdlgvrvcekmaly,AFCSAMYVGDIiCGSV,GVLFGIiAYFSMVGNW,wccsmsytwtgalitpc,TRVPYFVRAQGLIRA和TTIiliFNILGGWVAAQ'.或者它們的片段，其中所述片段包含至少7個(gè)、優(yōu)選為至少8個(gè)、 特別是至少9個(gè)氨基酸殘基，并且所述氨基酸殘基含有至少1個(gè)T細(xì) 胞表位。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的 HCV疫苗包含由至少3種、優(yōu)選為至少4種、特別是至少5種不同的 HCV T細(xì)胞抗原構(gòu)成的混合物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的 HCV疫苗在每份給藥劑量中包含1至20mg、優(yōu)選為3至10mg、特別是 4至6mg的HCV T細(xì)胞抗原。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的 HCV疫苗通過皮下或皮內(nèi)進(jìn)行給藥，特別是通過皮內(nèi)進(jìn)行給藥。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的 riU疫苗與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、優(yōu)選與toll樣受體(TLR)拮抗劑、特別 是與toll樣受體(TLR)7拮抗劑、特別與TLR7和8拮抗劑或與TLR9 拮抗劑相結(jié)合進(jìn)行給藥。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13的任意一項(xiàng)中所述的方法，其中所述的 HCV疫苗與1- (2-曱基丙基)-lH-咪唑并[4， 5-c]喹啉-4-胺(咪喹莫特) 相結(jié)合進(jìn)行給藥，優(yōu)選地，作為局部施用的制劑，特別為骨狀物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的HCV疫苗通過皮下 或皮內(nèi)進(jìn)行給藥，優(yōu)選地通過皮內(nèi)進(jìn)行給藥，并且將咪喹莫特以骨狀 物的形式、優(yōu)選為以含量為5重量％的骨狀物的形式直接施用在注射位 點(diǎn)上，優(yōu)選地在進(jìn)行了 HCV疫苗給藥之后的4至24小時(shí)之后、特別是 10至16小時(shí)之后。
16. 至少1種HCV T細(xì)胞抗原和含有肽鍵的聚陽離子化合物在制 備HCV疫苗中的用途，其中所述HCV疫苗通過至少4次的每2周給藥 來治療和預(yù)防HCV感染。
17. 用于治療和預(yù)防HCV感染的試劑盒，所述試劑盒含有如權(quán)利 要求1至15的任意一項(xiàng)中所定義的至少4個(gè)劑量的HCV疫苗以及用于 每2周給藥的給藥工具。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含如權(quán)利要求 13至15的任意一項(xiàng)中所定義的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的試劑盒，其中所述的用于每2 周給藥的給藥工具選自用于每2周給藥的給藥手冊(cè)、用于每2周給 藥的日歷、具有每2周的鬧鐘功能的電子提醒日歷、或它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其中每2周對(duì)人類個(gè)體進(jìn)行HCV疫苗給藥，至少3次，所述HCV疫苗包含有效量的至少一種HCV T細(xì)胞抗原，以及含有肽鍵的聚陽離子化合物。
文檔編號(hào)A61P31/14GK101426514SQ200680054377
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2006年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月25日
發(fā)明者A·佛米卡, A·范格貝恩, C·克雷德, E·陶貝爾, K·靈瑙, K·科恩, M·津孜勒爾, W·扎內(nèi)爾 申請(qǐng)人:英特塞爾股份公司