專利名稱：胰島素b鏈基因疫苗制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗自身免疫性糖尿病的保護性新型疫苗，本發(fā)明特別涉及新的用于預防自身免疫性糖尿病發(fā)病的基因疫苗，該疫苗能提供抗自身免疫性糖尿病的保護作用。
目前糖尿病已成為嚴重危害人民身體健康的三大疾病之一，自身免疫性糖尿病占總發(fā)病率的10～15％，研究表明自身免疫性糖尿病為細胞免疫介導的，具有MHC限制性的。胰島B細胞被特異性破壞的器官特異性疾病，其發(fā)病早，而且目前所有治療措施均不能阻止其并發(fā)癥的發(fā)生。
現在，臨床上所應用于治療自身免疫性糖尿病的藥物是胰島素，該藥的應用明顯延長了自身免疫性糖尿病患者的生命，但不能阻止其并發(fā)癥的發(fā)生。因此，預防自身免疫性糖尿病的發(fā)生、防止其并發(fā)癥的出現是一個具有普遍性的難題。
有很多資料報道了應用免疫抑制劑預防自身免疫性糖尿病的發(fā)生，目前己逐步應用了如強的松、環(huán)孢霉素A、Rapamycin、FK506等進行了研究。應用于臨床并取得了一定療效的藥物是環(huán)孢霉素A，但由于其可引起腎、肝損害，內分泌系統(tǒng)紊亂等原因，限制其長期、有效的使用。
另外也有報道應用免疫調節(jié)劑糾正自身免疫性糖尿病免疫功能紊亂常用的有白細胞介素4、白細胞介素1、CD3單克隆抗體、CD4單克隆抗體，以及自身抗原、谷氨酸脫羧酶和胰島素等。一些研究顯示口服胰島素可以有效地防止NOD小鼠發(fā)生糖尿病，這種免疫治療作用是通過CD4+T淋巴細胞以及抗免疫型細胞因子，諸如白細胞介素4、白細胞介素10等發(fā)揮作用的。Bellman等實驗顯示自身免疫性糖尿病口服胰島素的治療機制是使胰島B細胞周圍浸潤的單個核細胞由CD4+Th1淋巴細胞轉變?yōu)門h2淋巴細胞。但是口服抗原后，由于消化道的消化作用以及粘膜免疫等作用，使其產生的免疫反應較弱，所需劑量過大，其在臨床的應用價值有待進一步的探討。
本發(fā)明的目的在于提供一種胰島素B鏈基因疫苗制劑，該制劑能有效地預防大部分自身免疫性糖尿病的發(fā)生。
為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案在于采用了一種胰島素B鏈基因疫苗制劑，該制劑含有胰島素B鏈基因、質粒DNA。
本發(fā)明的制劑為可以直接作為基因疫苗的特別優(yōu)選的重組DNA質粒以及編碼胰島素B鏈片段的基因。
胰島素基因是研究工作者們認識較早的一個功能基因，在本實施例中應用胰島素基因的序列信息設計寡核苷酸引物，用于從機體中用聚合酶鏈反應(PCR)擴增該基因，新設計的引物兩端含有HindⅢ和EcoRⅠ兩個限制性內切酶識別弱點，使擴增的質?？梢酝ㄟ^相出的限制性內切酶切后直接克隆到一個質粒載體上，此兩種限制性內切酶僅作為舉例，而不能視為排除其它限制性內切酶。
在本發(fā)明中所使用的優(yōu)選DNA構建物優(yōu)點在于允許該構建物在微生物中進行繁殖，如大腸桿菌，通過這種方法構建成功的DNA構建物可進行大量結構相同的繁殖。
當新克隆出的胰島素B鏈基因以直接方式插入質粒DNA而直接整合出一個完整的表達基因，即在機體內表達出胰島素B鏈，這種肽段可以通過機體的抗原遞呈細胞在體內發(fā)揮作用。
本發(fā)明特別有利之處在于，以非常低劑量的抗原，該疫苗組合物也能誘導機體出現有效的免疫保護作用。
該新型免疫可以根據動物個體、種屬、免疫特征的不同而不同，但是在對下面實施例中的小鼠動物模型進行免疫接種時，我們發(fā)現，應用該新型疫苗劑量20～100μg時，按免疫程序能有效地提供保護作用。
本發(fā)明所提供的新型疫苗為非口服載劑，可用微滴或其它微束體形式進行接種，它們可以有效地將免疫反應物運送到細胞，從而引發(fā)免疫耐受反應，并可以有效地降低或抑制免疫反應以及氧自由基對胰島B細胞的破壞作用。
以下具體說明本發(fā)明的實質內容及其優(yōu)點。
一、胰島素B鏈基因疫苗的制備材料與方法用于培養(yǎng)的材料來自Gibco、Sigma公司。DNA操作的酶來自中國華美公司，按產品說明進行操作，其它實驗試劑分別來自Fluka公司。單克隆抗體來自Sigma公司。菌株及培養(yǎng)大腸桿菌JM109按《分子克隆》中介紹方法培養(yǎng)和保存。胰島素B鏈制備處死大鼠，分離胰腺細胞，提取胰島細胞RNA。根據基因文庫的報道(未申請專利)合成兩端帶有HindⅢ和EcoRⅠ的引物aagctttttgtcaaacagcacctttg agaagatgagagggaaccggcttaag(美聯公司)，在PCR儀(華美公司)中，94℃變性60秒鐘、58℃退火60秒鐘、72℃延伸90秒鐘的循環(huán)中擴增3035循環(huán)，獲得胰島素B鏈片段，應用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內切酶酶切該片段，并與同樣處理后的pcDNA3質粒連接，構建成為胰島素B鏈基因疫苗，然后將其轉運到大腸桿菌JM109菌株中擴增。
胰島素B鏈基因疫苗在大腸桿菌中的擴增大腸桿菌JM109在含有青霉素、鏈霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)到適當的光吸收值，然后加入異丙基-beta-D-硫代吡喃半乳糖苷，繼續(xù)培養(yǎng)，并進行質粒鑒定，以確定所得到的為胰島素B鏈基因疫苗。
二、對應用胰島素B鏈基因疫苗進行治療和預防自身免疫性糖尿病的研究為進一步證實胰島素B鏈基因疫苗對自身免疫性糖尿病小鼠的防治作用，本實施例在自身免疫性糖尿病發(fā)病前后分別應用胰島素B鏈基因疫苗后，進行了研究自身免疫性糖尿病小鼠的模型按Paik等方法制備，連續(xù)5天腹腔內注射溶于pH4.5 0.1mmol/L檸檬酸緩沖液中的鏈脲佐菌素50mg/kg。實驗分組第1組對照組B57CL/6小鼠，未制作糖尿病動物模型，肌肉注射0.9％氯化鈉溶液第2組糖尿病組按上述方法制作糖尿病動物模型，發(fā)病后肌肉注射0.9％氯化鈉溶液第3組胰島素B鏈基因疫苗治療組糖尿病小鼠，發(fā)病后肌肉內注射含胰島素B鏈基因疫苗的0.9％氯化鈉溶液第4組胰島素B鏈基因疫苗預防組在制作糖尿病動物模型之前，注射含胰島素B鏈基因疫苗的0.9％氯化鈉溶液在實驗過程中，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持在溫度18～27℃，相對濕度為＞70％，燈光照射12小時，胰島素B鏈基因疫苗注射時間為0800～0900之間。實驗結果1、應用胰島素B鏈基因疫苗防治糖尿病小鼠后，小鼠糖尿病發(fā)病率的變化表1 胰島素B鏈基因疫苗對自身免疫性糖尿病小鼠的影響
從表1可以得出1)預防性應用胰島素B鏈基因疫苗，第1周無1例發(fā)生糖尿病，第2周糖尿病的有效率為70％，第3、4周維持在60％，較同期的糖尿病組和治療組明顯降低(P＜0.005～0.01)；2)對于糖尿病組和治療組，通過檢測血糖、尿糖發(fā)現，無1例出現糖尿病緩解。
2、應用胰島素B鏈基因疫苗防治糖尿病鼠后，小鼠糖尿病血糖的變化如表2所示，1)在自身免疫性糖尿病小鼠，在發(fā)病后第1周到第4周，血糖穩(wěn)定為20.28±1.75mmol/L、19.34±2.33mmol/L、20.33±2.31mmol/L和19.30±1.83mmol/L，較對照組呈顯著性升高(P＜0.01)；2)預防性應用胰島素B鏈基因疫苗后，可以有效地使大多數具有糖尿病發(fā)病傾向小鼠的血糖維持在8.02±0.99～9.00±0.76mmol/L之間，明顯低于糖尿病組3)小鼠發(fā)病后，應用胰島素B鏈基因疫苗并不能有效地降低血糖。
表2 胰島素基因疫苗對自身免疫性糖尿病糖尿病小鼠血糖的影響(mmol/L)
3、應用胰島素B鏈基因疫苗防治糖尿病鼠后，小鼠胰島分泌胰島素的變化表3胰島素B鏈基因疫苗對自身免疫性糖尿病糖尿病小鼠胰島素的影響(mIU/L)
預防性應用胰島素B鏈基因疫苗4周后，可以有效地使多數小鼠的胰島素濃度維持在47.75±3.30～52.40±5.50mIU/L之間，和對照組相比，無顯著性差異。而在糖尿病發(fā)病后，再應用胰島素基因疫苗不能使血中胰島素的含量升高。糖尿病組小鼠血中胰島素的濃度＜5mIU/L。(見表3)4、應用胰島素B鏈基因疫苗防治自身免疫性糖尿病鼠后，小鼠胰島的變化糖尿病發(fā)生第4周以及應用胰島素B鏈基因疫苗4周后，處死各組小鼠，做常規(guī)病理性檢測，顯微鏡下發(fā)現1)糖尿病組小鼠胰島數目減少、部分胰島細胞周圍仍可見浸潤的炎癥細胞，胰島細胞被破壞；2)治療組小鼠病理改變和糖尿病組相似，說明已發(fā)病的糖尿病小鼠在注射胰島素B鏈基因疫苗后，并不能有效的抑制機體內的免疫反應。3)預防性應用胰島素B鏈基因疫苗后，多數小鼠在實驗觀察期間未發(fā)生糖尿病，盡管此種小鼠部分胰島β細胞仍然被破壞，但是未發(fā)現胰島周圍出現浸潤的炎癥細胞，而預防組內注射胰島素基因疫苗未阻止糖尿病發(fā)生的小鼠，其病理變化和糖尿病組相似。
權利要求
1.一種胰島素B鏈基因疫苗制劑，其特征在于該制劑含有胰島素B鏈基因、質粒DNA。
2.根據權利要求1所述的基因疫苗制劑，其特征在于所述的制劑為可以直接作為基因疫苗的特別優(yōu)選的重組DNA質粒以及編碼胰島素B鏈片段的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗自身免疫性糖尿病的保護性新型疫苗,本發(fā)明特別涉及新的用于預防自身免疫性糖尿病發(fā)病的基因疫苗,該疫苗能提供抗自身免疫性糖尿病的保護作用。該制劑含有胰島素B鏈基因、質粒DNA。所述的制劑為可以直接作為基因疫苗的特別優(yōu)選的重組DNA質粒以及編碼胰島素B鏈片段的基因。
文檔編號A61K48/00GK1322574SQ0110904
公開日2001年11月21日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權日2001年2月28日
發(fā)明者錢慶文, 汪恕萍, 錢書虹, 霍東霞 申請人:錢慶文, 汪恕萍, 錢書虹, 霍東霞