以hsp65為表位支架的多t細胞表位結核基因疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了以HSP65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗，在載體中插入嵌合有來自結核分枝桿菌抗原的5個T細胞表位多肽基因的HSP65蛋白的全長基因。該疫苗的制備方法是在HSP65全長基因中插入5個來自結核分枝桿菌抗原中的T細胞表位基因EAST-61-60、Ag85B721-765、MTB10.47-33、PPE25721-765和PE1910-54。該結核基因疫苗通過將基因疫苗與脫乙酰殼聚糖形成納米顆粒復合物滴鼻免疫小鼠，證實可誘導針對HSP65載體的血清IgG和肺SIgA應答，同時誘導多結核抗原表位特異性的較強的分泌高水平IFNγ的細胞免疫應答，是一種潛在預防和治療結核病的疫苗。
【專利說明】以HSP65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物基因工程領域，涉及一種結核病的基因疫苗及其制備方法和應用，特別是涉及一種以結核分枝桿菌熱休克蛋白65 (HSP65)為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002]結核病的死灰復燃是全球重大的健康問題，由于常規(guī)BCG疫苗對肺結核預防的無效性、結核耐藥菌株的出現(xiàn)、以及HIV感染導致的結核合并感染，肺結核的發(fā)病及死亡目前居高不下，形勢十分嚴重。全球每年有800萬活動性結核患者并導致300萬死亡；我國約有
5.5億人口曾經感染結核，每年約有12萬新發(fā)病人，13萬人死于結核。2006年起結核已一躍成為我國感染性疾病的發(fā)病首位，研制新型結核預防疫苗和治療性疫苗非常迫切。
[0003]卡介苗(BCG)是目前為止唯一獲準用于預防結核病的疫苗，雖然BCG能預防兒童結核病和成人的肺外結核病，卻未能有效預防成人肺結核的發(fā)生。同時BCG的免疫保護效果在不同地區(qū)不同種族中存在顯著差異。其原因可能在于BCG與結核分枝桿菌的野生型毒株H37Rv相比，缺失了一些序列。
[0004]結核研究表明，誘導Thl型的和多功能的T細胞免疫應答對于清除巨噬細胞內感染的結核桿菌至關重要，誘導分泌IFNy的⑶4 + Thl、⑶8 + CTL的產生及誘導多功能ThI (IFNy+IL-2+TNF<+的⑶4 + T)應答據(jù)報道可有效保護動物抵抗結核分枝桿菌攻擊。基因疫苗及DNA疫苗，是將外源目的基因構建于真核表達質粒、將基因直接免疫動物的第三代疫苗，由于其可在體內表達目的抗原，通過外源性、內源性以及交叉抗原提呈途徑被DC細胞提呈，有效激活⑶4 + Thl和⑶8 + CTL細胞，因此特別有利于誘導Thl型免疫應答。
[0005]抗原表位又稱為抗原決定簇，是指被抗原受體TCR和BCR特異性識別的抗原最小的結構和功能單位。一般來說，只有位于抗原表面的表位易與抗原識別受體BCR或抗體結合，稱功能性表位，而位于分子內部的表位難以被BCR識別；TCR雖然識別經過降解的小分子多肽，但是由于蛋白的剪切需要正確的側翼序列，因此通常位于抗原表面的具有良好空間構象的表位容易被正確剪切而后被MHC分子提呈并被TCR識別。表位由于分子量小，結構簡單，故免疫原性較弱，且在體內易降解，單獨使用很難引起較強的免疫應答和免疫記憶。
[0006]多表位基因疫苗是通過基因工程的方法將多個表位進行串聯(lián)或嵌合表達在某一基因載體中，通過載體作用使表位的免疫原性得以增強。表位若直接串聯(lián)很可能會失去在天然蛋白中的空間伸展性和構象，難以被B細胞表面的BCR識別，同時由于缺乏必要的側翼序列，難以被正確剪切成為T細胞表位，因此被TCR良好識別的概率也較低。通常要在多個表位之間插入適當?shù)膫纫硇蛄胁拍鼙ＷCT細胞表位的正確剪切。如將表位嵌合入大分子蛋白結構中，則表位同時獲得了被BCR識別所需的空間構象和TCR識別所需的側翼序列，因此，是一種構建多個T細胞表位疫苗的良好方法。同時，多個T細胞表位的良好構筑，有望同時激活多個T細胞表位特異性的T細胞應答，實現(xiàn)更為全面有效的抗結核免疫保護。


【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種以結核分枝桿菌來源HSP65為表位支架的多T表位結核基因疫苗及其制備方法和應用，所述的這種以HSP65為表位支架的多T表位結核基因要解決由于常規(guī)BCG疫苗的無效性、以及結核耐藥菌株的出現(xiàn)和AIDS病導致的結核感染使得現(xiàn)有疫苗預防和治療結核病的效果不佳的技術問題。
[0008]本發(fā)明提供了一種以HSP65為表位支架的多T表位結核基因，由一個載體構成,在所述的載體中插入有結核分枝桿菌H37Rv株來源的HSP65的全長基因,所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的HSP65的全長基因中嵌合有來自結核桿菌抗原的5個T細胞表位多肽基因，所述的5個T細胞表位分別是結核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的I?60位基因，結核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的721?765位基因，結核分枝桿菌H37Rv株來源的MTB10.4蛋白的7?33位基因，結核分枝桿菌H37Rv株來源的PPE25蛋白的721?765位基因，結核分枝桿菌H37Rv株來源的PE19蛋白的10?54位基因，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的的熱休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO:2所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的I?60位基因的DNA序列如SEQ ID N0:4所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的721?765位基因的DNA序列如SEQID N0:6所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的MTB10.4蛋白的7?33位基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的PPE25蛋白的721?765位基因的DNA序列如SEQ ID NO: 10所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的PE19蛋白的10?54位基因的DNA序列如SEQ ID NO: 12所示。在結核分枝桿菌H37Rv株來源的的HSP65全長基因中的第438位堿基后插入結核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的I?60位基因、第453位堿基后插入結核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的721?765位基因、第471位堿基后插入結核分枝桿菌H37Rv株來源的MTB10.4蛋白的7?33位基因、第1185位堿基后插入結核分枝桿菌H37Rv株來源的PPE25蛋白的721?765位基因和結核分枝桿菌H37Rv株來源的PE19蛋白的10?54位基因，所述的MTB10.4蛋白的7?33位基因后嵌入gccgcctac基因序列。嵌合了結核分枝桿菌H37Rv株來源的5個T細胞表位基因的HSP65的全長基因所構成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO:14所示。
[0009]進一步的，所述的載體為真核表達質粒，所述的真核表達質粒選自pcDNA3.1質粒、或pVAXl質粒。
[0010]進一步的，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的的熱休克蛋白HSP65的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0011]進一步的，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源ESAT-6蛋白的I?60位基因的氨基酸序列ESATI1 — 20如SEQ ID NO:3所示。
[0012]進一步的，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源Ag85B蛋白的721?765位基因的氨基酸序列Ag85B241 — 255如SEQ ID NO:5所示。
[0013]進一步的，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源MTB10.4蛋白的7?33位基因的氨基酸序列MTB 10.4m如SEQ ID NO:7所示。
[0014]進一步的，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源PPE25蛋白的721?765位基因的氨基酸序列PPE25241 — 255如SEQ ID NO:9所示。
[0015]進一步的，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源PE19蛋白的10?54位基因的氨基酸序列 PE194 —18如 SEQ ID NO: 11 所示。
[0016]進一步的，嵌合了結核分枝桿菌H37Rv株來源的5個T細胞表位基因的熱休克蛋白HSP65的全長基因所構成的外源目的基因的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0017]本發(fā)明還提供了上述的以HSP65為表位支架的多T表位結核基因疫苗的制備方法，包括以下步驟:
1)提取結核分枝桿菌H37Rv株DNA作為模板，通過PCR方法擴增熱休克蛋白HSP65編碼基因；2)以上述HSP65基因作為模板，分別通過PCR擴增雙鏈DNA片段1、片段3、片段4，其中片段3與片段4有17個堿基重疊序列。所述的片段I的雙鏈DNA的序列為

【權利要求】
1.一種以熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗，其特征在于:由一個載體構成，在所述的載體中插入有結核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白65 (HSP65)的全長基因，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的HSP65的全長基因中嵌合有來自結核分枝桿菌抗原的5個T細胞表位多肽基因，所述的5個T細胞表位分別是結核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的I?60位基因，結核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的721?765位基因，結核分枝桿菌H37Rv株來源的MTB10.4蛋白的7?33位基因，結核分枝桿菌H37Rv株來源的PPE25蛋白的721?765位基因，結核分枝桿菌H37Rv株來源的PE19蛋白的10?54位基因，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白65基因的DNA序列如SEQ ID NO:2所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的I?60位基因的DNA序列如SEQ ID N0:4所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的721?765位基因的DNA序列如SEQ ID NO: 6所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的MTB10.4蛋白的7?33位基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的PPE25蛋白的721?765位基因的DNA序列如SEQ ID NO: 10所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的PE19蛋白的10?54位基因的DNA序列如SEQ ID NO: 12所示，在結核分枝桿菌H37Rv株來源的的HSP65全長基因中的第438位堿基后插入結核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的I?60位基因、第453位堿基后插入結核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的721?765位基因、第471位堿基后插入結核分枝桿菌H37Rv株來源的MTB10.4蛋白的7?33位基因、第1185位堿基后插入結核分枝桿菌H37Rv株來源的PPE25蛋白的721?765位基因和結核分枝桿菌H37Rv株來源的PE19蛋白的10?54位基因，所述的MTB10.4蛋白的7?33位基因后嵌入gccgcctac基因序列，嵌合了結核分枝桿菌H37Rv株來源的5個T細胞表位基因的結核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白65的全長基因所構成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO:14所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的以熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗，其特征在于:所述的載體為真核表達質粒，所述的真核表達質粒選自pcDNA3.1質?；騊VAXI質粒中的任意一種。
3.根據(jù)權利要求1所述的以熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗，其特征在于:所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白65的氨基酸序列SEQ ID如NO: I所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的ESAT-6蛋白的I?60位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的Ag85B蛋白的721?765位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的MTB10.4蛋白的7?33位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的PPE25蛋白的721?765位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述的結核分枝桿菌H37Rv株來源的PE19蛋白的10?54位基因的氨基酸序列如SEQ ID ΝΟ:11所示，嵌合了結核分枝桿菌H37Rv株來源的5個T細胞表位基因的結核分枝桿菌H37Rv株來源的熱休克蛋白65的全長基因所構成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，嵌合了結核桿菌5個T細胞表位基因的結核桿菌熱休克蛋白65的全長基因所構成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO: 14所不。
4.權利要求1所述的以熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗的制備方法，其特征在于:包括以下步驟:1)提取結核分枝桿菌H37RV株的DNA作為模板，通過PCR方法擴增結核桿菌熱休克蛋白HSP65編碼基因； 2)以結核桿菌熱休克蛋白HSP65基因作為模板，分別通過PCR擴增雙鏈DNA片段1、片段3、片段4，其中片段3與片段4有17個堿基重疊序列；所述的片段I的雙鏈DNA的序列為
所述的片段3的雙鏈DNA的序列為

3)以上述的片段I作為模板，通過PCR擴增雙鏈DNA片段2，得到的片段2與片段3有17個減基重置序列；所述的片段2的雙鏈DNA的序列為

4)將上述的片段3與片段4混合，變性成為單鏈，通過彼此重疊的17個堿基互補連接，以此作為模板，通過PCR方法擴增獲得片段5，片段5嵌合有PPE25及PE19表位，片段5與片段2有17個彼此重疊的堿基序列，所述的片段5的雙鏈DNA的序列為:

5)將上述的片段2與片段5混合，變性成為單鏈，通過彼此重疊的17個堿基互補連接，以此作為模板，通過PCR方法擴增獲得嵌合了 5個T細胞表位的結核分枝桿菌熱休克蛋白HSP65外源目的基因，將目的基因經雙酶切后與經同樣雙酶切的載體連接，獲得權利要求1所述的熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗。
5.如權利要求1所述的以熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗的制備方法，其特征在于:以SEQ ID NO:15所示的HSP65上游引物Tl和SEQ ID NO:16所示的HSP65T2引物通過PCR擴增片段1，以SEQ ID NO: 18所示的引物HSP65 T4序列和SEQID NO:19所示的引物HSP65 T5序列通過PCR擴增片段3，以SEQ ID N0:20所示的引物HSP65T6序列和SEQ ID NO:21所示的HSP65下游引物T7通過PCR擴增片段4 ;用SEQ IDNO:15所示的HSP65上游引物Tl和SEQ ID NO:17所示的HSP65的T3引物以片段I為模板，通過PCR方法擴增出片段2 ;用SEQ ID NO: 18所示的HSP65T4引物和SEQ ID NO:21所示的HSP65下游引物T7以片段3、4混合并變性為單鏈、互補連接后的基因為模板，通過PCR方法擴增出片段5 ;用SEQ ID N0:15所示的HSP65上游引物Tl和SEQ ID NO:21所示的HSP65下游引物T7以片段2、5混合并變性為單鏈、互補連接后的基因為模板，通過PCR方法擴增嵌合了 5個T細胞表位的結核分枝桿菌熱休克蛋白HSP65外源目的基因。
6.如權利要求4所述的以熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗的制備方法，其特征在于:嵌合了 5個T細胞表位的HSP65外源目的基因和插入載體的酶切位點分別為EcoRI和Hind III位點。
7.如權利要求4所述的以熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗的制備方法，其特征在于:所有抗原來自結核分枝桿菌H37Rv株。
8.一種藥物組合物，其特征在于:含有有效量的權利要求1所述的以熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗。
9.如權利要求1所述的一種藥物組合物，其特征在于:還含有藥學上可接受的載體或者賦形劑。
10.權利要求1所述的以熱休克蛋白65為表位支架的多T細胞表位結核基因疫苗在制備治療和預防結核病的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/06GK104127883SQ201310682146
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權日:2013年12月16日
【發(fā)明者】徐薇, 吳曼麗, 熊飛 申請人:蘇州大學