專利名稱：用于調(diào)節(jié)消化道活動性和食物攝取的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及肥胖癥治療和調(diào)節(jié)食物攝取的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)食物攝取的組合物和方法，其中，給予單端孢霉烯及其衍生物和類似物或者嘌呤能(purinergic)化合物，以改變消化道活動性并從而產(chǎn)生飽腹感。本發(fā)明還涉及篩檢能用于調(diào)節(jié)食物攝取的單端孢霉烯的衍生物或類似物以及嘌呤能受體的激動劑和拮抗劑的方法。
背景技術(shù)：
過度飽食導(dǎo)致肥胖，這是個主要的健康問題。肥胖除了增加軀體所受的身體和機(jī)械限制外，還增加患糖尿病、心臟病、癌癥和其他慢性疾病的風(fēng)險。雖然科學(xué)上已證明肥胖對健康產(chǎn)生不利的影響，并且公眾已廣泛認(rèn)識到這一點，但是還是難以在數(shù)以百萬計的人群中有效控制個體的食欲和過度飽食。在北美，大約25％的兒童體重超重或肥胖。僅北美洲人在減少體重的治療中每年就花費(fèi)400億美元，而且這個數(shù)字還在增加。最近的一個調(diào)查保守地估計加拿大每年花費(fèi)18億美元治療肥胖癥，占所有疾病的總健康護(hù)理支出的2.4％(參見“Cost of Obesity1.8$billion”，Pharmaceutical Manufacturers Association of Canada，1999年3月，第11頁)。
目前可得到的抗肥胖癥藥物，大部分都是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)途徑為目標(biāo)，以誘導(dǎo)食欲抑制。但是，這些藥物產(chǎn)生許多CNS相關(guān)的副作用，如焦慮，而且還可能產(chǎn)生慢性健康問題，如高血壓、心血管疾病和糖尿病。目前治療肥胖癥的另一種方法是通過食用代替正常食物的“膨脹性”食品控制食欲。但這些膨脹性食品中的所需營養(yǎng)沒達(dá)到必需的范圍，因此食用它們產(chǎn)生了營養(yǎng)狀況改變的問題。而且，食用這些膨脹性食品的個體可能拒絕食用任何食物，即使是所需的營養(yǎng)。
服用抑制食欲的藥物屬于治療肥胖癥最不理想的方法，因為一旦停止服用這些藥物，體重通常又重新增加。此外，患嚴(yán)重的不良的副作用包括如原發(fā)性肺動脈高血壓的風(fēng)險也限制了這些藥物的應(yīng)用。例如，食欲抑制劑氟苯丙胺和右旋氟苯丙胺最近被它們的制造者撤出了市場，因為它們可能對肺和心臟產(chǎn)生嚴(yán)重的不利影響。
近來出現(xiàn)的治療肥胖癥的其他方法是使用干擾從小腸吸收脂肪的藥物。這些藥物可抑制消化脂肪的胰酶。不被消化的脂肪通過腸被排泄。減少脂肪的吸收可產(chǎn)生油性糞便、內(nèi)衣上的油污、腸氣、頻繁的腸蠕動以及可溶于脂肪的營養(yǎng)素如維生素A、D和E的吸收減少。
目前還沒有既能減少體重又不產(chǎn)生不健康的副作用或不增加患病風(fēng)險的醫(yī)學(xué)方法。仍需要有效的治療肥胖癥的方法以及控制人和其他動物體重增重而不產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)的或醫(yī)學(xué)的副作用的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供治療人和其他動物肥胖癥和控制其食物攝取的方法。本發(fā)明是以對霉菌毒素單端孢霉烯如何在人和其他脊椎動物中產(chǎn)生食物拒絕的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，以及以對推動食物通過消化道器官的消化道活動性(“消化道運(yùn)動行為”)的神經(jīng)回路調(diào)節(jié)模型的解釋為基礎(chǔ)。本文所述的治療方法涉及給予影響消化道活動性模式(即消化道器官的平滑肌組織的收縮、舒張和靜止模式)的化合物。刺激消化道活動性的“進(jìn)食模式”，產(chǎn)生飽腹感，即吃飽的感覺，這縮短了個體飲食或進(jìn)食的時間。因此，刺激消化道活動性的進(jìn)食模式的化合物可用在限制食物攝取以及治療肥胖癥的方法中。刺激“禁食模式”或延長或阻止發(fā)生消化道活動性的進(jìn)食模式的化合物傾向于增加進(jìn)食的時間，因為身體沒有產(chǎn)生飽腹感。這些化合物特別有用于增加動物體重的方法中，如用于作為商業(yè)肉源的家畜和家禽。
本發(fā)明提供的治療肥胖癥的方法包括給予有效量的刺激消化道活動性的進(jìn)食模式的單端孢霉烯霉菌毒素或其衍生物。在本發(fā)明的一個較佳實施例中，治療肥胖癥的方法包括給予個體單端孢霉烯，此單端孢霉烯選自瓜萎鐮毒素、4-脫氧瓜萎鐮毒素(“DON”，C15H20O6)、曲古?？她?trichothecolon)、單端孢菌素、3-乙?；撗豕衔牰舅?“3-乙酸基DON”，C17H22O7)、7-乙?；撗豕衔牰舅?、3，15-二乙?；撗豕衔牰舅亍?-乙?；衔牰舅?鐮刀菌酮-X)、4，15-二乙?；衔牰舅嘏c瓜萎鐮毒素結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物。其他基于DON的衍生物還可用在本發(fā)明的較佳方法中，包括DON碳酸酯(即3-羥基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯，C16H18O7)、3-乙?；?DON碳酸酯(即3-乙酰氧基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯C18H20O8)、3-乙酰基DON亞芐基縮醛(即3-乙酰氧基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C24H26O8)、DON-亞芐基縮醛(即3-羥基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C22H24O7)、異亞丙基DON(即3-羥基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C18H24O6)和異亞丙基-3-乙?；?DON(即3-乙酰氧基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C20H26O7)。更佳的是，本治療肥胖癥的方法包括給予個體一劑無毒性且不引起嘔吐、但刺激該個體消化道活動性的進(jìn)食模式的單端孢霉烯，如DON或DON基的衍生物?？赏ㄟ^各種途徑給予單端孢霉烯或其衍生物，包括經(jīng)口或腸道外給藥。
或者，治療肥胖癥的方法包括給予單端孢霉烯類似物，該類似物像單端孢霉烯一樣刺激消化道活動性的進(jìn)食模式。單端孢霉烯類似物與單端孢霉烯在結(jié)構(gòu)上可能是相關(guān)的或者不同的。因此，單端孢霉烯類似物可從單端孢霉烯如DON衍生得到，或者可以是各種化合物，包括無機(jī)化合物、有機(jī)化合物、氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸、糖類、脂質(zhì)以及它們的組合，這些物質(zhì)都能刺激消化道活動性的進(jìn)食模式。
在另一實施例中，本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)個體的消化道活動性和治療其肥胖癥的組合物和方法。本發(fā)明的這些方法包括給予個體一種結(jié)合并刺激P2X1嘌呤受體的化合物，該受體出現(xiàn)在腸組織的平滑肌上，并直接參與消化道活動性的進(jìn)食模式的調(diào)節(jié)。具體而言，P2X1嘌呤受體的激動劑是嘌呤能化合物，它與該受體結(jié)合并刺激消化道活動性的進(jìn)食模式。至于單端孢霉烯，它以嘌呤能化合物刺激消化道活動性的進(jìn)食模式，產(chǎn)生飽腹感，從而縮短進(jìn)食時間，減少食物攝取。較佳的是，本發(fā)明用于治療肥胖癥的P2X1受體的激動劑是嘌呤受體的“非脫敏”激動劑，即激動劑的分子能與P2X1受體結(jié)合，刺激P2X1介導(dǎo)的消化道活動性的進(jìn)食模式，但最終并沒有封阻或滅活該受體。在更好的一個實施例中，P2X1受體的非脫敏激動劑是用在刺激消化道活動性的進(jìn)食模式中以及用于治療肥胖癥的ATP或2′，3′-O-(2，4，6-三硝基苯基)-ATP(“TNP-ATP”)的結(jié)構(gòu)類似物。
在另一實施例中，本發(fā)明提供增加個體體重的組合物和方法。這些方法包括給予個體P2X1受體的脫敏激動劑或拮抗劑，如TNP-ATP。用于本發(fā)明這些方法中的脫敏激動劑或拮抗劑化合物與P2X1受體結(jié)合并將其封阻，從而抑制或阻止消化道活動性的進(jìn)食模式和/或延長消化道活動性的禁食模式，后者反過來增加進(jìn)食時間和食物攝取。這些方法特別適用于飼養(yǎng)商業(yè)家畜和家禽。
在本發(fā)明的又一實施例中，提供了鑒定刺激或抑制(阻止)消化道活動性的進(jìn)食模式的化合物的方法，該方法通過直接記錄給藥期間以及化合物在受試者體內(nèi)代謝期間該受試者體內(nèi)的消化道活動性的模式而實現(xiàn)。這些方法可用于檢測化合物的調(diào)節(jié)活性，如已知的或新的單端孢霉烯化合物、單端孢霉烯衍生物化合物、單端孢霉烯類似物化合物、P2X1受體的激動劑或P2X1受體的拮抗劑?？墒褂皿w外腸浴(bath)實驗、離體腸器官實驗或體內(nèi)實驗測定化合物調(diào)節(jié)(刺激或抑制)消化道活動性模式的能力。根據(jù)本發(fā)明，通過這些篩檢方法被確認(rèn)為能刺激消化道活動性的進(jìn)食模式的單端孢霉烯和嘌呤能化合物及其衍生物或類似物可用于治療肥胖癥，而抑制消化道活動性的進(jìn)食模式的化合物可用于增加食物攝取，以及促進(jìn)商業(yè)家畜和家禽的體重增重。
附圖的簡短說明

圖1是Krantis等人〔Can.j.Physiol.Pharmacol.，74894-903(1996)〕設(shè)立的用于記錄麻醉的實驗動物如大鼠(1)的胃腸活動性的體內(nèi)裝置示意圖。在大鼠腸的放大詳圖(A)中，箔壓力傳感器(2)沿著肌肉層縱向粘附(例如，用膠水)在所選擇的腸器官位點上，例如胃竇的絨膜表面(3)、十二指腸近端(4)或回腸遠(yuǎn)端(5)。導(dǎo)線連接在IBM計算機(jī)的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(6)上。
圖2是十二指腸和回腸中消化道活動性的神經(jīng)途徑控制的進(jìn)食和禁食模式示意圖。膽堿能(ACh)、一氧化氮能(NO)和嘌呤能(ATP)神經(jīng)元用不同的受體靶標(biāo)和/或輸入表示mus.(膽堿能蕈毒堿的)、5-HT3(五羥色胺能的)、nic.(膽堿能煙堿的)、P2X(嘌呤能的)?！?”號表示神經(jīng)元之間的刺激性輸入和腸平滑肌的刺激和收縮；“-”號表示抑制性輸入。DON是脫氧瓜萎鐮毒素，是腸機(jī)能亢進(jìn)(進(jìn)食模式)和飽腹感的刺激物。NO為一氧化氮，它在十二指腸近端是非腎上腺能的、非膽堿能的(NANC)抑制性遞質(zhì)，它還是十二指腸和回腸中傳播性的P2X-嘌呤能和膽堿能(蕈毒堿，mus.)活動性的抑制性遞質(zhì)。一氧化氮能中間神經(jīng)元(NO)與膽堿能煙堿輸入(nic.)(右側(cè))之間的環(huán)路在回腸中不存在。ATP是三磷酸腺苷，嘌呤能受體(如P2X受體)的脫敏激動劑。ACh是乙酰膽堿，結(jié)合在蕈毒堿(mus.)受體上以激活運(yùn)動神經(jīng)元的膽堿能化學(xué)信號。5-HT是5-羥基色胺(五羥色胺)，結(jié)合于神經(jīng)元上的5-HT3(五羥色胺能的)受體，是腸平滑肌的腸中間神經(jīng)元介導(dǎo)的神經(jīng)源性的NANC松弛和膽堿能性收縮的刺激的主要遞質(zhì)。nic.是神經(jīng)元的膽堿能煙堿受體。
圖3A和3B是4-脫氧瓜萎鐮毒素(DON)及其相關(guān)衍生物化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。圖3A是DON(C15H20O6)、3-乙?；?DON(C17H22O7)、異亞丙基DON(C18H24O6，商品號EN 139491)和異亞丙基-3-乙?；?DON(C20H26O7，商品號EN 139492)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。圖3B是DON碳酸酯(C16H18O7，商品號EN 139494)、3-乙?；?DON碳酸酯(C18H20O8，商品號EN 139495)、3-乙?；?DON亞芐基縮醛(C24H26O8，商品號EN 139496)和DON-亞芐基縮醛(C22H24O7，商品號EN139497)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖?！癙h”表示苯基，“OAc”表示乙?；?br> 圖4記錄了具有收縮和松弛反應(yīng)振蕩表現(xiàn)的對照大鼠的胃竇的自發(fā)活動性?？v向標(biāo)記表示開始記錄后的第0和第50分鐘。以10mg/kg體重的量靜脈(i.v.)給予DON(第一個箭頭所指為t＝0分鐘)，這使得胃竇的活動性突然下降。在40分鐘內(nèi)，對照動物的運(yùn)動模式恢復(fù)，但是，第一次給藥后很快再給予DON(第二個箭頭)并沒有產(chǎn)生影響。
圖5記錄了大鼠十二指腸對照行為的體內(nèi)活動性模式。十二指腸對照行為的自發(fā)的體內(nèi)活動性模式(沒有DON)由周期性的“組合(grouped)”(G)和“組間(intergroup)”(I)行為組成。縱向的標(biāo)記表示開始記錄后的第0、30、120和150分鐘。t＝30分鐘后的第一個箭頭表示以10mg/kg體重全身給予(i.v.)DON(箭頭處)，這誘導(dǎo)了持續(xù)的機(jī)能亢奮(46±15分鐘)。接著活動性恢復(fù)到對照水平，再給予DON(t＝150分鐘之后的箭頭)沒產(chǎn)生影響。
圖6A-6D顯示在大鼠十二指腸(圖6A的頻率和6B的幅度)和回腸(圖6C的頻率和6D的幅度)中L-NAME和α，β-亞甲基ATP對DON誘導(dǎo)的松弛的頻率(Freq)和幅度(Amp)的影響的定量分析數(shù)據(jù)。L-NAME和DON存在時的組合活動性(寬的對角線柱)與僅有DON的行為(密的對角線柱)相當(dāng)。在十二指腸(n＝8)和回腸(n＝4)中，α，β-亞甲基ATP顯著地將DON誘導(dǎo)的松弛(填充柱)的頻率和幅度減少到對照組間行為(沒有DON，空白柱)的水平。
圖7A-7D顯示在大鼠十二指腸中5-HT3受體拮抗劑——谷尼色創(chuàng)(granisrtron)對自發(fā)的和DON誘導(dǎo)的行為的影響的定量分析結(jié)果。谷尼色創(chuàng)(i.v.或i.a.，第3個柱)選擇性地降低了“組合”松弛(n＝6，圖7A為頻率，7B為幅度)和“組合”收縮(n＝3，圖7C為頻率，7D為幅度)的頻率(Freq)和幅度(Amp)，但是，它沒有改變立體DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮〔比較密的對角線柱(僅有DON)與填充柱(DON+谷尼色創(chuàng))〕。對照“組合”行為(空白柱)。
圖8是α，β-亞甲基ATP對小豬十二指腸的收縮和松弛的DON增強(qiáng)的活動性的影響(以對照的百分比表示)的柱形圖。“對照”表示沒有接受DON和α，β-亞甲基ATP的一組小豬?！癉ON”表示僅接受DON(1mg/kg)的一組小豬?！唉粒?亞甲基ATP+DON”表示一組在十二指腸中產(chǎn)生DON(1mg/kg)增強(qiáng)的活動性期間動脈內(nèi)注射α，β-亞甲基ATP(300μg/kg，i.a.)的小豬。將對照組的值設(shè)為100％。其他所有的值均是對照值的百分?jǐn)?shù)。空白柱表示松弛的平均幅度(4只小豬)。填充柱表示松弛的平均頻率(5只小豬)。敞開的交叉線柱表示收縮的平均幅度(3只小豬)。橫線柱表示收縮的平均頻率(2只小豬)?！唉住北硎九c對照相比p＜0.05?！唉铡北硎九cDON增強(qiáng)的行為相比p＜0.05。
圖9是α，β-亞甲基ATP對小豬回腸的DON增強(qiáng)的活動性(收縮和松弛)的影響(以對照的百分?jǐn)?shù)表示)的柱形圖?！皩φ铡北硎緵]有接受DON和α，β-亞甲基ATP的一組小豬。“DON”表示僅接受DON(10mg/kg)的一組小豬?！唉粒?亞甲基ATP+DON”表示一組在回腸中產(chǎn)生DON(10mg/kg)增強(qiáng)的活動性期間動脈內(nèi)注射α，β-亞甲基ATP(300μg1kg，i.a.)的小豬。將對照組的值設(shè)為100％。其他所有的值是對照值的百分?jǐn)?shù)?？瞻字硎舅沙诘钠骄?4只小豬)。填充柱表示松弛的平均頻率(5只小豬)。敞開的交叉線柱表示收縮的平均幅度(3只小豬)。橫線柱表示收縮的平均頻率(2只小豬)?！唉住北硎九c對照相比p＜0.05?！唉铡北硎九cDON增強(qiáng)的行為相比p＜0.05。
圖10排出了膽堿能、一氧化氮能、GABA能、嘌呤能和VIP能神經(jīng)元在被提議的緊張的和調(diào)節(jié)性的途徑中控制大鼠十二指腸和回腸中自發(fā)的活動性的示意圖。GABA能和一氧化氮(NO)能中間神經(jīng)元與膽堿能煙堿輸入(nic.)(右端遠(yuǎn)側(cè))的環(huán)路在回腸中不存在。VIP是作用于血管的腸肽，它是運(yùn)動神經(jīng)分配的一氧化氮能預(yù)接合抑制作用的激活子。
圖11記錄了大鼠胃竇(位點S1)和十二指腸近端(位點D1)的對照的白發(fā)活動性。給予DON〔10mg/kg體重(“bw”)，靜脈給藥〕突然降低了竇的活動性，并誘導(dǎo)十二指腸(D1)持續(xù)的機(jī)能亢奮。在60分鐘內(nèi)，對照運(yùn)動模式恢復(fù)。
圖12顯示在體內(nèi)3-乙酰基DON對大鼠胃腸活動性的影響。給予3-乙?；鵇ON之前顯示的是十二指腸(在十二指腸的D2位點記錄)和胃竇(S1)中的消化道活動性的典型的禁食模式。注射3-乙?；鵇ON(10mg/kg，i.v.)后(垂直箭頭)，活動性變成典型的進(jìn)食模式活動性，并持續(xù)了大約40分鐘?！癕MC”是消化道活動性的禁食模式的“組合”行為部分。
圖13顯示以10mg/kg體重靜脈給予3-乙?；鵇ON對大鼠胃竇(S1)和十二指腸(D2)中的自發(fā)的活動性的影響。在60分鐘內(nèi)，對照運(yùn)動模式恢復(fù)(見130分鐘后的記錄)?！癕MC”是消化道活動性的禁食模式的“組合”行為部分。
圖14顯示典型的大鼠十二指腸(D1)和胃竇(S1)中的活動性的體內(nèi)記錄，闡述了化合物EN 139491(10mg/kg體重，i.v.)對“禁食”活動性的作用。上面部分顯示給予化合物前20分鐘正常的禁食活動性。在此過程中的記錄顯示十二指腸具有典型的低頻率自發(fā)活動性模式以及擴(kuò)散的“組合”活動性(“MMC”)，胃竇具有典型的規(guī)律性活動性。記錄的第二部分顯示注射EN 139491的時間和在注射后30秒內(nèi)發(fā)展的十二指腸中持續(xù)長時間(40-60分鐘)的機(jī)能亢奮以及胃竇中活動性的同時和平行的下降，這些都是進(jìn)食模式活動性特征。禁食模式活動性的恢復(fù)顯示在底部圖形中，以“組合”MMC行為和較不活躍的“組間”行為時期為證。
圖15顯示化合物EN 139491對在D2位點(離D1壓力傳感器1.5cm)記錄的十二指消化道活動性的影響。縮寫詞與前面的圖中的一樣。
圖16是在記錄經(jīng)氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指腸(D1)和胃竇上自發(fā)的體內(nèi)禁食模式活動性期間，給予EN 139492 DON衍生物化合物(10mg/kb，i.v)對松弛的幅度的影響的柱形圖。松弛的幅度以對照“組間”行為的百分?jǐn)?shù)表示。圖中顯示了給予EN 139491前“組合”活動性的活動性的松弛行為的幅度(對角線柱)、給予EN 139491前對照的“組間”活動性的幅度(空白柱，設(shè)為100％)和靜脈給予EN 139491后的激活亢奮的幅度。各柱形圖是得自5-8只Sprague Dawley大鼠的體內(nèi)記錄的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖17顯示如圖16所述的柱形圖，除了給出的是給予EN 139491對消化道活動性的松弛行為的消化道活動性的頻率的影響。
圖18顯示如圖16所述的柱形圖，除了給出的是給予EN 139491對消化道活動性的收縮行為的消化道活動性的幅度的影響。
圖19顯示如圖16所述的柱形圖，除了給出的是給予EN 139491對消化道活動性的收縮行為的消化道活動性的頻率的影響。
圖20顯示在大鼠十二指腸(十二指腸記錄位點D1和D2)和胃竇(竇記錄位點S1)中的活動性典型的體內(nèi)記錄，闡述了DON衍生物化合物EN 139492(10mg/kg，i.v.)對消化道活動性的“禁食”模式的作用。給予EN 139492前是明顯的典型的禁食運(yùn)動行為。在此禁食模式期間，十二指腸(D1和D2)具有典型的低頻率幅度運(yùn)動行為的模式與擴(kuò)散的“組合”運(yùn)動行為(MMC)，胃竇具有典型的規(guī)律性運(yùn)動行為。在注射給予EN 139492(垂直箭頭)的30秒內(nèi)，在十二指腸中發(fā)展了持續(xù)長時間(40-60分鐘)的機(jī)能亢奮，在胃竇中運(yùn)動行為同時下降，它們都表現(xiàn)為消化道活動性的進(jìn)食特征，雖然對竇的行為的影響不像對十二指腸那樣持久。
圖21顯示典型的靜脈注射經(jīng)氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠以P2X1嘌呤能受體拮抗劑TNP-ATP(3.5mg/kg)對該大鼠十二指腸內(nèi)(位點D1)的自發(fā)的行為的影響的體內(nèi)記錄。該記錄顯示，TNP-ATP在注射后(垂直箭頭)并沒有立即引起任何反應(yīng)，但是，在注射后1分鐘內(nèi)，擴(kuò)散的行為(MMC)減少了。“組間”行為并沒有顯著的改變。20分鐘內(nèi)行為恢復(fù)到對照水平的90％。
圖22顯示典型的靜脈注射TNP-ATP(3.5mg/kg)對大鼠十二指腸內(nèi)(位點D1)的DON誘導(dǎo)的(10mg/kg體重，i.v.，DON上垂直的箭頭)進(jìn)食模式行為的影響的體內(nèi)記錄。注射TNP-ATP(TNP-ATP上的垂直箭頭)后1分鐘TNP-ATP對DON誘導(dǎo)的進(jìn)食模式產(chǎn)生抑制性影響。
圖23顯示靜脈給予TNP-ATP(3.5mg/kg)對大鼠胃竇(S1)和十二指腸(D2)中的DON誘導(dǎo)的進(jìn)食模式誘導(dǎo)活性的影響。在60分鐘內(nèi)，恢復(fù)到對照運(yùn)動模式。記錄中的框中部分顯示TNP-ATP對各位點的初始作用。
圖24是體內(nèi)記錄經(jīng)氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指腸(D1位點)的消化道行為的松弛行為的幅度柱形圖。圖中給出了在沒有TNP-ATP(空白柱)和存在TNP-ATP(3.5mg/kg，i.v.，格子柱)的情況下DON(10mg/kb，i.v)誘導(dǎo)的腸機(jī)能亢奮的松弛行為的幅度。圖中還給出了“組合”MMC(對角線柱)和對照“組間”活性(填充柱)的松弛行為的幅度。松弛行為的幅度以設(shè)為100％的對照“組間”松弛幅度的百分?jǐn)?shù)表示。星號表示與對照“組間”誘導(dǎo)活性相比具有顯著差異(p＜0.05)。各柱形圖是得自5-8只Sprague Dawley大鼠的體內(nèi)記錄的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。各動物以自身為對照。D1表示得自放置在離幽門括約肌10mm遠(yuǎn)的位置上的壓力傳感器的記錄。
圖25是體內(nèi)記錄經(jīng)氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指腸(D1位點)的消化道行為的松弛行為的頻率柱形圖。圖中給出了在沒有TNP-ATP(空白柱)和存在TNP-ATP(3.5mg/kg，i.v.，格子柱)的情況下DON(10mg/kb，i.v.)誘導(dǎo)的腸機(jī)能亢奮的松弛行為的頻率。圖中還給出了“組合”MMC(對角線柱)和對照“組間”活性(填充柱)的松弛行為的頻率。松弛行為的頻率以設(shè)為100％的對照“組間”松弛頻率的百分?jǐn)?shù)表示。星號、統(tǒng)計和實驗的記錄條件與圖24相同。
圖26是體內(nèi)記錄經(jīng)氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指腸(D1位點)的消化道行為的收縮行為的幅度柱形圖。圖中給出了在沒有TNP-ATP(空白柱)和存在TNP-ATP(3.5mg/kg，i.v.，格子柱)的情況下DON(10mg/kb，i.v.)誘導(dǎo)的腸機(jī)能亢奮的收縮行為的幅度。圖中還給出了“組合”MMC(對角線柱)和對照“組間”活性(填充柱)的收縮行為的幅度。收縮行為的幅度以設(shè)為100％的對照“組間”收縮幅度的百分?jǐn)?shù)表示。星號、統(tǒng)計和實驗的記錄條件與圖24相同。
圖27是體內(nèi)記錄經(jīng)氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠的近端十二指腸(D1位點)的消化道行為的收縮行為的頻率柱形圖。圖中給出了在沒有TNP-ATP(空白柱)和存在TNP-ATP(3.5mg/kg，i.v.，格子柱)的情況下DON(10mg/kb，i.v)誘導(dǎo)的腸機(jī)能亢奮的收縮行為的頻率。圖中還給出了“組合”MMC(對角線柱)和對照“組間”活性(填充柱)的收縮行為的頻率。收縮行為的頻率以設(shè)為100％的對照“組間”收縮頻率的百分?jǐn)?shù)表示。星號、統(tǒng)計和實驗的記錄條件與圖24相同。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供通過調(diào)節(jié)人和其他脊椎動物腸器官的行為治療肥胖癥和調(diào)節(jié)食物攝取的組合物和方法。這些方法是以單端孢霉烯類化合物(如4-脫氧瓜萎鐮毒素，DON)刺激通常在攝取食物時出現(xiàn)的腸器官的收縮和松弛的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)。刺激此消化道活動性的“進(jìn)食模式”，產(chǎn)生飽腹感，即吃飽的感覺，這是個影響個體進(jìn)食時間的重要因素。單端孢霉烯(如DON)在腸器官的外部位點起作用，并將信號沿著神經(jīng)途徑傳至腸器官的平滑肌。我們已發(fā)現(xiàn)小腸平滑肌的細(xì)胞中存在一種特異性受體——嘌呤能受體P2X1，該受體涉及消化道行為的特異性調(diào)節(jié)。因此，作為P2X1受體的激動劑或拮抗劑的化合物也可用于調(diào)節(jié)消化道活動性，并控制飽腹感和進(jìn)食時間。
為了準(zhǔn)確地描述本發(fā)明，定義了下述術(shù)語本文所用術(shù)語“消化道”指由胃、小腸和大腸組成的胃腸道。
本文術(shù)語“消化道活動性”或“消化道行為”指人和其他動物的胃腸器官(胃、小腸和大腸)中的平滑肌的運(yùn)動行為，包括肌肉的周期交替收縮和松弛期以及靜止期和相對小的活動期。例如，在正常健康的人和其他動物中，當(dāng)攝取食物以促進(jìn)食物進(jìn)入腸中以使?fàn)I養(yǎng)被提取和吸收(見下面的消化道的“進(jìn)食模式“)時，小腸肌肉的收縮和松弛的頻率和幅度變高。其他的消化道活動性模式可依賴于消化道器官的不同部分中食物的存在與否而發(fā)生。而且，在具體的消化道器官的近端的運(yùn)動行為可能與其遠(yuǎn)端的行為不同，如在十二指腸(小腸的起始端)和回腸(小腸的末端)。
本文所用“進(jìn)食模式”、“進(jìn)食模式行為”和“分段”意思相同，都指動物(包括人)在攝取食物時正常產(chǎn)生的消化道的小腸的收縮和松弛的持續(xù)模式。消化道的進(jìn)食模式促進(jìn)所攝取的食物通過消化道，使?fàn)I養(yǎng)被提取和吸收，未吸收的物質(zhì)作為廢物最后被排出。消化道的進(jìn)食模式一般在攝取食物后數(shù)分鐘內(nèi)開始，并會產(chǎn)生飽腹感即吃飽的感覺。因此，消化道的進(jìn)食模式的飽腹感通常告訴個體可以結(jié)束進(jìn)食。個體早在大腦具有分析血液中營養(yǎng)含量(在食物被消化數(shù)小時后發(fā)生的一個分離的過程，這個過程將產(chǎn)生渴望獲得維持健康的特殊水平所需的特異營養(yǎng)如蛋白質(zhì)、糖類、鹽類和脂肪的信號)的機(jī)會之前就有飽腹感。
對于各器官，進(jìn)食模式各有特征且不相同，即使在消化道的同一器官，在不同的位點也不相同。在小腸中，進(jìn)食模式的特征是平滑肌的一系列收縮和松弛，這些行為將腸的內(nèi)容物混合，促進(jìn)食物對口地進(jìn)到腸中，并延遲食物的順行推進(jìn)以增加底物的吸收〔Lundgren等人，Dig.Dis.Sci.，34，264-283(1989)〕。當(dāng)采用Krantis等人〔Can.J.Physiol.Pharmacol.，74894-903(1996)〕的方法進(jìn)行體內(nèi)的測量和記錄時，十二指腸中的消化道行為的進(jìn)食模式的特征是強(qiáng)烈的機(jī)能亢奮模式，而同時在胃竇中，進(jìn)食模式的特征是可測量的抑制或所記錄的組織行為的下降。此進(jìn)食模式行為代替了消化道行為的“禁食”模式(見下面)，后者發(fā)生在食物已被推過消化道進(jìn)行營養(yǎng)提取之后。進(jìn)食模式活動性主要由自主神經(jīng)末捎經(jīng)由主要迷走神經(jīng)輸入激活，以及(但程度較小)由中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)控制〔參見，Yoshida等人，J.Pharmacol.Exp.Therap.，256272-278(1991)；Tanaka等人，J.Surg.Res.，53588-595(1996)；Chung等人，Can.J.Physiol.Pharmacol.，701148-1153(1992)〕。自主神經(jīng)的過度激活加速進(jìn)食模式的開始以及增加了進(jìn)食模式的持續(xù)時間，同時增加了消化道的擴(kuò)散的行為的頻率和幅度〔Hall等人，Am.J.Physiol.，250G501-510(1986)；Johnson等人，Am.J.Surg.，16780-88(1994)，以及下面的實施例〕。如上面所述，現(xiàn)在可使用適當(dāng)量的單端孢霉烯霉菌毒素(如DON)以刺激消化道活動性的進(jìn)食模式。
消化道運(yùn)動行為的“禁食模式”或“禁食周期運(yùn)動模式”指在沒有攝取食物或在攝取食物前，當(dāng)被攝取的食物沒有被推進(jìn)到胃和腸中時消化道的運(yùn)動行為。在十二指腸(小腸的起始端)中，消化道運(yùn)動行為的禁食模式的特征為自發(fā)的、無規(guī)則的收縮和松弛的交替周期(“組合”行為)和相對的靜止周期(“組間”行為)。具有交替的組合和組間行為的十二指腸的禁食模式的例子顯示在圖5中的消化道活動性的早期記錄部分(在t＝0到t＝30分鐘之間)。在回腸(小腸末端)中，禁食模式的特征為隨機(jī)的收縮和/或松弛運(yùn)動行為或者通常處于靜止?fàn)顟B(tài)。食物的攝取打斷了消化道活動性的禁食模式并刺激其進(jìn)食模式的持續(xù)行為。
直到最近仍沒有準(zhǔn)確測量和表征消化道活動性，在實驗條件下僅能測量收縮或松弛中的一種行為的方法。但是，最近，Krantis及其合作者發(fā)展了一種同時測量胃腸道的各種器官的消化道活動性的收縮和松弛行為的方法，該方法使用能在體內(nèi)粘附到消化道器官的不同位置上的小型可彎曲的箔壓力傳感器〔參見，Krantis等人，Can.J.Physiol.Pharmacol.，74894-903(1996)〕。在此方法中，粘附在器官上的傳感器的導(dǎo)線與計算機(jī)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)相連(見圖1)。Krantis等人的方法可使用體內(nèi)、離體(器官放在體腔外)和體外(組織從消化道器官中分離出來)方法對消化道進(jìn)行藥理學(xué)、神經(jīng)學(xué)和生理學(xué)的研究(見下面的實施例)。同時在消化道器官以及在同一器官的不同位點記錄收縮和松弛的能力提供了更準(zhǔn)確的消化道活動性特征，包括消化道活動性的不同模式，以及食物和各種化學(xué)化合物對這種模式的影響。
在禁食狀態(tài)下，消化道具有周期性的運(yùn)動行為，即周知的“MMC”、“遷移性運(yùn)動復(fù)合(complex)”或“遷移性肌電復(fù)合”。MMC與腸內(nèi)容物的消化間推進(jìn)有關(guān)，它涉及連續(xù)的刺激性和抑制性神經(jīng)元的次第激活，以擴(kuò)散源于胃止于回腸的收縮和松弛周期。一個MMC周期由3個不同階段組成階段I是靜止階段；階段II是行為無規(guī)律強(qiáng)化(spiking)階段；階段III是短期的行為快速強(qiáng)化爆發(fā)階段。MMC提供一種基本的內(nèi)在運(yùn)動模式，這種模式以小腸的“主婦(housekeeper)”形式起作用。例如，各MMC周期高度推進(jìn)的階段III運(yùn)動行為掃除了腸腔，清除腸中的殘留物以防止細(xì)菌過度生長、倒流以及腸分泌物的積聚〔Caenepeel等人，Dig.Dis.Sci.，341180-1184(1989)〕。采用Krantis等人(1996)的方法，現(xiàn)已清楚腸活動性可包括平滑肌的收縮和松弛。沒有食物時，腸的消化道活動性禁食模式的“組合”行為表現(xiàn)為與傳統(tǒng)地歸于MMC階段III的運(yùn)動行為的相同類型相符。腸腔中存在食物時，誘導(dǎo)了消化道運(yùn)動行為由禁食模式轉(zhuǎn)變?yōu)檫M(jìn)食模式。
Krantis等人(1996)的方法還使人們能夠揭示稱為單端孢霉烯或單端孢霉烯霉菌毒素的化合物對消化道活動性的作用模式。如實施例1和2所示(下文)，單端孢霉烯4-脫氧瓜萎鐮毒素(DON)在消化道的外部位點起作用，刺激消化道活動性的進(jìn)食模式，它特征性地出現(xiàn)在攝取食物后，產(chǎn)生飽腹感(即吃飽的感覺)。這些發(fā)現(xiàn)提供了解釋已充分記錄的人和其他動物食用被產(chǎn)生DON或其他單端孢霉烯的霉菌種類污染的農(nóng)作物后的厭食或拒絕進(jìn)食行為的機(jī)制。本發(fā)明提供了一種治療肥胖癥的方法，該方法利用單端孢霉烯化合物能誘導(dǎo)消化道活動性的進(jìn)食模式并產(chǎn)生飽腹感的能力。本文所述的治療肥胖癥的方法包括給予單端孢霉烯或起類似作用的化合物，該化合物刺激消化道活動性的進(jìn)行模式，從而產(chǎn)生飽腹感。感覺到吃飽，個體就會產(chǎn)生停止進(jìn)食的信號。當(dāng)給予的化合物的循環(huán)水平下降時，飽腹感也將減少，該個體可能會繼續(xù)進(jìn)食。
本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)食物攝取的方法，該方法通過給予介導(dǎo)消化道組織的組合松弛的P2X1嘌呤受體的激動劑或拮抗劑而實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，刺激消化道活動性的進(jìn)食模式的單端孢霉烯(如DON)及其衍生物和類似物實際上在消化道外的位點起作用。信號從遠(yuǎn)離作用位點的位置沿著神經(jīng)途徑傳到消化道中表達(dá)P2X1嘌呤受體的平滑肌細(xì)胞，該受體涉及到消化道活動性的進(jìn)食模式的調(diào)節(jié)(見圖2)。因此，結(jié)合并影響P2X1嘌呤受體的化合物在神經(jīng)途徑的末端起作用，而DON或其他這樣的單端孢霉烯則在上游起作用。根據(jù)本發(fā)明，用于本文所述的方法中的一組化合物由三磷酸腺苷(ATP)類似物組成，該類似物起到P2X1嘌呤受體的激動劑或拮抗劑的作用。如下面所解釋，某些類型的P2X1嘌呤受體激動劑與該受體結(jié)合，并刺激消化道活動性的進(jìn)食模式。P2X1嘌呤受體的這些激動劑可代替單端孢霉烯用來治療肥胖癥。P2X1嘌呤受體的拮抗劑是與受體結(jié)合并將其封阻、從而切斷或減弱進(jìn)食模式的化合物。這些P2X1受體拮抗劑抑制或阻止進(jìn)食模式以及飽腹感的產(chǎn)生，從而可用于延長進(jìn)食時間和促進(jìn)體重增重。
用于本發(fā)明的單端孢霉烯歷史上，單端孢霉烯類化合物曾被認(rèn)為是由各種能污染農(nóng)作物的霉菌產(chǎn)生的有毒的次生代謝產(chǎn)物，因此定義為單端孢霉烯霉菌毒素。動物(包括人)攝取這些受污染的農(nóng)作物可能會產(chǎn)生各種霉菌毒素中毒的病理癥狀，如嘔吐、腹瀉、內(nèi)部器官出血損傷、食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥(ATA)、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血、壞死性咽峽炎、粘膜炎癥、厭食、驚厥、膿毒癥，且在一些情況下導(dǎo)致死亡〔例如可參見Ueno，“單端孢霉烯霉菌毒素霉菌學(xué)、化學(xué)和毒理學(xué)”，Advancesin Nutritional Research 1980，3301-353(1980)〕。
本文所用“單端孢霉烯霉菌毒素”或“單端孢菌霉烯”指以非烯烴的母體或核心化合物單端孢霉烷為基礎(chǔ)的倍半萜類家族中的化合物。所有的單端孢霉烯都是修飾的倍半萜，在第9位和第10位碳原子(C-9和C-10)上含有烯烴(雙)鍵(因此稱為單端孢霉烯)，并且在12位和13位碳原子(C-12和C-13)上形成環(huán)氧環(huán)。因此，單端孢霉烯的特征還包括它是12，13-環(huán)氧單端孢霉烯化合物。Ueno在結(jié)構(gòu)和霉菌特征的基礎(chǔ)上將自然產(chǎn)生的單端孢霉烯霉菌毒素分成4類(例如可參見Ueno，1980，同上)。根據(jù)該分類方案，由瓜萎鐮毒素代表的單端孢霉烯類是在碳8(C-8)上被酮基(氧代-)取代的非大環(huán)狀化合物。除了瓜萎鐮毒素外，“瓜萎鐮毒素相關(guān)”的單端孢霉烯類包括那些自然產(chǎn)生的單端孢霉烯霉菌毒素，如4-脫氧瓜萎鐮毒素(DON)、曲古希克龍、單端孢菌素、3-乙?；撗豕衔牰舅?3-乙酰基-DON)、7-乙酰基脫氧瓜萎鐮毒素、3，15-二乙酰基脫氧瓜萎鐮毒素、4-乙?；衔牰舅?鐮刀菌酮-X)和4，15-二乙?；衔牰舅亍１疚乃谩癉ON”、“4-DON”、“脫氧瓜萎鐮毒素”和“嘔吐毒素”都指具有圖3所述的化學(xué)結(jié)構(gòu)的單端孢霉烯化合物。因此，瓜萎鐮毒素與DON不同之處在于前者在C-4上含有羥基，而后者沒有(4-脫氧)。
雖然當(dāng)攝取足夠多的量的DON能明顯引起嚴(yán)重的和廣泛的中毒發(fā)生，但是，對于低于致死量的中毒，DON仍然被認(rèn)為是效力最小的單端孢霉烯之一〔例如可參見Prelusky等人，Arch.Environ.Contam.Toxicol.，2236-40(1992)；Friend等人，Can.J.Anim.Sci.，66765-775(1986)；Ueno，Developments in Food Science IV，Trichothecenes，Chemical，Biological，and toxicological aspects(Elsevier，Amsterdam，1983)，pp.135-146〕。
使用V79中國倉鼠肺細(xì)胞〔Rogers和Heroux-Metcalf，Cancer Lett.，2039-35(1983)〕或者皮膚腫瘤發(fā)生Sencar小鼠模型(Lambert等人，F(xiàn)ood Chem.Toxicol.，33217-222(1995)〕進(jìn)行肝細(xì)胞介導(dǎo)的突變實驗，可確定DON還是非致突變的。細(xì)胞毒性不是由脫氧核糖核酸(DNA)合成或修復(fù)中的改變介導(dǎo)的〔Bradlaw等人，F(xiàn)ood Chem.Toxicol.，231063-1067(1985)；Robbana-Bamat等人，Toxicology，48155-166(1988)〕。
DON似乎沒有進(jìn)行大范圍的肝代謝，而且易于且主要在尿中被排出。也已在尿中發(fā)現(xiàn)衍生物脫氧瓜萎鐮毒素葡糖苷酸酯(glucuranide)和脫環(huán)氧DON，這明顯是接受了DON的動物消化道中的微生物的代謝結(jié)果〔例如可參見Worrell等人，Xenobiotica，1925-32(1989)；Lake等人，F(xiàn)ood Chem.Toxicol.，25589-592(1987)〕。而且，正如我們所發(fā)現(xiàn)的，DON和其他單端孢霉烯通過刺激消化道外的對該消化道的肌肉行為具有明顯影響的反應(yīng)而起作用。即DON并不是直接作用于消化道組織的平滑肌或其他結(jié)構(gòu)，也不以對消化道組織產(chǎn)生不利影響來達(dá)到其對消化道活動性的影響。因此，DON和其他瓜萎鐮毒素相關(guān)的單端孢霉烯化合物特別適用于本文所述的治療肥胖癥的方法。結(jié)構(gòu)上不與DON和其他瓜萎鐮毒素相關(guān)化合物相關(guān)的單端孢霉烯也可以用在治療肥胖癥的方法，條件是它們也能刺激消化道活動性的進(jìn)食模式，且其劑量不產(chǎn)生任何不想要的或嚴(yán)重的臨床霉菌性中毒癥狀。
可采用生物學(xué)方法從霉菌培養(yǎng)基中生產(chǎn)或通過化學(xué)合成生產(chǎn)用于本發(fā)明的單端孢霉烯及其衍生物。各種已發(fā)現(xiàn)的污染并在谷類和其他農(nóng)作物上生長的土壤真菌產(chǎn)生單端孢霉烯次生代謝物。這些真菌包括鐮刀菌屬(Fusarium)、單端孢屬(Trichothecium)、木霉屬(Trichoderma)、漆斑菌屬(Myrothecium)、Cyclindrocarpon和葡糖穗霉菌屬(Stachybotrys)(見，Ueno，1980)。從鐮刀菌屬培養(yǎng)基中生產(chǎn)和純化DON和DON的乙酯(acetyl ester)(如3-乙?；鵇ON和15-乙酰基DON)的方法已有所描述〔參見Can.J.Microbiol.，291171-1178(1983)；Miller和Blackwell，Can.J.Bot.，641-5(1986)；Greenhalgh等人，Proceedings of the 6th IUP ACInternational Symposium on Mycotoxins and Phycotoxins137-152(P.S.Steyn，編輯)(Elsevier出版社，Amsterdam，1986)；Miller和Arnison(Can.J.Plant Path.，8147-150(1986)〕。因此，可使用標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)和生產(chǎn)技術(shù)從真菌培養(yǎng)基中生產(chǎn)和抽提出用于本文所述的方法中的各種單端孢霉烯〔例如可參見Ehrlich等人，Biochim.Biophys.Acta，932206-213(1987)；Ueno，1980(同上)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)〕。如上面所述，DON是玉米和小麥的大量的和自然的污染物。因此，也可從受污染的農(nóng)作物中分離出DON和其他單端孢霉烯。或者，可從巴西灌木Baccaris magapotomica和cordfolia中分離出這些化合物〔Kupchan等人，J.Org.Chem.，424221-4225(1997)〕。另外，本發(fā)明提供新的DON衍生物，該衍生物可如下面的實施例部分所描述的由DON或3-乙酰基-DON合成得到。
另外，還可以用產(chǎn)生單端孢霉烯的霉菌來修飾預(yù)先存在的單端孢霉烯。在許多實驗室中已使用細(xì)菌〔Shima等人，Appl.Environ.Microbiol.，633825-3830(1997)〕或鐮刀菌屬菌株進(jìn)行DON及其衍生物的這種生物轉(zhuǎn)化。例如，培養(yǎng)在蛋白胨補(bǔ)充培養(yǎng)基中的F.roseum將3-乙?；撗豕衔牰舅剞D(zhuǎn)化成DON〔Yoshizawa等人，Appl.Micrboil.，2954-58(1975)〕。F.nivale能將DON的第3位碳原子乙酰化，得到3-乙酰基-DON。而且，這些菌株能將7，15-二乙?；?DON去乙酰化，得到7-乙?；?DON。
已周知單端孢霉烯的化學(xué)性質(zhì)，因此可通過化學(xué)或生物化學(xué)的方法合成各種單端孢霉烯化合物。單端孢霉烯是化學(xué)上通過4環(huán)的12，13-環(huán)氧基單端孢霉-9-烯〔tricothec-9-ene)骨架相關(guān)的倍半萜烯醇或酯〔Williams，Arch.Environ.Contam.Toxicol.，18374-387(1989)〕。已報道由于某些和DON有關(guān)的單端孢霉烯由F.tricinctum大量產(chǎn)生并且易于在C-3和C-8位置上被修飾，所以可以以單端孢霉烯T-2毒素(4β，15-二乙酰氧基-3α-羥基-8α-[3-甲基丁酰氧基]-12，13-環(huán)氧基單端孢霉-9-烯)為原材料制備這些化合物(Ehrlich等人，Appl.Environ.Microbiol.，50914-919(1985)；Udell等人，Z.Naturfarsch，44660-668(1989)〕。T-2的C-3羥基的去除涉及T-2先轉(zhuǎn)變成3-苯基硫羰碳酸酯，然后用氫化三-n-丁基錫還原此中間物，得到3-脫氧-T-2。這種方法已被別人用來制備3-脫氧蛇形毒素和4-脫氧疣孢毒素〔Schuda等人，J.Nat.Prod.，47514-519(1984)〕。
還已顯示，為了產(chǎn)生C-8的氧代官能度(即DON相關(guān)的單端孢霉烯)，用二氧化硒氧化T-2和脫氧-T-2〔Bamburg等人，Tetrahedron，243329-3336(1968)〕。通過將C-8酮引入T-2毒素中產(chǎn)生其他的衍生物，如THP-7-DON(四氫吡喃基-7-DON)和DIDON(7-二脫氧瓜萎鐮毒素)〔Bamburg等人，1968)。通過首先制備3-THP-T-2三醇和3-脫氧-T-2三醇，然后用二氧化錳(MnO2)將它們氧化可制得上述衍生物〔Warpehoski等人，J.Org.Chem.，472897-2900(1982)〕。不可能通過氧化T-2四醇來制備7-DON，因為競爭性的裂環(huán)反應(yīng)和T-2四醇在反應(yīng)溶劑二氯甲烷中的低溶解性的緣故。為了由THP-T-2三醇制備THP-2-DON，MnO2氧化是唯一可能的方法，由于用乙酸作為二氧化硒氧化反應(yīng)的溶劑，四氫吡喃基將被去除。MnO2氧化反應(yīng)中的副產(chǎn)物是具有15-甲醛官能度的單端孢霉烯。
DON相關(guān)化合物的鑒定可采用質(zhì)譜、NMR(核磁共振)光譜學(xué)、紅外光譜學(xué)、茴香醛染色和TLC(薄層層析)鑒定DON相關(guān)的單端孢霉烯化合物，以檢測DON或其他單端孢霉烯一種或多種結(jié)構(gòu)特征的存在。
所有DON相關(guān)的單端孢霉烯具有顯示期待的由C-13a和C13b質(zhì)子產(chǎn)生的AB偶合模式以及C-10(Cole and Cox)在6.5ppm的質(zhì)子的NMR光譜，Handbook of ToxicFungal Metabolites(Acedemic出版社，New York，1981)，pp.152-263。
采用茴香醛染色，8-氧基取代的(酮)單端孢霉烯形成檸檬黃的加合物，而在8位缺乏該酮基的化合物形成紅色或褐色的加合物。
在紅外光譜中，8位上的羰基在1660-1680cm-1吸收。這證明單端孢霉烯保留了α、β不飽和的酮官能度。
DON的乙酰化類似物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)應(yīng)顯示在進(jìn)行該方法期間由乙?；蛞宜岬膿p失所預(yù)見的母離子和碎片離子。
使用在本文所述的方法中的各單端孢霉烯較佳是被純化直到在薄層層析(TLC)上以分離的點遷移?？刹捎酶邏阂合嗌V(HPLC)進(jìn)一步確定均一性，洗脫出來的特定的單端孢霉烯應(yīng)是單一的峰。也可使用GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜)分析確定純度，例如，各類型的純化的乙酰化單端孢霉烯顯示單一的峰(Cole and Cox，1981，同上)。
如下面所討論，本發(fā)明還包括這樣的化合物其一種或多種上述的DON或其他單端孢霉烯的結(jié)構(gòu)特征已被修改甚或被除去，以制備也可用于本發(fā)明組合物和方法的衍生物化合物。
單端孢霉烯衍生物和類似物DON可以使用在本發(fā)明的方法中，如治療肥胖癥，但是使用的劑量必須是刺激消化道活動性的進(jìn)食模式而不引起其他任何不要的副作用，包括霉菌毒素中毒的臨床癥狀之一——嘔吐。雖然可采用標(biāo)準(zhǔn)的方法確定單端孢霉烯(如DON)的藥學(xué)上可接受的劑量，但理想的是，在單端孢霉烯化學(xué)結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生一種變體，以得到一種在可能的不適當(dāng)?shù)母弊饔梅矫娓鼫睾偷慕Y(jié)構(gòu)相關(guān)化合物。這種“溫和的單端孢霉烯”(如“溫和的DON”)是原始單端孢霉烯的衍生物，被期待與該原始的單端孢霉烯在刺激消化道活動性的進(jìn)行模式中是可比的或更有效。因此，在治療肥胖癥的方法中，較佳的衍生單端孢霉烯(如DON衍生物)具有一種或多種改進(jìn)的特性，并優(yōu)于已知的單端孢霉烯(如DON)。
例如，DON的各種結(jié)構(gòu)特征提供了特別具有吸引力的候選化合物的用于修飾的位點，以形成DON衍生物。有利的是，DON是相對小的分子，它具有有限量的可用于改變此化合物的活性的修飾位點。這些位點包括C-9和C-10間的不飽和鍵、12，13-環(huán)氧基環(huán)的存在、單端孢霉烯的結(jié)構(gòu)核環(huán)上的羥基或其他基團(tuán)的存在以及C-3、C-4和C15上發(fā)生的羥基或其他取代基的取代。另外，空間填充的分子模型揭示了單端孢霉烯核環(huán)的幾個特征，這提供了哪個位點被修飾能產(chǎn)生有用的DON衍生物的額外信息。A環(huán)上的氧取代基(C-8酮和C-7羥基)使分子的這一側(cè)比沒有取代基時或存在異戊酰氧基支鏈(如T-2毒素)時更親水。在核環(huán)的適當(dāng)位置上存在的羥基改變了化合物的生物活性。例如，4-脫氧瓜萎鐮毒素(DON)和瓜萎鐮毒素之間的差異在于DON在C-4上存在羥基。
單端孢霉烯結(jié)構(gòu)與單端孢霉烯抑制蛋白質(zhì)合成的特性之間的關(guān)系的研究還揭示了幾種可能用于制備本發(fā)明方法中使用的DON或其他單端孢霉烯的衍生物的有趣的特征(參見，Erlich等人，Biochim.Biophys.Acta，923206-213(1987)；Rotter等人，Env.Health，481-34(1996)〕。在抑制蛋白質(zhì)合成方面，最有效的單端孢霉烯在含有8-氧代取代基的A環(huán)上缺乏取代基，或者具有酯化的羥基。當(dāng)存在C-7羥基時，C-8酮上可產(chǎn)生氫(H)鍵，但這使得該環(huán)在空間上更具張力。H鍵還可出現(xiàn)在C-15和C-7上的羥基間。去除C-7羥基使C-15取代基在單端孢霉烯遠(yuǎn)離12，13-環(huán)氧化物的一側(cè)暴露出來。另外，C-7羥基肯定對單端孢霉烯的效力作出貢獻(xiàn)，因為含有C-7羥基的瓜萎鐮毒素的效力是不含有C-7羥基的7-DON的效力的一個數(shù)量級。因此，可以理解DON和其他單端孢霉烯(尤其是瓜萎鐮毒素相關(guān)的單端孢霉烯)上可比的或相應(yīng)的位點可被認(rèn)為是用于產(chǎn)生用在本發(fā)明組合物和方法中的DON或其他單端孢霉烯的衍生物的修飾位點。
用于本發(fā)明組合物和方法中的單端孢霉烯DON的衍生物的例子包括本文所指的化合物，包括3-乙?；?DON(C17H22O7)、異亞丙基DON(3-羥基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮，C18H24O6，EN 139491)、異亞丙基-3-乙?；?DON(即3-乙酰氧基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C20H26O7，EN139492)、DON碳酸酯(即3-羥基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯，C16H18O7，EN 139494)、3-乙酰基-DON碳酸酯(即3-乙酰氧基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯C18H20O8，EN 139495)、DON-芐基縮醛(即3-羥基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C22H24O7，EN 139497)和3-乙?；鵇ON亞芐基縮醛(即3-乙酰氧基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C24H26O8，EN 139496)(圖3A和3B)。這些化合物還可用作“母體”化合物或原材料，可被進(jìn)一步修飾得到另外的新的DON衍生物，這些新的衍生物較佳具有一種或多種改進(jìn)的特性，這些特性將使新的衍生物化合物與其母體化合物或其他已知單端孢霉烯相比更佳用于本文所述的調(diào)節(jié)消化道活動性的組合物和方法中。
還可理解的是，DON或其他單端孢霉烯的代用品不必是結(jié)構(gòu)相關(guān)的衍生物化合物，因為任何以產(chǎn)生最小或不產(chǎn)生不利副作用的劑量調(diào)節(jié)消化道活動性的化合物都可用在本文所述的方法中。
根據(jù)本發(fā)明，單端孢霉烯類似物是模擬單端孢霉烯一種或多種特征和所需的生化活性的任何化合物，而不論該化合物是否具有單端孢霉烯的結(jié)構(gòu)特征。如DON，用于本發(fā)明方法的單端孢霉烯類似物，通過在消化道的外部、在外周起調(diào)節(jié)消化道活動性的作用。尤其是，用于本文所述的治療肥胖癥的方法中的單端孢霉烯類似物在消化道以外刺激消化道活動性的進(jìn)食模式，并從而產(chǎn)生停止進(jìn)食的飽腹感。這些單端孢霉烯類似物可能與DON或其他單端孢霉烯分子(見上)、無機(jī)分子、與單端孢霉烯無關(guān)的有機(jī)分子、生物分子(如核苷酸、核酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì))或者它們的組合在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的或由它們從化學(xué)上衍生得到的。可采用本文所述的一種或多種篩檢單端孢霉烯活性的方法確定某具體的化合物是否是本發(fā)明所述的單端孢霉烯類似物。
P2X1嘌呤受體(消化道神經(jīng)遞質(zhì)受體)的激動劑和拮抗劑在消化道組織中發(fā)現(xiàn)的與嘌呤受體的P2X1亞型結(jié)合的化合物還也可用在本文所述的方法中。P2X1嘌呤受體是消化道平滑肌中的神經(jīng)遞質(zhì)受體，它涉及到消化道活動性的控制(見實施例和圖2)。三磷酸腺苷(ATP)是P2X1受體的天然配體。在小腸的十二指腸和回腸中刺激嘌呤能運(yùn)動神經(jīng)元能釋放出ATP。ATP最初作為P2X1嘌呤受體的激動劑，即ATP分子首先與平滑肌細(xì)胞中的P2X1嘌呤受體結(jié)合，發(fā)出抑制平滑肌的信號，之后平滑肌松弛。如上面所述，這種松弛是消化道活動性的一部分，可以采用Krantis等人(1996)的方法檢測和測量。但是，ATP分子看起來持續(xù)結(jié)合在P2X1嘌呤受體上，從而使該肌肉對由ATP進(jìn)一步的松弛脫敏，因為其他ATP分子不能與該受體結(jié)合以產(chǎn)生進(jìn)一步的松弛事件信號(Smits等人，Br.J.Pharmacol.，303695-703(1996)〕。因此，消化道運(yùn)動行為的P2X1受體介導(dǎo)的途徑被封阻，導(dǎo)致可觀察的所有消化道運(yùn)動行為的減弱，這種減弱不受額外的ATP的影響(快速減敏)。因此，ATP，一種阻止任何進(jìn)一步松弛的“脫敏”激動劑，對于消化道活動性的進(jìn)食模式和禁食模式都起關(guān)鍵作用。ATP能與所有的嘌呤能受體結(jié)合。合成的ATP類似物α，β-亞甲基ATP也是一種脫敏激動劑，但是對嘌呤受體的P2X受體有特異性。此外，由于嘌呤受體的P2X1亞型是涉及消化道活動性松弛行為的受體的P2X種類，因此使用α，β-亞甲基ATP進(jìn)行的研究提供了準(zhǔn)確揭示消化道活動性中松弛的特異性神經(jīng)生理學(xué)特征的數(shù)據(jù)。
與P2X1受體的脫敏激動劑如ATP或α，β-亞甲基ATP相反，P2X1受體的“非脫敏”激動劑具有提供連續(xù)的刺激消化道運(yùn)動行為的松弛所需的受體結(jié)合特性。尤其是，P2X1受體的非脫敏激動劑是一種結(jié)合但不封阻該受體的化合物。非脫敏激動劑的各分子能結(jié)合P2X1受體，引起松弛，然后解離出來，被另外的同類分子所取代，該取代的分子又產(chǎn)生另外的松弛信號等。因此，只要P2X1受體的非脫敏激動劑的分子可以與P2X1受體結(jié)合，它就能刺激松弛事件。P2X1受體的非脫敏激動劑刺激消化道活動性的進(jìn)食模式。因此，P2X1受體的非脫敏激動劑是本文所述的治療肥胖癥的方法中使用的DON、其他單端孢霉烯或單端孢霉烯類似物的代用品。
P2X1受體的脫敏激動劑(見上)或拮抗劑封阻該受體并減弱消化道的活動性?？梢允褂眠@些化合物阻止或抑制消化道活動性的進(jìn)食模式，從而抑制飽腹感。抑制飽腹感將促進(jìn)更長的進(jìn)食時間，因為吃飽的感覺沒有被激發(fā)。根據(jù)本發(fā)明，對消化道組織中的P2X1起作用受體的拮抗劑(如2′，3′-O-(2，4，6-三硝基苯基)腺苷5′-三磷酸(“TNP-ATP”)或脫敏激動劑(如α，β-亞甲基ATP)可用在延長進(jìn)食時間和增加體重增重的方法中。這個目標(biāo)特別有用于肉類和家禽工業(yè)，在這些工業(yè)中，增加家畜的體重或減少將動物飼養(yǎng)到可銷售的重量所需的時間在商業(yè)上是需要的并且是有利的。
已知許多ATP的結(jié)構(gòu)類似物和它們的一些藥理學(xué)特性和受體結(jié)合特性〔參見Harden等人的評論，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，35541-579(1995)〕這些化合物可作為進(jìn)一步篩檢其與P2X1亞型嘌呤受體結(jié)合以及影響消化道活動性的能力的候選化合物?；蛘?，可進(jìn)一步修飾這些已知的ATP類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以制備其他的可篩檢其作為用在本文所述的各種方法中的P2X1受體的非脫敏激動劑、脫敏激動劑或拮抗劑的能力的ATP類似物。
ATP類似物TNP-ATP是一種P2X嘌呤受體拮抗劑，已在離體使用它作為P2X亞型選擇性拮抗劑(全組織的IC50在μM范圍內(nèi))，以確定P2X1和P2X31同聚體型和P2X2/3異聚體型嘌呤受體的作用〔參見，Lewis等人，Br.J.Pharmacol.，1241463-1466(1998)；Virginio等人，Mol.Pharmacol.，53969-973(1998)〕。已報道P2X3受體僅在感覺神經(jīng)元中表達(dá)〔Evans等人，Semin.Neurosci.，8217-223(1996)〕。如本文所示，可用TNP-ATP拮抗劑來顯示P2X1亞型嘌呤受體在調(diào)節(jié)體內(nèi)消化道活動性的進(jìn)食模式中的直接參與。由于TNP-ATP能阻止由DON、其它單端孢霉烯化合物及其衍生物誘導(dǎo)的消化道活動性的進(jìn)食模式，因此，此P2X1拮抗劑本身可用在本發(fā)明延長飽腹感的產(chǎn)生和增加食物攝取的方法中。這些方法特別有用于生產(chǎn)用于銷售的家畜和家禽。此外，可用TNP-ATP作為生產(chǎn)具有提高或改進(jìn)的影響消化道活動性的特性的衍生物化合物的母體分子。
可作為本發(fā)明的P2X1受體的激動劑或拮抗劑的來源的另一類化合物是最初由Bohme等人描述的蒽醌(anthroquinone)-磺酸衍生物〔Chromatogr.，69209-213(1972)〕。這些衍生物可看做是ATP類似物，并包括三嗪基部分，已顯示能拮抗豚鼠中的某些ATP介導(dǎo)的作用〔參見，Kerr和Krantis，Proc.Austr.Physiol.Soc.，10156P(1979)〕。所期望的是，這些能結(jié)合P2X1受體和調(diào)節(jié)(即刺激或抑制)消化道活動性的模式的蒽醌-磺酸衍生物可用在本文所述的各種方法中。
另一研制用于治療肥胖癥的P2X1受體的非脫敏激動劑的方法是從磺酰脲中研制化合物，例如，使用已知模擬二磷酸酯或三磷酸酯中的電荷分布但從沒與腺苷分子結(jié)合過的獨特的創(chuàng)新的酸性官能度取代母體化合物(腺苷5′-四氫三磷酸酯)的三磷酸酯部分。重要的是，腺苷-SO2-NH-CO部分可在聚合物基底(base)上用組合化學(xué)得到(Chiron Technologies)。結(jié)合P2X1受體并刺激消化道活動性的進(jìn)食模式的化合物可用在本發(fā)明治療肥胖癥的方法中。篩檢方法可采用許多方法鑒定那些用于本發(fā)明方法和組合物的單端孢霉烯、單端孢霉烯類似物、非脫敏P2X1受體激動劑、P2X1受體拮抗劑和其他調(diào)節(jié)消化道活動性的化合物。
已制備檢測DON和15-乙?；鵇ON的特異性抗體，并在ELISA(酶聯(lián)免疫檢測)中使用〔參見，Sinha等人，J.Agric.Food Chem.，431740-1744(1995)〕。因此，DON和其他單端孢霉烯的抗體可使用在各種免疫學(xué)方法中(如ELISA)，以快速檢測出也可用在本文所述的方法中的衍生物或相關(guān)的單端孢霉烯。
已使用Vero(Green Monkey的腎)細(xì)胞、鼠紅白血病(MEI)細(xì)胞和大鼠脾淋巴細(xì)胞的離體細(xì)胞培養(yǎng)物測定大量的12，13-環(huán)氧基單端孢霉烯的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。例如，使用這些細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)檢測各種12，13-環(huán)氧基單端孢霉烯抑制肽基轉(zhuǎn)移酶并因此抑制蛋白質(zhì)的合成的活性的能力〔參見，例如。Erlich和Daigle，Biochim.Biophys.Acta，923206-213(1987)；Rotter等人，J.Toxicol.Env.Health，481-34(1996)〕。具體是單端孢霉烯結(jié)合到真核核糖體的60S亞基上，并因此干擾肽基轉(zhuǎn)移酶。單端孢霉烯倍半萜上的結(jié)構(gòu)取代的程度影響結(jié)合到肽基轉(zhuǎn)移酶的性能，并因此影響抑制此酶的程度(Erlich等人，1987；Rotter等人，1996)。
可使用上述細(xì)胞培養(yǎng)物來檢測或篩檢可能用在本文所述的治療組合物和方法中的未知活性的化合物。這些以細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測和篩檢方法特別有用于檢測和表征各種具有未知活性的單端孢霉烯或衍生物化合物，如新近合成的或發(fā)現(xiàn)的具有已知單端孢霉烯(如DON或其他瓜萎鐮毒素相關(guān)的單端孢霉烯)的結(jié)構(gòu)特征的化合物。也可使用這些細(xì)胞培養(yǎng)物篩檢其他的在結(jié)構(gòu)上與已知的單端孢霉烯不相關(guān)的化合物。
在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的篩檢方法中，可將各試驗化合物與一種或多種已知單端孢霉烯(如DON)的標(biāo)準(zhǔn)制品比較，該標(biāo)準(zhǔn)制品一般配制在原液(10μg/ml)在二甲亞砜中的溶液中。調(diào)整二甲亞砜的濃度，以使其在與細(xì)胞培育期間總是1％(v/v)以下。單端孢霉烯室溫(27℃)下一般能保持穩(wěn)定達(dá)到一年。
較佳的是，還可采用Krantis等人(1996)的方法篩檢和表征候選化合物，該方法使用小型箔壓力傳感器和計算機(jī)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)準(zhǔn)確和同時記錄消化道中平滑肌的松弛和收縮。這是通過對消化道運(yùn)動性的作用直接篩選化合物的一種方法。如上面所述，Krantis等人(1996)的方法能提供化合物對體內(nèi)、離體或體外消化道活動性的進(jìn)食和禁食模式的影響的真實記錄(見實施例1和2)。這些篩檢或鑒定用于本發(fā)明組合物和方法的新化合物的方法還可包括比較候選化合物對消化道運(yùn)動的影響與已知單端孢霉烯(如DON)對消化道運(yùn)動的影響。
用于P2X1激動劑或拮抗劑的結(jié)合實驗和篩檢還可檢測或篩檢候選化合物(也稱為“引導(dǎo)”或“試驗”化合物)結(jié)合或封阻嘌呤受體的P2X1亞型的能力，該受體是表達(dá)在平滑肌上的嘌呤能受體，且明顯地涉及到小腸消化道活動性的松弛行為的控制〔例如可參見Virginio等人，Mol.Pharmacol.，53969-973(1998)；Humphrey等人，Naunyn Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.，352585-596(1995)；Bo等人，Br.J.Pharmacol.，1121151-1159(1994)和G.Bumstock的評論，Ciba Dound Symp.，1981-28(1996)(P2受體類)和A.Surprenant，的評論，Ciba Dound Symp.，198208-219(1996)(天然的或克隆的P2X受體的功能特性)〕。還可將化合物結(jié)合P2X1受體的能力與已知受體配體(如ATP或ATP類似物，如α，β-亞甲基ATP或TNP-ATP)結(jié)合P2X1受體的能力進(jìn)行比較。
用于胞外刺激的細(xì)胞表面受體的成功的放射性標(biāo)記依賴于是否能得到具有高親和力、穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)結(jié)合的特異性的配體。直到最近，還沒有P2嘌呤受體的特殊亞型的選擇性拮抗劑，而顯示能競爭性抑制P2嘌呤受體的幾種化合物(例如，蘇拉明，活性藍(lán)2)僅以微摩爾的親和力起作用，并且因為它們與許多其他的蛋白質(zhì)相互作用，所以缺乏特異性。同樣的問題是結(jié)合實驗是在如用膜的條件下進(jìn)行，而這些條件與那些可測量受體的生物學(xué)反應(yīng)的條件非常不同。因此，難于確定結(jié)合常數(shù)和受體活性常數(shù)之間的直接關(guān)系。由于P2嘌呤受體的激動劑的結(jié)合親和力僅比它們對其他ATP結(jié)合蛋白質(zhì)的親和力稍大一些，所以這種激動劑也存在一些問題，而且它們易受核苷酸水解酶的水解。
在制備膀胱和脈管(vas deferens)平滑肌中已使用[3H]-標(biāo)記的α，β-亞甲基ATP作為P2X嘌呤受體的放射性配體。通常，激動劑結(jié)合親和力與那些在完整組織中觀察到的一致。例如，α，β-亞甲基ATP和2-甲基-S-ATP競爭結(jié)合脈管結(jié)合位點的表觀結(jié)合親和力的差異僅約為30倍，而許多推測其不是P2X激動劑的核苷酸也完全抑制放射性配體結(jié)合。[3H]標(biāo)記的α，β-亞甲基ATP的結(jié)合位點的密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出用其他所有神經(jīng)遞質(zhì)受體所觀察到的。
可分離出表達(dá)P2X1受體的腸平滑肌，并將該分離出來的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基中?？蓪⑦@些培養(yǎng)基用于能作為P2X1受體的激動劑或拮抗劑的引導(dǎo)或候選化合物的結(jié)合實驗中?；蛘?，可使用表達(dá)P2X1受體的胚胎腎293細(xì)胞〔Virginio等人，Mol.Pharmacol.，53969-973(1998)〕。這種受體亞型還在血小板和原巨核細(xì)胞系〔Vial等人，Thromb.Haemost.，781500-1504(1997)〕以及在HL60細(xì)胞〔Buell等人，Blood，872659-2664(1996)〕中表達(dá)。因此，在培養(yǎng)基中表達(dá)P2X1受體的任何細(xì)胞(包括重組修飾的細(xì)胞)可用于篩檢P2X1受體的激動劑和拮抗劑。
已純化(Valera等人，Nature，371516-519(1994)〕和克隆〔Sun等人，J.Biol.Chem.，27311544-11547(1998)〕P2X1嘌呤受體。已描述重組P2X1受體的結(jié)合特性〔Michel等人，Br.J.Pharmacol.，1181806-1812(1996)〕。純化的P2X1受體可通過多種連接劑中的任何一種連接到固體基質(zhì)上，如微滴定板的孔的表面、樹脂顆粒的表面或檢測芯片的表面上。這種安排可以檢測非常少量的化合物結(jié)合該受體的能力。此外，可利用的篩檢微滴定板和檢測芯片中的樣品的自動操縱技術(shù)使得熟練的專業(yè)人員在數(shù)小時內(nèi)能準(zhǔn)確和連續(xù)地篩檢成百或成千的化合物。
可采用體外實驗、離體消化道器官實驗和/或體內(nèi)消化道活動性實驗〔例如，采用Krantis等人的方法(1996)〕進(jìn)一步評估在一種上述篩檢方法中確定具有活性的引導(dǎo)或候選化合物(見實施例1)。在離體消化道器官浴實驗中，從動物體內(nèi)割下消化道器官部分(例如小腸的十二指腸、空腸和回腸片段)，將其放在生理性維持培養(yǎng)基中，如在生理體溫的Krebs溶液中。通常將單個消化道片段固定，以記錄循環(huán)的肌肉活性，較佳在兩個連接點記錄?？蓪⒒衔镒⑸?、混合或涂覆到切割下來的消化道器官片段，測量該化合物對該器官活動性的影響。在離體消化道器官中，暴露出被麻醉的動物的消化道器官，但維持其完整和處于生理條件。然后可將試驗或引導(dǎo)化合物方便地直接涂(局部)在該器官上，監(jiān)測該化合物對該器官的影響。在體內(nèi)試驗中，可將化合物注射到動物體內(nèi)，或使動物攝取該化合物，然后直接測量該化合物對消化道活動性的影響。
檢測或篩檢用于本文所述組合物和方法中的化合物的來源包括(沒有限制)小分子集合，組合庫，從真菌、細(xì)菌和各種胚胎細(xì)胞培養(yǎng)基或發(fā)酵液中得到的生長介質(zhì)或細(xì)胞抽提物，和從人和其他動物得到的生物體液、組織和血清樣品。
治療方法、藥學(xué)組合物、給藥模式本發(fā)明提供用于治療肥胖癥的方法中的藥學(xué)組合物。本發(fā)明其他的組合物用于促進(jìn)動物的體重增重，這對于飼養(yǎng)銷售用的商業(yè)家畜和家禽特別有用。人和其他脊椎動物具有相同的控制消化道活動性方面的基本消化道神經(jīng)生理學(xué)。因此，可采用本文所述的方法治療的動物毫無限制地包括人和其他靈長動物、豬、牛、綿羊、鳥(家禽和其他鳥類)、馬、貓、狗和嚙齒動物(包括倉鼠、豚鼠、大鼠和小鼠)。本文所述的所有給予其他動物的藥學(xué)組合物和組合物含有有效量的所述化合物，以達(dá)到所需的對消化道活動性的影響而沒有產(chǎn)生顯著的或不需的副作用。
根據(jù)本發(fā)明，通過給予人或其他動物有效量的DON或其他單端孢霉烯、單端孢霉烯衍生物、單端孢霉烯類似物或P2X1嘌呤受體的非脫敏激動劑以刺激或激活消化道活動性的進(jìn)食模式并從而產(chǎn)生飽腹感而治療肥胖癥。相反，可以給予人或其他動物以P2X1嘌呤受體拮抗劑(如TNP-ATP)或脫敏激動劑(如α，β-亞甲基ATP)，以阻止或抑制消化道活動性的進(jìn)食模式，并從而延長進(jìn)食時間，促進(jìn)體重增重。
可以多種形式中的任何一種特別是適合于預(yù)期的給藥模式的形式(包括固體、半固體或液體劑型)給予這些組合物，例如，片劑、錠劑、丸劑、膠囊、粉末、栓劑、液劑、散劑、水性或油性懸浮液、糖漿、酏劑和水性溶液。較佳的是，該藥學(xué)組合物是適合于準(zhǔn)確劑量的單一給藥的單位劑型，該劑型可以是一劑量的一部分或若干倍，以產(chǎn)生所需的對消化道活動性的影響。如上面所述，這些組合物將包括有效量的所選擇的化合物與藥學(xué)上可接受的載體和/或緩沖液的混合，另外，可包括其他無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的醫(yī)學(xué)制劑或藥學(xué)制劑、載體、稀釋劑、填充劑和配制佐劑或它們的組合。在液體混合物或制品中，可使用藥學(xué)上可接受的緩沖液，如磷酸緩沖鹽溶液。“藥學(xué)上可接受的”指一種不是生物、化學(xué)的物質(zhì)，或者不論如何，與軀體化學(xué)性質(zhì)和代謝不相容的、存在于藥學(xué)組合物中也不對其他任何組分產(chǎn)生不利影響的物質(zhì)。
對于固體組合物，常規(guī)的無毒的固體載體包括例如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。藥學(xué)上可接受的液體組合物可通過如在賦形劑(如水、鹽水、水性右旋糖、甘油、乙醇等)中溶解和分散調(diào)節(jié)本文所述的消化道活動性的活性化合物和優(yōu)選的藥學(xué)佐劑，從而形成溶液或懸浮液而制得。如果需要，給藥的藥學(xué)組合物還可含有少量的無毒輔佐物質(zhì)(如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑等)，例如，醋酸鈉、油酸三乙胺。
對于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員，制備劑型的標(biāo)準(zhǔn)方法是已知的或?qū)⑹敲黠@的〔例如可參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin編輯，Mack PublishingCo.，Easton，PA，最后一版〕。對于DON和其他單端孢霉烯，劑量為不產(chǎn)生嘔吐的量。如在動物研究中已證明的那樣，這些低于嘔吐(sub-emetic)的劑量是易于確定的(見實施例1和2)。
本發(fā)明組合物的主要活性成分是影響(調(diào)節(jié))消化道活動性的單端孢霉烯、單端孢霉烯類似物、P2X1受體的激動劑或P2X1受體的拮抗劑。當(dāng)攝入單端孢霉烯(如DON)時，它們明顯地能發(fā)揮它們對消化道活動性的活性。因此，本發(fā)明優(yōu)選的組合物是被配制成口服給藥。還可腸道外給予這些化合物，例如，通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)注射給藥。
對于優(yōu)選的口服給藥，本發(fā)明組合物可被配制成含有影響消化道活動性的化合物以及還含有稀釋劑、分散劑和/或表面活性劑的細(xì)微粉末或顆粒。口服組合物還可以水或糖漿中的溶液或懸浮液的形式存在，存在于丸劑、片劑、膠囊或干燥狀態(tài)的小袋中，或者存在于可能包括懸浮劑的非水性溶液或懸浮液中。在口服組合物中還可使用結(jié)合劑和潤滑劑。在想要或需要時，可包括增香劑、防腐劑、懸浮劑、增稠劑或乳化劑。片劑和粒劑是優(yōu)選的口服劑型，這些劑型可被包衣。
如果使用，腸道外給藥通常是注射。可注射的制品可以制成常規(guī)的形式，包括液體溶液或懸浮液、適合于注射前配制成溶液或懸浮液的固體，或者制成乳化液。對于大多數(shù)目的，可靜脈內(nèi)注射在藥學(xué)上可接受的緩沖液中的用于調(diào)節(jié)消化道活動性的化合物。但是，將這種化合物制成可能含有逐漸從注射位點上釋放出來的媒染劑的大丸劑也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。腸道外給藥的方法涉及緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)的使用，這樣劑量的穩(wěn)定水平得以維持(例如可參見美國專利3710795號)。
用在本文所述的組合物和方法中用來調(diào)節(jié)消化道活動性的化合物的確切和有效的量對不同的對象將根據(jù)年齡、體重和該對象的總的條件、治療的肥胖程度、具體使用的化合物、給藥的方式等而改變。因此，不能指定可應(yīng)用于所有個體的理想的劑量的確切的量。但是，所期望的是，單端孢霉烯(如DON)通常使用或檢測的量為0.01-100mg/kg體重。此外，選擇用于具體個體的有用的劑量將是低于嘔吐的，即沒有引起該個體嘔吐的劑量。對于市售用的藥學(xué)組合物，可以理解在用于人時，可由健康維護(hù)醫(yī)生根據(jù)美國食物和藥品管理(或類似的機(jī)構(gòu))的標(biāo)準(zhǔn)確定藥學(xué)有效和合適量的單端孢霉烯、單端孢霉烯衍生物、單端孢霉烯類似物、P2X1受體激動劑或P2X1受體拮抗劑。用于動物時，將根據(jù)商業(yè)家畜食物或獸醫(yī)藥品的標(biāo)準(zhǔn)和實際確定和配制恰當(dāng)?shù)慕M合物。
從下述的非限制性實施例將能明白本發(fā)明其他的實施方式和特征。
實施例實施例1下述實施例顯示DON在消化道外的位點起作用，并干擾胃和小腸的特異性內(nèi)在神經(jīng)途徑，產(chǎn)生運(yùn)動行為的改變的模式。這些發(fā)現(xiàn)顯示DON誘導(dǎo)食欲的消失(如動物中的進(jìn)食拒絕所證明的)并支持誘導(dǎo)食欲的這種消失的方法。
正常的胃腸道活動性依賴于消化道壁的內(nèi)在的(腸的)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，以及外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的調(diào)節(jié)性輸入。內(nèi)在的回路使反射作用(如蠕動反射)或復(fù)合模式的誘導(dǎo)行為〔如發(fā)生在禁食模式和分段推進(jìn)的進(jìn)食模式間的消化間的移動性肌電復(fù)合(MMC)〕相協(xié)調(diào)。
檢測了DON對控制大鼠胃和腸消化間自發(fā)的運(yùn)動行為的途徑的影響。即使大鼠沒有嘔吐反射，但它們卻具有與嘔吐相關(guān)的惡心和不舒適〔Andrews，Br.J.Anaesth.，692s-19s(1992)，W.A.Rapley和M.Hirst，Lab.Anim.Sci.的摘要，38504(1988)〕。檢測了低閾值水平的DON對體內(nèi)消化間運(yùn)動模式的影響。從獲得輔助藥學(xué)信息的離體消化道浴實驗中得到額外的信息。
在體重為250-350克的雄性Sprague-Dawley大鼠上進(jìn)行實驗。所有的實驗計劃都根據(jù)渥太華大學(xué)的動物護(hù)養(yǎng)委員會的指南進(jìn)行。
單只大鼠，禁食24小時，但可自由飲水，之后用氟烷(4％)在氧中的混合物將其麻醉。將大鼠放在加熱的凈化桌上的2％氟烷麻醉劑下，以保持其體溫在37℃。暴露出右頸動脈，將PE 50管插入，經(jīng)由連接到IBM數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)上的壓力傳感器(P23ID，Gould Statham，OH)監(jiān)測血壓。用PE 50管插入頸靜脈以進(jìn)行靜脈內(nèi)(i.v.)注射。但是，由于各種藥物的半衰期短，以及為了回避肝的第一輪代謝，動脈內(nèi)給藥常常是必需的。對于通過閉合(close)動脈內(nèi)(i.a.)注射導(dǎo)入藥物的動物，從股動脈插入套管(PE 10管)，反向插入以將針頭放在上面的腸系膜動脈水平處。
進(jìn)行中央剖腹術(shù)，暴露出感興趣的胃腸片段。接著用Vet Bond膠將箔壓力傳感器(Showa N11型，Durham Instruments，Pickering，ON)依次連接到胃竇上(離幽門括約肌2cm)、連接到十二指腸的非腸系膜邊界(離胃腸連接處1-2cm)、以及側(cè)向連接到回腸的非腸系膜邊界(回盲腸連接處)。所有箔壓力傳感器的取向都與肌肉層的縱向平行，這樣使記錄圓周的運(yùn)動行為的環(huán)境最靈敏。接出箔壓力傳感器上的導(dǎo)線并通過3信道口盒將其連接到IBM PC數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)上。Krantis等人(1996)已描述了使用箔壓力傳感器與基于計算機(jī)的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄和分析體內(nèi)活動性的詳細(xì)方法。圖1是此方法記錄消化道活動性的示意圖。手術(shù)結(jié)束后，使大鼠俯臥，剩下的實驗中麻醉劑濃度維持為1％。
采用上述相同的外科方法制備離體器官制品，除了使大鼠仰臥以維持箔傳感器連接位點暴露出來外。這使得可直接將藥物局部給到消化道的絨膜表面上。定時用溫暖的鹽水淋灑暴露的消化道片段，以使其潮濕。
根據(jù)Mckay和Krantis(Can.J.Physiol.Pharmacol.，69199-204(1991)〕的方法制備用于離體消化道器官浴的消化道器官。無痛處死大鼠，迅速取出十二指腸、空腸和回腸近端的片段，小心地清除其中的內(nèi)容物，去除任何腸系膜粘附物，然后將其放在含有下述組成(mM)的Krebs溶液的器官浴中Na+(151.0)、K+(4.6)、Mg2+(0.6)、Ca2+(2.8)、Cl-(134.9)、HCO3-(24.9)、H2PO4-(1.3)、SO42-(0.6)和葡萄糖(7.7)。維持此溶液的溫度為37℃，并用95％O25％CO2連續(xù)供氣，以使pH為7.4。
然后水平放置單條消化道片段，以記錄離腸系膜邊界25mm遠(yuǎn)的兩個連接點的環(huán)狀肌肉活性，各點與將該片段連接到器官浴的底部的蛙心夾(frog heart clip)相對，各點通過聚酯繩連接到Grass等容壓力傳感器(isometric force transducer)上。使用MacLab Macintosh數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Apple Corp.，Toronto，Ontario)直接監(jiān)測由該傳感器檢測到的機(jī)械活性。
各連接點的靜止張力為1克，在用藥物處理前先將片段平衡60分鐘。每15分鐘以及用藥物刺激期間用更新的Krebs浴溶液洗滌器官浴制品。接著的藥物刺激僅在至少5分鐘的平衡后或者直到基本狀況恢復(fù)到靜止張力的90％后檢測。
由IBM數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)獲得、數(shù)字化和保存體內(nèi)和離體記錄的運(yùn)動行為，然后計算運(yùn)動反應(yīng)的幅度和頻率(除了其他可變的以外)(Krantis等人，1996)。根據(jù)其滿足一組六個數(shù)值參數(shù)(分別為收縮和松弛)的能力標(biāo)記合格的反應(yīng)，該參數(shù)是以使用者定義的必須滿足有限時間段的閾值為基礎(chǔ)。在2分鐘的時間段內(nèi)連續(xù)監(jiān)測這些參數(shù)，并視需要將其調(diào)整為具有95-100％精度的有效標(biāo)記運(yùn)動反應(yīng)。然后將數(shù)據(jù)輸出，組織成表格形式，以用于統(tǒng)計分析。
使用Statgraphics Plus5.0軟件(Statistical Graphics Corp.)，用具有Tukey多分析實驗的單向ANOVA比較平均值。認(rèn)為小于0.05的概率(p＜0.05)是顯著的。所有的值都以實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
將在體內(nèi)和離體實驗中使用到的所有藥物(包括DON)都溶解在生理鹽水中(0.9％)。注射濃度是(注射速率為0.5ml/分鐘)α，β-亞甲基三磷酸腺苷(α，β-亞甲基ATP，300mg/kg)、N-ω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，10mg/kg)、BRL 43694(格蘭塞群，80mg/kg)、血安定(5×10-5M)和六甲雙銨(18mg/kg，s.c.)。α，β-亞甲基ATP從RBI(Natick，MA)購得；DON由Mr.Dave Miller(Agriculture Canada，Ottawa，ON)提供，它是根據(jù)Miller等人所述的方法〔Can.J.Microbiol.，291171-1178(1983)；Miller和Blackwell，Can.J.Bot.，641-5(1986)；Miller和Arnison，Can.J.Plant Path.，8147-150(1986)〕生物合成生產(chǎn)和純化的；其余所有的藥物從Sigma ChemicalCompany(Toronto，ON)購得?！癿g/kg”指毫克每千克個體對象/動物體重。
用于器官浴制品(體外)或局部用于離體實驗中的藥物的濃度是卡巴膽堿(0.5mM)、罌粟堿(10mM)、ATP(0.5mM)、DMPP(50mM)、3-APS(0.5mM)(SigmaChemical Company，Toronto，ON)和DON(20mM)。藥物體積從不超過浴體積的1％。
在對照條件下，麻醉大鼠的胃和小腸具有局部自發(fā)的運(yùn)動行為。在胃竇中，這種行為由振動收縮和松弛運(yùn)動反應(yīng)組成。在十二指腸近端，自發(fā)的運(yùn)動行為是階段性的強(qiáng)烈的“組合”行為(持續(xù)1-5分鐘)模式，主要包括低振幅、低頻率松弛和收縮。與“組間”行為相反，“組合”行為以3.4±0.6cm/分鐘的速率在對口方向擴(kuò)散。回腸遠(yuǎn)側(cè)對照的自發(fā)行為主要包括隨機(jī)產(chǎn)生的相對高振幅和頻率的收縮和/或松弛。
以1或2mg/kg的大丸劑全身給予DON并沒有影響對照的運(yùn)動行為。但是，在10mg/kg時，DON如下面所述中斷了自發(fā)的運(yùn)動模式。用20mg/kg的DON處理并沒有產(chǎn)生顯著更大的影響。
胃竇靜脈注射后2分鐘內(nèi)，DON(10mg/kg，i.v.，n＝7)抑制竇的運(yùn)動行為(圖4)，減弱(p＜0.05)自發(fā)的收縮(相對對照，減弱20±6％)和松弛(相對對照，減弱27±11％)。這種影響是短暫的，因為運(yùn)動行為在18±3分鐘內(nèi)恢復(fù)到對照的90％。最短時間內(nèi)重新給予DON一般沒有產(chǎn)生影響。
近端十二指腸全身注射DON(10mg/kg，n＝12)后2分鐘內(nèi)，自發(fā)的十二指腸運(yùn)動行為從對照模式的交替“組合”和“組間”行為轉(zhuǎn)變成一段持續(xù)的“組合”樣行為(46±15分鐘)(圖5)。這種機(jī)能亢奮并不與對照“組合”行為的振幅或頻率有顯著差異。在給予DON后的60分鐘內(nèi)，對照模式的交替“組合”和“組間”行為恢復(fù)。接著注射DON(n＝6)并沒有顯著改變原來的運(yùn)動模式，這表明產(chǎn)生了快速減敏?？焖贉p敏對DON的作用時間是相對短的，30分鐘后再給予DON(n＝5)，又引起機(jī)能亢奮(p＜0.05)；但是，相對最初的DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮，此次行為的持續(xù)時間(24±14分鐘)大大減少。
回腸末端全身注射DON(10mg/kg，n＝9)，2分鐘內(nèi)引起回腸的機(jī)能亢奮。收縮和松弛運(yùn)動反應(yīng)的頻率和振幅顯著(p＜0.05)增加。因此，回腸在DON的存在下所具有的消化道活動性的模式類似于當(dāng)食物被攝取并需要被推過消化道時產(chǎn)生的消化道活動性的特征進(jìn)食模式。這種效果持續(xù)63±22分鐘。之后，運(yùn)動行為慢慢恢復(fù)到對照水平。與十二指腸類似，在回腸中也產(chǎn)生了對再給予DON(n＝6)的快速減敏作用。此快速減敏持續(xù)達(dá)90分鐘，之后可通過再給予DON(n＝6)誘導(dǎo)機(jī)能亢奮。
局部給予DON的效果離體制品的運(yùn)動行為模式與體內(nèi)制品相似。在胃竇(n＝3)、十二指腸近端(n＝3)或回腸遠(yuǎn)端(n＝3)的絨膜中直接(局部)使用20mM的DON(濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于體內(nèi)實驗使用的劑量)，并沒有引起任何可與體內(nèi)實驗所見到的運(yùn)動反應(yīng)相比的反應(yīng)。通過觀察所檢測的消化道區(qū)域的活力證明了預(yù)測的對藥理學(xué)刺激的反應(yīng)(即已知的對平滑肌直接起作用)，這些刺激如使平滑肌松弛的罌粟堿(10mM)和誘導(dǎo)膽堿能蕈毒堿受體介導(dǎo)的收縮的卡巴膽堿(0.5mM)。局部使用DON并沒有干擾這些藥物的作用。
使用了卡巴膽堿(0.5mM)或罌粟堿(10mM)的十二指腸、空腸和回腸的分離的消化道浴制品(n＝5)分別產(chǎn)生收縮和松弛。另外，利用GABAA受體激動劑3-APS(0.5mM)或一氧化氮能受體激動劑DMPP(50mM)，消化道片段對假定的非腎上腺素能、非膽堿能(NANC)的抑制性遞質(zhì)ATP(0.5mM)和神經(jīng)刺激具有松弛反應(yīng)。但是，在同樣的制品中，DON(20mM)不起作用。此外，DON不干擾這些消化道片段對受試藥理學(xué)制劑的響應(yīng)性。
DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮的藥理學(xué)L-NAME在麻醉的具有自發(fā)的運(yùn)動行為的大鼠中，一氧化氮(NO)合成酶抑制劑L-NAME減弱了十二指腸的一氧化氮介導(dǎo)的“組間”松弛并提高了“組合”行為(觀察結(jié)果未公開)。因此，測量了L-NAME對DON行為的影響。全身給予L-NAME(10mg/kg，n＝5)并未減輕十二指腸中DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮的松弛的頻率和振幅(p＞0.05)(見圖6A、頻率和6B、振幅)。在回腸中，L-NAME總是將自發(fā)的運(yùn)動活性的松弛的頻率和振幅提高到與單獨存在DON時的水平(見圖6C、頻率和6D、振幅)。
嘌呤受體快速減敏自發(fā)的十二指腸“組合”松弛通過P2X受體相關(guān)的嘌呤能傳導(dǎo)特異性地介導(dǎo)(觀察結(jié)果未公開)。這通過P2X嘌呤體長時間暴露在特異性的激動劑α，β-亞甲基ATP中產(chǎn)生脫敏作用而被證實。最初注射α，β-亞甲基ATP(300mg/kg，i.a.，n＝3)誘導(dǎo)顯著的松弛?；謴?fù)到基本的狀況后，再用α，β-亞甲基ATP刺激沒有產(chǎn)生影響，這表明產(chǎn)生了快速減敏。在這些條件下，自發(fā)的十二指腸“組合”松弛和回腸的松弛被特異性地封阻。另外，在十二指腸(n＝8)和回腸(n＝4)中α，β-亞甲基ATP誘導(dǎo)的快速減敏過程中，DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮也被消除。
煙堿受體膽堿能的煙堿機(jī)制基本上涉及到腸活動性的控制〔參見，F(xiàn)urness和Costa，Neurosci.，51-20(1980)；Gershon，Ann.Rev.Neurosci.，4227-272(1981)〕。在體內(nèi)，用神經(jīng)節(jié)煙堿拮抗劑血安定(50mM，局部使用，n＝2)或六甲雙銨(18mg/kg，s.c.，n＝2，數(shù)據(jù)未給)治療，顯著地減少了十二指腸和回腸中DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮的頻率和振幅。
谷尼色創(chuàng)在十二指腸中，全身給予5-HT3受體拮抗劑谷尼色創(chuàng)(80mg/kg，n＝8)，減弱了(p＜0.05)“組合”行為的自發(fā)的收縮和松弛的頻率和振幅(在圖7A-7D中比較寬對角線的柱(僅谷尼色創(chuàng))和對照組合行為的空白柱〕。谷尼色創(chuàng)的影響持續(xù)達(dá)30分鐘。但是，由于十二指腸對此藥物的作用不具有脫敏作用，重復(fù)給予谷尼色創(chuàng)以維持“組合”行為的封阻。在這些條件下，DON(10mg/kg，n＝5)總是誘導(dǎo)機(jī)能亢奮(p＜0.05)〔比較圖7A-7D中的窄對角線柱(僅DON)和填充柱(谷尼色創(chuàng)+DON)〕。
類似地，在回腸中，谷尼色創(chuàng)減弱了消化道活動性(p＜0.05)，分別將自發(fā)的收縮和松弛運(yùn)動反應(yīng)減到對照水平的40±18％(n＝4)和27±10％(n＝3)；但是，它沒有對抗DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮(數(shù)據(jù)未給)。
這些實驗描述了暴露在霉菌毒素DON中的麻醉大鼠的胃和腸水平的運(yùn)動模式的特征。全身注射DON破壞了胃竇振動運(yùn)動行為，代之以靜止的模式；在十二指腸中，DON誘導(dǎo)了代替自發(fā)的環(huán)狀擴(kuò)散模式和非擴(kuò)散運(yùn)動行為的機(jī)能亢奮。DON還引起回腸中存在的運(yùn)動模式的過度興奮。DON誘導(dǎo)的模擬行為是典型的“進(jìn)食模式”運(yùn)動行為的回憶。使用低水平的DON，即沒有引起嘔吐或嘔吐行為的水平。10mg/kg的DON起最大作用；這個劑量與使用嚙齒動物進(jìn)行的其他研究中使用的劑量是可比的，在那些研究中，使用DON以誘導(dǎo)進(jìn)食的改變的劑量達(dá)到40mg/kg(i.v.)〔Rapely等人，Lab.Anim.Sci.，385041(1988)〕。
在所檢查的大鼠中找到了對DON的漸進(jìn)性的耐受力的證據(jù)。小腸中DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮持續(xù)達(dá)60分鐘，然后完全恢復(fù)到對照運(yùn)動模式。接下來維持著對常規(guī)使用的藥理學(xué)刺激的響應(yīng)性；除了緊接的連續(xù)給藥后不起作用的DON外，產(chǎn)生了對DON的快速減敏的特征。但是，這種快速減敏沒有持續(xù)，可能是因為大鼠中高速率的DON解毒的緣故〔Prelusky等人，F(xiàn)und.Appl.Toxicol.，10276-286(1988)〕。
許多藥物(具體是催吐劑)在消化道水平上改變腸的活動性，它們激活伸向自主神經(jīng)節(jié)和/或神經(jīng)中樞(CNS)的嘔吐中心的迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)，這又反射刺激消化道，從而實現(xiàn)上述改變〔Castex等人，Brain Res.，688149-160(1995)；Cubeddu等人，Sem.Oncol.，192-13(1992)〕。但是，從本文得到的離體和體外實驗結(jié)果表明，雖然分離的消化道片段對各種藥理學(xué)刺激表現(xiàn)敏感，但直接給予DON不產(chǎn)生影響。因此，DON肯定是從消化道外的位點間接發(fā)揮其影響。這個發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)中的胃內(nèi)與靜脈內(nèi)注射(分別為30分鐘和15分鐘)后DON誘導(dǎo)的影響的延遲的發(fā)生的某些報道一致〔Coppock等人，Am.J.Vet.Res.，46169-174(1985)，F(xiàn)oresyth等人，Appl.Environ.Microbiol.，34547-552(1997)；Prelusky等人，Natural.Toxins，1296-302(1993)〕。
在正常的環(huán)境中，進(jìn)食中斷所有水平上的消化道的禁食環(huán)形運(yùn)動模式，代之以連續(xù)的、不規(guī)則的低水平行為(分段的進(jìn)食模式)。如上面所述，分段以插入小腸松弛間的窄環(huán)狀收縮為特征，并減少了胃竇中的活動性。進(jìn)食模式起到混合腸內(nèi)容物和延遲順行推進(jìn)以提高基質(zhì)吸收的作用〔Lundgren等人，Dig.Dis.Sci.，34264-283(1989)〕。進(jìn)食模式活動性被外周主神經(jīng)節(jié)經(jīng)由基本迷走輸入激活和控制，受CNS激活和控制的程度較小〔Chung等人，Can.J.Physiol.Pharmacol.，701148-1153(1992)；Tanaka等人，J.Surg.Res.，53588-595(1996)；Yoshida等人，J.Pharmacol.Exp.Therap.，256272-278(1991)〕。自主神經(jīng)的過度激活加速了進(jìn)食模式的產(chǎn)生并增加其持續(xù)時間，同時增加擴(kuò)散性運(yùn)動行為的頻率和振幅〔Hall等人，Am.J，Physio.，250G501-G510(1986)；Johnson等人，Am.J.Surg.，16780-88(1994)〕。這種運(yùn)動行為與上面所觀察到的小腸中DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮類似。另外，DON誘導(dǎo)的竇誘導(dǎo)行為的抑制性和胃排空的延遲(Fioramonti等人，J.Pharmaciol.Therap.，2661255-1260(1993)〕也是該進(jìn)食模式的特征(Hall等人，1986)?？傊@些結(jié)果表明，DON從外部位點經(jīng)由外周自主神經(jīng)節(jié)或迷走傳出神經(jīng)刺激介導(dǎo)進(jìn)食模式的途徑。
通過抑制性神經(jīng)的影響的抑制作用可部分激活進(jìn)食模式活動性(Lundgren等人，1989)。因此，在消化道以外起作用的DON能通過消除控制消化道活動性的腸神經(jīng)回路的強(qiáng)抑制作用而刺激機(jī)能亢奮。NO(一氧化氮)被提議為調(diào)節(jié)胃腸活動性的強(qiáng)釋放的抑制性介質(zhì)〔Daniel等人，Am.J.Physiol.，266G31-G39(1994)，Gustafeeon等人，J.Aut.Nerv.Sys.，44179-187(1993)；Hryhorenko等人，J.Pharmacol.Exp.Therap.，271918-926(1994)〕。在體內(nèi)實驗中，用NO合成抑制劑L-NAME(10mg/kg，i.v.)進(jìn)行的處理通過加強(qiáng)十二指腸和回腸的特異性運(yùn)動行為在一定程度上模擬了DON的效果。但是，L-NAME處理不影響消化道中DON的作用。
這些實驗提供了對消化道中介導(dǎo)DON影響的途徑的有價值的理解。當(dāng)NO合成酶抑制劑L-NAME選擇性封阻自發(fā)的“組間”十二指腸松弛以及強(qiáng)化組合運(yùn)動行為時，它并未影響到DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮。相反，選擇性減弱“組合”松弛的α，β-亞甲基ATP誘導(dǎo)的快速減敏也阻止十二指腸中的DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮。存在著提示ATP和NO是大鼠十二指腸中NANC抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的強(qiáng)有力證據(jù)〔katsuragi等人，J.Pharmacol..Exp.Therap.，259513-518(1991)；Manzini等人，Eur.J.Pharmacol.，123229-236(1986)；Postorino等人，J.Auton.Pharmacol.，1565-71(1995)；Windschief等人，Br.J.Pharmacol.，1151509-1517(1995)〕。這種由DON引起的嘌呤能松弛的靶向在回腸中也是明顯的，在那里DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮被α，β-亞甲基ATP快速減敏所封阻。迄今仍未測定大鼠中介導(dǎo)體內(nèi)自發(fā)的回腸松弛的遞質(zhì)的身份。但是，有大量的離體功能性證據(jù)證明ATP和NO都介導(dǎo)了大鼠回腸中的NANC松弛〔Belai等人，Cell.Tiss.Res.，278197-200(1994)；Fargeas等人，Gastroenterol.，102157-162(1992)；Mahmod和Huddart，Comp.Biochem.Physiol.，106C79-85(1993)；Simits等人，Br.J.Pharmacol.，118695-703(1996)〕。
煙堿受體阻斷消除了小腸中自發(fā)的和DON誘導(dǎo)的運(yùn)動行為，這解釋了從先前的研究中得到的結(jié)果。已知煙堿神經(jīng)節(jié)傳導(dǎo)介導(dǎo)興奮性和抑制性器官內(nèi)神經(jīng)元的膽堿能刺激，該神經(jīng)元調(diào)節(jié)和處理腸神經(jīng)信號〔Bomstein等人，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，21441-452(1994)；Gershon，Ann.Rev.Neurosci.，4227-272(1981)〕。實際上，膽堿能神經(jīng)元介導(dǎo)胃腸道所有的活動模式，包括蠕動反射和MMC。因此，用煙堿拮抗劑進(jìn)行的處理可有效地封阻絕大多數(shù)(如果不是全部)腸神經(jīng)回路。
迷走神經(jīng)傳入上的5-HT3位點不大可能涉及與DON作用相關(guān)的消化道運(yùn)動行為，因為當(dāng)直接對整只動物的暴露的消化道使用DON時，DON不起作用。5-HT3受體還位于腸肌層神經(jīng)元中，后者涉及調(diào)節(jié)中間消化運(yùn)動模式的腸回路〔Hoyer，Neuropsypharmacol.，3371-383(1990)；Yoshida等人，1991〕，并且這些神經(jīng)元可能在被DON鎖定的腸回路中發(fā)生。使用有效的和特異的5-HT3受體拮抗劑谷尼色創(chuàng)，以足以消除十二指腸中自發(fā)的“組合”行為以及回腸中的運(yùn)動行為的劑量進(jìn)行處理，并不能影響DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮。因此，DON和5-HT以小腸中共同的腸元素為目標(biāo)通過不同的途徑起作用。但是，DON激活的途徑和5-HT3受體依賴性途徑都集中于同一類群的抑制性嘌呤能運(yùn)動神經(jīng)元。
這些發(fā)現(xiàn)為DON誘導(dǎo)的進(jìn)食拒絕提供了解釋。DON的“低”閾值水平對消化道活動性的中斷作用的影響是明顯的；竇運(yùn)動行為變小，小腸的運(yùn)動行為得到強(qiáng)化。這些運(yùn)動模式一起說明了“進(jìn)食狀態(tài)”，一種通常與飽食有關(guān)的狀態(tài)。愛這些條件下，人或其他動物停止進(jìn)食。這種DON誘導(dǎo)的進(jìn)食模式是短暫的，中間消化的環(huán)狀模式很快恢復(fù)，大概是因為DON血漿水平降至低于閾值的緣故。
與此研究的特征一致的是由DON鎖定的P2X嘌呤受體介導(dǎo)了抑制性腸運(yùn)動的神經(jīng)分布。這種神經(jīng)分布也涉及煙堿受體，但是，如上面所述，腸神經(jīng)回路中到處分布和涉及的煙堿位點排除了以抵消DON的作用為目的的煙堿拮抗劑的使用。但是，更有希望的是DON在激活P2X嘌呤受體相關(guān)活性中的特異性。P2X嘌呤能位點代表腸途徑的一種高度限制的組分，因此，以這些位點為目標(biāo)可代表一種抵消消化道中DON影響的簡單方法。
實施例2DON對豬胃腸道體內(nèi)自發(fā)的運(yùn)動行為的影響腸的P2X嘌呤受體的涉及。
本實施例證明單端孢霉烯DON通過在外周神經(jīng)系統(tǒng)的位點上起作用而影響消化道活動性，并且，可通過以高親和力與消化道組織上的P2X1嘌呤受體結(jié)合的P2X1嘌呤受體脫敏激動劑α，β-亞甲基ATP抵消DON的這種影響。這種嘌呤能ATP類似物的強(qiáng)烈結(jié)合不僅使源自DON的消化道活動性的P2X1嘌呤受體調(diào)節(jié)脫敏化，而且還能作為P2X1嘌呤受體拮抗劑有效地中斷消化道活動性的調(diào)節(jié)途徑。
將斷奶1周的雄性Yorkshire豬(10-15kg活重)禁食12小時過夜，可飲水。在進(jìn)行外科手術(shù)的當(dāng)天早晨，肌肉內(nèi)注射Ketamine(氯胺酮)8mg/kg，使其鎮(zhèn)靜。Ketamine是一種分離性的麻醉劑，它使血壓和骨骼緊張性增加，氣管僵硬。全身處于鎮(zhèn)靜狀態(tài)使動物缺乏對環(huán)境的意識。但是，唾液分泌物增加，因此，導(dǎo)氣管阻塞是危險的；但不能使用阿托品。通過面罩使用氟烷-氧氣混合物產(chǎn)生麻醉。用1-2劑利多卡因氣溶膠(10mg/劑，Xylocain，Sigma)進(jìn)行局部的咽部麻醉。然后將管子插入動物體中，通過關(guān)閉的非重呼吸回路用氟烷(3-4％)在氧氣(200ml/分鐘)中的混合物實現(xiàn)外科水平的麻醉。將導(dǎo)管插入耳表層小靜脈以進(jìn)行電解質(zhì)替換(0.9％鹽水)以及靜脈內(nèi)藥物的注射。同樣也在股動脈插入導(dǎo)管，用于動脈內(nèi)藥物注射。將PE 205管逆向插入，這樣將管的針頭放在上部腸系膜動脈的水平上。使用與在線IBM數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)連接的壓力傳感器(P23ID，Durham，Statham，OH，USA)通過此動脈導(dǎo)管監(jiān)測血壓。然后對該動物進(jìn)行剖腹術(shù)。如實施例1所述，使用VetBond膠將箔壓力傳感器(Showa型N11，Durham Intrusments，Pickering，ON)粘附在胃腸道的絨膜上。將一個壓力傳感器放在胃竇上(離幽門5-10cm)，將另一個傳感器放在近端十二指腸的反腸系膜邊界上(離盲腸2-10cm)，將最后一個傳感器連接到回腸末端的絨膜上(離盲腸2-10cm)。3個箔壓力傳感器的取向與縱向肌肉的軸平行。從壓力傳感器延伸出來的導(dǎo)線經(jīng)由接口盒連接到IBM數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)上。外科手術(shù)結(jié)束后，將豬翻身，使用1-2％氟烷維持輕水平的麻醉，以進(jìn)行剩余的實驗。
同時使用數(shù)據(jù)采集軟件(AD1000模擬數(shù)字轉(zhuǎn)化卡，Real Time Devices Inc.，Dr.Frank Johnson，Institute of Medical Engineering，University of Ottawa)和IBM兼容機(jī)連續(xù)記錄從所有的箔壓力傳感器上得到的運(yùn)動行為。根據(jù)其滿足兩組(收縮和松弛)六個數(shù)值參數(shù)的能力選擇合格的反應(yīng)。這些數(shù)值定義了在使用者對記錄的可視的檢查的基礎(chǔ)上有效地標(biāo)記運(yùn)動行為的閾值持續(xù)時間和最大參數(shù)。使用者能在2分鐘的時間段內(nèi)連續(xù)監(jiān)測這些參數(shù)，并視需要將其調(diào)整為具有95-100％精度的有效標(biāo)記運(yùn)動反應(yīng)。數(shù)據(jù)采集軟件輸出頻率、振幅、面積、達(dá)到峰值的時間以及收縮與松弛運(yùn)動行為的持續(xù)時間。
使用Statgraphics Plus5.0軟件(Statistical Graphics Corp.)，用具有Tukey多分析實驗的單向ANOVA比較平均值。認(rèn)為小于0.05的概率(p＜0.05)是顯著的。所有的值都以實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
將在體內(nèi)和離體實驗中使用到的所有藥物(包括DON)都溶解在生理鹽水中(0.9％)。注射濃度是(注射速率為0.5ml/分鐘)α，β-亞甲基三磷酸腺苷(α，β-亞甲基ATP，300mg/kg)、N-ω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，10mg/kg)、谷尼色創(chuàng)(80mg/kg)、血安定(5×10-5M)和六甲雙銨(18mg/kg，s.c.)。α，β-亞甲基ATP從RBI(Natick，MA)購得；DON由Mr.Dave Miller(Agriculture Canada，Ottawa，ON)提供，它是根據(jù)Miller等人所述的方法〔Can.J.Microbiol.，291171-1178(1983)；Miller和Blackwell，Can.J.Bot.，641-5(1986)；Miller和Arnison，Can.J.Plant Path.，8147-150(1986)〕生物合成并純化的；其余所有的藥物從Sigma ChemicalCompany(Toronto，ON)購得。
胃腸道自發(fā)的運(yùn)動行為胃胃竇中的運(yùn)動行為一般由振動性收縮和松弛組成。這些行為以對照記錄的完整期間呈現(xiàn)，或者隨機(jī)發(fā)生。在胃記錄中與MMC類似的運(yùn)動模式不明顯。表1中列出了自發(fā)的運(yùn)動行為的總結(jié)。
十二指腸自發(fā)的運(yùn)動行為由不規(guī)則的收縮和/或松弛運(yùn)動行為組成(表1)。有時，由階段III擴(kuò)散類型行為(“組合”行為)和靜止階段組成的MMC的行為回憶是明顯的?！敖M合”行為的持續(xù)時間大約是5分鐘，但不能準(zhǔn)確測定循環(huán)長度，因為在我們的實驗中僅持續(xù)2小時的控制期間中的“組合”行為出現(xiàn)的次數(shù)不超過2或3次。已知在禁食豬中的MMC的循環(huán)長度為70-115分鐘。在我們的豬中，“組合”行為由相對高的振幅、高頻率的松弛和收縮組成收縮的頻率為11.9±0.5事件/分鐘，收縮的振幅為0.08±0.01g；松弛的頻率為12.9±0.8事件/分鐘，松弛的振幅為0.07±0.01g。
回腸回腸通常具有隨機(jī)的收縮和/或松弛運(yùn)動行為(表1)。很少觀察到MMC樣的行為。在1/3的豬中，回腸的運(yùn)動行為是靜止?fàn)顟B(tài)，但是在這些實驗中，回腸被證明是對DON處理作出響應(yīng)。
表1.麻醉豬中的自發(fā)的消化間運(yùn)動行為的特征

數(shù)值表示得自12頭豬的數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
以0.1mg/kg(n＝3)、0.7mg/kg(n＝2)和1.0mg/kg(n＝10)的量經(jīng)由靜脈內(nèi)(i.v.)或動脈內(nèi)(i.a.)給予DON。注射后5分鐘內(nèi)，DON(n＝6)降低了自發(fā)的收縮和松弛運(yùn)動行為的頻率和振幅(p＜0.05)。此DON誘導(dǎo)的抑制作用的持續(xù)時間從10分鐘到不定的時間。相反，在3頭豬中，DON增加了(p＜0.05)自發(fā)的運(yùn)動行為的頻率和振幅，分別為182±40％和206±38％；在恢復(fù)到對照模式前這種影響持續(xù)達(dá)30分鐘。DON這種不同的作用并不與注射的劑量或給予的途徑明顯有關(guān)。此外，注射劑量與給藥途徑都沒有導(dǎo)致平均動脈血壓的任何改變，該值在對照的持續(xù)期和DON處理期都維持為穩(wěn)定的水平。
DON的影響在十二指腸中更為一致(n＝21)，在那它總是強(qiáng)化自發(fā)的運(yùn)動行為(p＜0.05)。全身性給予大于或等于1mg/kg的DON一致地引起顯著的強(qiáng)化作用；該劑量還代表增加十二指腸運(yùn)動行為的頻率以及振幅的劑量。在整個實驗過程中，DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮的頻率通常持續(xù)升高，而運(yùn)動反應(yīng)的振幅逐漸恢復(fù)到對照的水平。
用0.1mg/kg(n＝3)、1.0mg/kg(n＝12)和10mg/kg(n＝3)的劑量檢測DON對收縮和松弛運(yùn)動行為的頻率和振幅參數(shù)的劑量影響。僅運(yùn)動行為的振幅的劑量反應(yīng)影響是明顯的。另外，由于DON為10mg/kg而提高的運(yùn)動行為與1mg/kg的DON的影響沒有顯著差別。
全身性給予DON引起回腸運(yùn)動行為中的劑量依賴性的增加。以0.1mg/kg(n＝3)、0.7mg/kg(n＝3)、1.0mg/kg(n＝12)和10mg/kg(n＝4)的劑量給予DON。在回腸中，劑量反應(yīng)影響在運(yùn)動行為的頻率和振幅參數(shù)中都是明顯的。但是，DON的最大影響出現(xiàn)在等于或大于1mg/kg的劑量，在此劑量，自發(fā)的運(yùn)動行為的收縮和松弛的頻率以及振幅都顯著地增加(p＜0.05)。DON提高行為30-60分鐘后，當(dāng)前的運(yùn)動行為的頻率和振幅開始下降，但是，在最初注射DON后的2個小時，運(yùn)動行為仍顯著高于對照。
α，β-亞甲基ATP對DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮的影響總是在DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮期間給予α，β-亞甲基ATP。這給DON作用提供了內(nèi)在的對照。以300μg/kg的劑量動脈內(nèi)給予α，β-亞甲基ATP，僅僅引起平均動脈血壓的短暫增加(少于1分鐘)。
給予α，β-亞甲基ATP(300μg/kg，i.a.)總是引起胃中原始的松弛反應(yīng)，但是，它沒有抵消DON對胃運(yùn)動行為的影響。
注射后，α，β-亞甲基ATP(175μg/kg，i.a.)通常引起十二指腸小的時相性的松弛。但是，DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮并沒有出現(xiàn)被影響的跡象。較高劑量的α，β-亞甲基ATP(300μg/kg，i.a.)更一致地引起原始的時相性松弛(0.5±0.1g，n＝10)，接著在DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮中出現(xiàn)短暫的降低(3-10分鐘)。α，β-亞甲基ATP顯著地減低了DON誘導(dǎo)的松弛和收縮的振幅而不是頻率(見圖8)。當(dāng)在最初注射后10-20分鐘內(nèi)再給予α，β-亞甲基ATP(300μg/kg，i.a.)時，十二指腸又松弛。但是，這時沒有表現(xiàn)出對DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮的進(jìn)一步影響。
在回腸中觀察到類似的結(jié)果，在那里在注射后α，β-亞甲基ATP(300μg/kg，i.a)引起大的時相性松弛(1.2±0.2g，n＝6)，并減少了DON誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮。α，β-亞甲基ATP誘導(dǎo)的回腸中DON誘導(dǎo)的松弛和收縮的振幅以及頻率的效力由圖9表示。在這三個試驗中，在最初給藥后的10分鐘內(nèi)再給予α，β-亞甲基ATP(300μg/kg)，以測試快速減敏的產(chǎn)生。α，β-亞甲基ATP誘導(dǎo)的松弛的振幅與最初給予該制劑相比減少了68±18％。
實施例3大鼠小腸中體內(nèi)消化間運(yùn)動行為的非腎上腺素能的、非膽堿能的(NANC)控制。
本實施例提供體內(nèi)控制大鼠小腸的不同區(qū)域的消化間運(yùn)動行為的神經(jīng)途徑的研究。本實施例中的數(shù)據(jù)以及上述實施例1和2中的數(shù)據(jù)都表明消化道活動性的調(diào)節(jié)是由圖2和10示意圖中所示的神經(jīng)回路所控制。
遷移性運(yùn)動復(fù)合(MMC)與腸內(nèi)容物的消化間推進(jìn)(如蠕動)有關(guān)，還涉及興奮性和抑制性途徑的連續(xù)的激活作用。蠕動下的神經(jīng)回路由支配胃腸平滑肌的興奮性(主要為膽堿能的)和抑制性非腎上腺素能的、非膽堿能的(NANC)運(yùn)動神經(jīng)元以及興奮性和抑制性中間神經(jīng)元組成〔Costa和Brookes，Am.Gastroenterol.，89S129-S137(1994)〕。但是，先前對關(guān)于控制消化間活動性的器官壁內(nèi)的神經(jīng)元知道很少，主要是因為在離體很難測定MMC。而且，體內(nèi)MMC分析的絕大多數(shù)注意力僅放在收縮行為上。體內(nèi)活動性研究(如本文所述)揭示了擴(kuò)散性腸運(yùn)動行為(這是MMC的特征)由收縮以及松弛的組成。
我們確定了在十二指腸和回腸的自發(fā)運(yùn)動行為中膽堿能和5-HT涉及的程度，以及ATP、VIP和NO的作用。
在可飲水的情況下，將雄性Sprague-Dawley大鼠(250-350g)禁食24小時。為了進(jìn)行外科手術(shù)，用2％氟烷在500ml/分鐘的氧氣中將大鼠麻醉，使用溫度調(diào)節(jié)控制加熱桌和熱毯子維持大鼠的體溫恒在37℃。暴露右頸動脈，插入導(dǎo)管，經(jīng)由壓力傳感器(P23ID，Gould Statham，OH)監(jiān)測血壓。將導(dǎo)管插入右頸靜脈，以進(jìn)行靜脈內(nèi)藥物注射。由于許多藥物半衰期短以及為了避免肝的第一輪代謝，常常采用動脈內(nèi)(i.a.)途徑給藥。為此，從右股動脈插入套管，并以逆向插入，以使針頭放在上層腸系膜動脈的水平上。
如上面所述準(zhǔn)備進(jìn)行體內(nèi)活動性評估的動物。使用Vet Bond膠順序?qū)⒉瓑毫鞲衅髡迟N在十二指腸的非腸系膜邊界上，離胃腸連接處1-2cm，位于回腸的非腸系膜邊界旁，正好接近回盲腸連接處。在6只大鼠中，有2或3個箔壓力傳感器粘貼在離近端十二指腸2cm的地方。我們從這些實驗中外推出“組合”行為擴(kuò)散的速率。所有粘貼了箔壓力傳感器的腸的取向與肌肉層的縱向平行，因為這樣提供了記錄圓周運(yùn)動行為最敏感的環(huán)境。允許大鼠從手術(shù)狀態(tài)恢復(fù)1小時，然后在給予任何藥物前再記錄1小時的對照運(yùn)動行為。根據(jù)渥太華大學(xué)動物護(hù)養(yǎng)委員會制訂的加拿大動物護(hù)養(yǎng)理事會的指南(Canadian Council on Animal Care)進(jìn)行所有的手術(shù)和實驗方案。
如上面所述進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析。
所有藥物都溶解在0.5ml的生理鹽水(0.9％)中。其劑量是(在1分鐘內(nèi)注射完)α，β-亞甲基ATP(300mg/kg)、甲基-S ATP(360mg/kg)、N-ω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，10mg/kg)、血管活性腸肽(VIP，4-10mg/kg)、BRL 43694(谷尼色創(chuàng)，80mg/kg)、阿托品(4-6mg/kg)和六甲雙銨(18mg/kg，s.c.)。α，β-亞甲基ATP和甲基-S ATP從RBI購得，谷尼色創(chuàng)是從Dr.R.K.Harding得到的禮物，除此之外的藥物都從Sigma購得。
可容易地表示大鼠小腸中的自發(fā)運(yùn)動行為的區(qū)域特異模式的特征。在十二指腸中(n＝8)，該模式由擴(kuò)散性“組合”和非擴(kuò)散性“組間”運(yùn)動行為的再發(fā)生循環(huán)組成，其循環(huán)長度為5.4±0.4分鐘?！敖M合”行為以收縮和/或松弛運(yùn)動行為的強(qiáng)烈階段(大約2-4分鐘)為代表，該行為在尾部以MMC回憶的方式以3.4±0.6cm/分鐘的速率擴(kuò)散?！敖M間”行為由隨機(jī)發(fā)生的低振幅、低頻率松弛和/或收縮組成。
回腸的自發(fā)運(yùn)動行為僅由松弛(占所有受試動物的50％)或收縮(占所有受試動物的30％)組成；在剩下的實驗中，收縮和松弛運(yùn)動行為一起發(fā)生。一類運(yùn)動反應(yīng)占優(yōu)(收縮或松弛)指示平滑肌的內(nèi)在的緊張狀態(tài)，處于高緊張狀態(tài)的組織主要是松弛行為，而處于低緊張狀態(tài)的組織易于顯示收縮。通常，自發(fā)的回腸松弛和收縮以相對低的頻率發(fā)生，具有相對高的振幅。在10％的實驗中，回腸具有可與階段III的MMC行為相比較的高頻率運(yùn)動反應(yīng)的周期性爆發(fā)。
ATP的取代衍生物α，β-亞甲基ATP和甲基-S ATP對P2X和P2Y嘌呤受體分別具有不同的親和力〔Bumstock和Kennedy，Gen.Pharmacol.，16433-440(1985)〕。延長組織暴露在這些制劑中的時間之后，組織產(chǎn)生了快速減敏，因此以這種方式可能可以區(qū)別P2X和P2Y受體介導(dǎo)的反應(yīng)。注射后，α，β-亞甲基ATP(300μg/kg，i.a.)引起十二指腸中的時相性松弛(1.0±0.1g，n＝5)；接著它選擇性地減弱了“組合”松弛的頻率和振幅(p＜0.05)，分別減弱了73±7％和48±5％。α，β-亞甲基ATP對自發(fā)的十二指腸收縮的影響是可變化的且不能被分析。
在回腸中，α，β-亞甲基ATP(300μg/kg，i.a.)引起最初的時相性松弛。用α，β-亞甲基ATP在最短時間內(nèi)再刺激并沒有引起別的反應(yīng)，這表明產(chǎn)生了快速減敏。在此期間，自發(fā)的回腸松弛減弱時間達(dá)30分鐘(p＜0.05，n＝8)。自發(fā)的收縮并未受到α，β-亞甲基ATP處理的影響。甲基-S ATP(360μg/kg，i.a.，n＝4)也減弱了回腸的松弛(p＜0.05)，但是，甲基-S ATP并未引起最初的時相性松弛。
L-NAME(10mg/kg，i.v.，n＝8)選擇性地減弱了十二指腸的自發(fā)的“組間”松弛的頻率和振幅，分別減弱了44±8％和66±1％。在回腸中，L-NAME強(qiáng)化了收縮(n＝6)和松弛(n＝8)運(yùn)動行為。這種影響常常持續(xù)了實驗的整個過程。由L-NAME強(qiáng)化的松弛被α，β-亞甲基ATP處理(59±12％)或甲基-S-ATP處理(70±3％)減弱(p＜0.05，n＝4-6)。
“組合”和“組間”運(yùn)動行為以及回腸的運(yùn)動行為的自發(fā)的收縮和松弛都被煙堿受體拮抗劑六甲雙銨減弱，時間達(dá)到20分鐘(p＜0.05，n＝4)。L-NAME提高的行為也被六甲雙銨減弱(p＜0.05，n＝6)。阿托品(4-6mg/kg，i.a.，n＝4)分別將自發(fā)的回腸收縮減弱了87±3％和89±7％。十二指腸收縮也受到類似影響。
VIP(4-10μg/kg，i.a)引起十二指腸中的時相性松弛(n＝8)。接著，VIP短暫抑制(p＜0.05)了十二指腸“組間”運(yùn)動行為，強(qiáng)化(p＜0.05)了“組合”行為。在回腸中，VIP一致地僅引起緩慢的收縮，該收縮在6分鐘內(nèi)恢復(fù)到對照水平。伴隨著這種收縮，自發(fā)的(n＝4)松弛和L-NAME提高的(n＝6)松弛被減弱(p＜0.05)，時間達(dá)到8分鐘。自發(fā)松弛的頻率和振幅分別被減到對照的33±8％和21±5％。L-NAME誘導(dǎo)的松弛的頻率和振幅分別被減到對照的32±12％和14±3％。
谷尼色創(chuàng)(80μg/kg，i.v.或i.a.)在5分鐘內(nèi)，減弱了(p＜0.05)自發(fā)的十二指腸“組合”松弛(n＝9)和收縮(n＝4)，但并未影響“組間”運(yùn)動行為?！敖M合”運(yùn)動行為被減弱的時間達(dá)40分鐘，接著，消化間活動性的對照模式逐漸恢復(fù)。谷尼色創(chuàng)處理還減弱了(p＜0.05，n＝4)自發(fā)的回腸收縮和松弛。在約60分鐘內(nèi)回腸的消化間運(yùn)動模式逐漸恢復(fù)到對照水平。在谷尼色創(chuàng)的存在下，L-NAME提高的回腸運(yùn)動行為的振幅也被減弱了76±8％(p＜0.05，n＝6)。
組合松弛對α，β-亞甲基ATP處理敏感，而在NO合成酶抑制劑L-NAME的存在下“組間”松弛被抑制。相反，我們的結(jié)果顯示NO不是自發(fā)的回腸松弛的介體。其他人的結(jié)果顯示，在分離的大鼠回腸制品中，ATP引起了松弛，ATP脫敏作用減少了這些松弛〔Smits等人，Br.J.Pharmacol.，118695-703(1996)〕。在本研究中，全身性注射P2X嘌呤受體激動劑α，β-亞甲基ATP引起回腸的原始松弛。在最短的時間間隔內(nèi)再給予α，β-亞甲基ATP并未引起反應(yīng)，這表明產(chǎn)生了快速減敏。伴隨著誘導(dǎo)產(chǎn)生的快速減敏，自發(fā)的回腸松弛被抑制。因此，經(jīng)由P2X位點起作用的ATP是介導(dǎo)大鼠回腸中自發(fā)的NANC松弛的遞質(zhì)。
ATP具有多種腸神經(jīng)功能，因為除了介導(dǎo)十二指腸和回腸中的P2X嘌呤受體依賴性松弛外，ATP通過P2Y嘌呤受體能刺激十二指腸中NO介導(dǎo)的非擴(kuò)散性“組間”松弛〔Glasgow等人，Am.J.Physiol.，276(Gastrointest.Liver Physiol.，38)G889-G896(1998)〕。在本實施例中，P2Y嘌呤受體激動劑甲基-S-ATP抑制自發(fā)的回腸松弛。但是，與α，β-亞甲基ATP不同，甲基-S-ATP在注射后不引起回腸松弛。這表明P2Y嘌呤受體在平滑肌中不存在，或者在回腸的抑制性運(yùn)動神經(jīng)分布中沒被激活。數(shù)據(jù)支持這樣的觀點在大鼠回腸中，P2Y嘌呤受體涉及介導(dǎo)嘌呤能NANC運(yùn)動神經(jīng)元的強(qiáng)抑制作用的途徑的激活，該神經(jīng)元以P2X嘌呤受體為靶標(biāo)。P2Y嘌呤受體可存在于促進(jìn)強(qiáng)抑制作用的一氧化氮能中間神經(jīng)元上，或者存在于在此預(yù)連接輸入內(nèi)的其他中間神經(jīng)元上。一氧化氮能和嘌呤能中間神經(jīng)元還可代表相同的類群，因為ATP和NO合成酶共同位于大鼠回腸的腸肌層中〔Belai和Burnstock，Cell Tiss.Res.，278197-200(1994)〕。
在許多消化道區(qū)域中VIP是NANC抑制性遞質(zhì)〔Bojo等人，Eur.J.Pharmacol.，236443-448(1993)；Mule等人，J.Auton.Pharmacol.，1281-88(1992)〕。在這些實驗中，VIP在大鼠十二指腸中引起短暫的松弛。接著產(chǎn)生的對VIP的快速減敏抑制了收縮的和松弛的“組間”行為，提高了“組合”運(yùn)動行為。數(shù)據(jù)表明最初的VIP引起的松弛依賴于NO，并對VIP脫敏作用敏感。因此，VIP能中間神經(jīng)元肯定是以“組間”行為的直接的運(yùn)動神經(jīng)分布(一氧化氮能和膽堿能運(yùn)動神經(jīng)元)以及“組合”行為的一氧化氮能預(yù)連接調(diào)節(jié)輸入為靶標(biāo)。
在這些實驗中，VIP處理抑制回腸的自發(fā)的松弛。由于VIP在注射后沒有引起松弛，VIP能神經(jīng)元介導(dǎo)對回腸平滑肌的直接抑制性輸入是不大可能的〔Smits等人，Br.J.Pharmacol.，118695-703(1996)〕。犬回腸的體內(nèi)實驗表明，VIP通過抑制性神經(jīng)作用在環(huán)狀肌肉運(yùn)動行為的強(qiáng)抑制作用中起主要作用(Fox-Threlkeld等人，Peptides，121039-1045(1991)〕。數(shù)據(jù)支持VIP以十二指腸和回腸中嘌呤能抑制性運(yùn)動神經(jīng)分布的NO依賴性預(yù)連接調(diào)節(jié)為靶標(biāo)。這些嘌呤能運(yùn)動途徑特異性地產(chǎn)生小腸的擴(kuò)散運(yùn)動行為。此外，VIP特異性地 抑制MMC的階段III行為，而VIP拮抗劑啟動階段III行為(Hellstron和Ljung，Neurogastroenterol.Motil，8299-306(1996)〕。結(jié)論是VIP同時刺激大鼠回腸中嘌呤能運(yùn)動神經(jīng)元的興奮性運(yùn)動輸入和抑制性一氧化氮能預(yù)連接輸入。
所有的消化間運(yùn)動復(fù)合組分依賴于迷走交感神經(jīng)的完整性〔Chung等人，Am.J.Physio.，267G800-G809(1994)；Galligan等人，J.Pharmacol.Exp.Therap.，2381114-1125(1986)〕?？刂莆改c活動性的膽堿能中間神經(jīng)元通過煙堿性突觸起作用，而ACh(乙酰膽堿)通過蕈毒堿性受體對平滑肌起作用。阿托品抑制小腸所有自發(fā)的收縮。從本研究中得到的結(jié)果表明，所有的十二指腸和回腸的自發(fā)的消化間運(yùn)動行為被強(qiáng)烈地驅(qū)動著，并對煙堿性受體封阻敏感。
離體研究顯示神經(jīng)元驅(qū)動的5-HT刺激嘌呤能NANC松弛〔Briejer等人，Naunyn-Schmiedebergs Arch.Pharnacol.，351126-135(1995)；Briejer等人，Pharmacol.Exp.Therap.，274641-648(1995)〕和膽堿能松弛〔Briejer等人，Eur.J.Pharmacol.，308173-180(1996)〕。本研究得到的體內(nèi)結(jié)果顯示，5-HT3受體涉及介導(dǎo)十二指腸和回腸中自發(fā)的膽堿能收縮和嘌呤能松弛的運(yùn)動途徑。
圖10是在所提議的控制大鼠十二指腸和回腸中自發(fā)運(yùn)動行為的強(qiáng)力的和調(diào)節(jié)的途徑內(nèi)膽堿能、一氧化氮能、GABA能、嘌呤能和VIP能神經(jīng)元素的安排的示意性簡化接線圖，該圖還顯示在該途徑中P2X和P2Y受體的關(guān)鍵位置。當(dāng)通過“腸神經(jīng)程序”確定驅(qū)動回路激活興奮性和抑制性運(yùn)動途徑時，立體的運(yùn)動模式被引發(fā)。但是，源自抑制性中間神經(jīng)元的連續(xù)驅(qū)動維持著靜態(tài)的肌源性行為。這種協(xié)同的抑制作用和反抑制作用由抑制性一氧化氮能輸入介導(dǎo)，并且它正好是這些預(yù)連接神經(jīng)途徑以及非?；钴S的運(yùn)動途徑的對照，它在運(yùn)動行為已存在的基線上產(chǎn)生了環(huán)狀的(消化間)活動性模式?；啬c中不存在GABA能/一氧化氮能組合途徑回路。
實施例4DON和DON基的衍生物對自發(fā)的胃腸運(yùn)動行為的影響。
本實施例證明DON基的衍生物以類似DON的方式引起消化道活動性的進(jìn)食模式的能力。
采用在先前測試DON和記錄其對消化道活動性的影響的實施例中所述的方法選擇用于與DON進(jìn)行可比研究的DON衍生物。DON衍生物的一個代表是3-乙?；鵇ON(C17H22O7)。用于研究的其他新的DON基的衍生物還包括異亞丙基DON(即3-羥基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C18H24O6，EN139491)、異亞丙基-3-乙?；?DON(即3-乙酰氧基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C20H26O7，EN 139492)、DON碳酸酯(即3-羥基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯，C16H18O7、EN 139494)、3-乙?；?DON碳酸酯(即3-乙酰氧基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮-7，15碳酸酯C18H20O8，EN 139495)、3-乙?；鵇ON亞芐基縮醛(即3-乙酰氧基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C24H26O8，EN 139496)和DON-芐基縮醛(即3-羥基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢菌素-8-酮，C22H24O7，EN 139497)。圖3A和3B中顯示了DON和這些代表性DON衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。新穎的DON衍生物的合成異亞丙基DON(EN 139491)在50mg(0.168mmol)脫氧瓜萎鐮毒素(DON)和70mg 2，2-二甲氧基丙烷在2.0ml、0℃的無水丙酮中的溶液中加入大約1mg的p-甲苯磺酸。攪拌反應(yīng)混合液，并將其溫度升至室溫。用薄層層析(PLC)監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)展，反應(yīng)5小時后認(rèn)為反應(yīng)完成。蒸發(fā)掉溶劑，用2ml水和5ml乙酸乙酯分配粗產(chǎn)品。用2ml飽和NaHCO3洗滌有機(jī)層，接著用2ml飽和鹽水洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥。蒸發(fā)溶劑，在硅膠上用6∶4的乙酸乙酯己烷混合物為洗脫液進(jìn)行色譜法純化殘留物。得到38mg(67％)的白色固體。
1H NMR分析(CDCl3，300MHz)δ 6.81(m，1H)，4.45(s，1H)，4.40(m，1H，3.85(bs，2H)，3.61(d，J＝8.0Hz，1H)，2.91(d，J＝8.0Hz，1H)，1.91-2.10(m，2H)，1.99(s，3H)，1.49(s，3H)，1.26(s，3H)，0.99(s，3H)。在此光譜中不能判明OH基的峰。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明異亞丙基DON(EN 139491)的結(jié)構(gòu)如圖3A所示。
異亞丙基-3-乙?；?DON(EN 139492)由70mg的3-乙?；?DON和87mg的2，2-二甲氧基丙烷制備此化合物，得率為62％。在使用1∶5的乙酸乙酯∶己烷混合物作為洗脫液進(jìn)行硅膠色譜法，得到白色固體。
1H NMR分析(丙酮-d6，200MHz)δ 6.67(d，J＝8.0Hz，1H)，5.09(m，1H)，4.81(m，2H)，3.85(d，J＝8.0Hz，1H)，3.51(bs，2H)，3.12(m，2H)，2.61(dd，J＝8.0Hz、16.0Hz，1H)，2.01(s，3H)，1.99(dd，J＝8.0Hz、16.0Hz)、1.82(s，3H)、1.25(s，6H)，1.15(s，3H)。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實異亞丙基-3-乙?；?DON(EN 139492)的結(jié)構(gòu)如圖3A所示。
DON-7，15-碳酸酯(EN 139494)將三光氣(5mg，0.016mmol)在1ml CH2Cl2中的溶液滴加到-78℃的10mg(0.033mmol)的DON和0.015ml吡啶在1ml無水二氯甲烷中的溶液中。將反應(yīng)混合液溫度升至室溫，再攪拌6小時。蒸發(fā)溶劑和殘留的揮發(fā)性試劑，用乙酸乙酯為洗脫液進(jìn)行硅膠柱色譜法純化殘留物。得到10mg(99％)白色固體DON-7，15-碳酸。
1H NMR分析(丙酮-d6，200MHz)δ 6.71(d，J＝8.0Hz，1H)，5.49(s，1H)，4.81(d，J＝8.0，1H)，4.51(m，3H)，4.31(d，J＝16.0Hz，1H)，3.51(d，J＝4.0Hz，1H)，3.21(m，2H)，1.90-2.21(m，2H)，1.86(s，3H)。1.01(s，3H)。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實DON-7，15-碳酸酯(EN 139494)的結(jié)構(gòu)如圖3B所示。
3-乙?；?DON-7，15-碳酸酯(EN 139495)由20mg的3-乙酰基-DON、0.023ml吡啶和10mg三光氣制備此化合物。使用7∶3的乙酸乙酯∶己烷混合物作為洗脫液進(jìn)行硅膠色譜法，得到白色產(chǎn)品。
1H NMR分析(CDCl3，300MHz)δ 6.61(d，J＝8.0Hz，1H)，5.36(m，1H)，5.29(s，1H)，4.49(d，J＝8.0Hz，1H)，4.41(d，J-16.0Hz，1H)，4.19(d，J＝16.0Hz，1H)，3.95(d，J＝4.0Hz，1H)，3.20(m，2H)，2.39(s，1H)，2.12(s，3H)，1.92(m，1H)，1.12(s，3H)。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實3-乙?；?DON-7，15-碳酸酯(EN 139495)的結(jié)構(gòu)如圖3B所示。
7，15-亞芐基-3-乙?；鵇ON縮醛(EN 139496)由20mg的3-乙?；?DON和13mg的苯甲醛二甲縮醛制備此化合物，得率為95％。用4∶6的乙酸乙酯∶己烷作為洗脫液進(jìn)行硅膠色譜法純化，得到白色固體。
1H NMR分析(CDCl3，300MHz)δ 7.45(m，5H)，6.81(d，J＝8.0Hz，1H)，5.39(s，1H)，5.10(m，1H)，4.90(s，1H)，4.35(d，J＝8.0Hz，1H)，4.31(d，J＝16.0Hz，1H)，3.81(d，J＝16.0Hz)，3.81(d，J＝16Hz，1H)，3.21(m，2H)，2.20-2.45(m，2H)，2.01(s，3H)，1.91(s，3H)，1.31(s，3H)。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實異亞芐基-3-乙酰基-DON(EN 139496)的結(jié)構(gòu)如圖3B所示。
7，15-亞芐基-DON縮醛(EN 139497)將約1mg的p-甲苯磺酸加到25mg(0.084mmol)DON和20mg(0.126mmol)苯甲醛二甲縮醛在2ml無水乙腈中的溶液中。室溫攪拌混合液2小時，然后蒸發(fā)掉溶劑。將粗的殘留物溶解于乙酸乙酯(5ml)中，然后用飽和的重碳酸鈉溶液(2ml)洗滌，接著用水(5ml)洗滌。分離出有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥，濃縮得到粗產(chǎn)品，柱色譜法(7∶3的乙酸乙酯∶己烷)純化，得到27mg(87％)的白色固體標(biāo)題化合物。
1H NMR分析(丙酮-d6，200MHz)δ 7.5(m，5H)，6.75(d，J＝8.0Hz，1H)，5.35(s，1H)，4.95(s，1H)，4.51(d，J＝8.0Hz，1H)，4.49(m，1H)，4.25(d，J＝16.0Hz，1H)，3.85(d，J＝16.0Hz，1H)，3.45(d，J＝5.0Hz，1H)，3.11(m，2H)，2.10(m，2H)，1.85(s，3H)，1.25(s，3H)。在此光譜中不能判明OH基的峰。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實異亞芐基-3-乙?；?DON(EN 139497)的結(jié)構(gòu)如圖3B所示。
全身給予DON(10mg/kg，i.v.)，引起大鼠胃腸中消化道運(yùn)動行為的典型的進(jìn)食模式(見圖11)。DON突然減弱了胃竇(位點S1)運(yùn)動行為，并引起十二指腸(近端十二指腸位點D1)中持續(xù)的機(jī)能亢奮。在60分鐘內(nèi)，對照運(yùn)動模式恢復(fù)。有時，單端孢霉烯誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮以原始的高頻率運(yùn)動行為為特征，在該運(yùn)動行為中雖然振幅比“組間”反應(yīng)大但是它小于MMC運(yùn)動行為的振幅。這種情況在圖11中顯示，圖中這種原始時期持續(xù)3-10分鐘，之后振幅增加到MMC的水平。
3-乙?；?DON(10mg/kg體重，i.v.)引起大鼠胃腸(n＝4)中典型的進(jìn)食模式運(yùn)動行為。圖12顯示起作用的時間(1分鐘)和影響持續(xù)的時間(40+4分鐘)與DON的類似。圖13顯示靜脈內(nèi)給予3-乙?；鵇ON對大鼠胃竇(S1)和近端十二指腸(D2)中自發(fā)的運(yùn)動行為的影響。在60分鐘內(nèi)，對照運(yùn)動模式恢復(fù)。
靜脈內(nèi)注射EN 139491(10mg/kg體重)后的30秒鐘內(nèi)，在十二指腸中產(chǎn)生了持續(xù)的長時間(40±1.75分鐘，n＝6)的機(jī)能亢奮，并且在胃竇中產(chǎn)生了同時且平行減弱的運(yùn)動行為，這是用DON進(jìn)行的實驗中所觀察到的典型的影響。圖14顯示大鼠十二指腸(D1)和胃竇(S1)中的運(yùn)動行為的典型的體內(nèi)記錄，闡明了化合物EN139491對消化道運(yùn)動行為的禁食模式的作用。記錄的上面部分顯示沒有任何藥物處理的20分鐘的正常的禁食模式運(yùn)動行為。在此期間，十二指腸具有典型的低頻率自發(fā)活動性模式以及擴(kuò)散性運(yùn)動行為(MMC)模式。胃竇具有典型的規(guī)律性運(yùn)動行為。記錄的第二部分顯示注射EN 139491時的行為。在注射后30秒內(nèi)，在十二指腸中發(fā)展了持續(xù)長時間(40-60分鐘)的機(jī)能亢奮，在胃竇中發(fā)展了同時且平行減弱的運(yùn)動行為。該EN 139491誘導(dǎo)的運(yùn)動行為是典型的進(jìn)食模式運(yùn)動行為。禁食模式運(yùn)動行為的恢復(fù)顯示在圖14的底部記錄中。圖15顯示化合物EN 139491對在D2位點(離D1壓力傳感器1.5cm)記錄的十二指消化道運(yùn)動行為的影響。圖15中顯示的在D2由EN 139491引起的進(jìn)食模式的誘導(dǎo)和持續(xù)時間的記錄與圖14中顯示的在位點D1記錄的結(jié)果類似。
還精細(xì)(closer)分析了由EN 139491誘導(dǎo)的消化道運(yùn)動行為的進(jìn)食模式的單個的松弛和收縮行為的特征。在此分析中，在十二指腸D1位點由EN 139491誘導(dǎo)的MMC和進(jìn)食模式的松弛或收縮行為的振幅和頻率以在禁食模式的正常的“組間”行為中觀察到的松弛或收縮行為各自的頻率和振幅的百分?jǐn)?shù)表示，將其作為各動物的內(nèi)部對照。分析的結(jié)果表明由EN 139491誘導(dǎo)的進(jìn)食模式的松弛行為的振幅(圖16)和頻率(圖17)與那些在消化道自發(fā)的“組合”MMC行為中觀察到的是可比的。同樣，由EN 139491誘導(dǎo)的進(jìn)食模式的收縮行為的振幅(圖18)和頻率(圖19)與那些在消化道自發(fā)的“組合”MMC行為中觀察到的是可比的。這些結(jié)果表明，由EN 139491誘導(dǎo)的進(jìn)食模式的特征與由DON誘導(dǎo)的進(jìn)食模式的特征相同。
與EN 139491的情況相同，靜脈內(nèi)注射DON衍生物EN 139492(10mg/kg體重)后的30秒鐘內(nèi)，在十二指腸位點D1和D2產(chǎn)生了持續(xù)長時間(48.5±2分鐘，n＝6)的機(jī)能亢奮，在胃竇位點S1產(chǎn)生了同時且平行減弱的運(yùn)動行為。圖20顯示了這些對體內(nèi)消化道運(yùn)動行為的影響的一個例子。圖20顯示在大鼠十二指腸D1和D2位點以及胃竇S1位點上的運(yùn)動行為的典型的體內(nèi)記錄，闡述了EN 139492對消化道運(yùn)動行為的禁食模式的作用。記錄的頂部顯示不存在DON或DON衍生物的情況下超過40分鐘的正常禁食模式運(yùn)動行為。在此期間，十二指腸具有低頻率自發(fā)運(yùn)動“組間”行為和擴(kuò)散性“組合”運(yùn)動行為(即“MMC”)的典型模式。胃竇具有典型的有節(jié)奏的運(yùn)動行為。在注射后30秒鐘內(nèi)，在十二指腸中引發(fā)了持續(xù)長時間的機(jī)能亢奮，在胃竇中產(chǎn)生了同時和平行減弱的運(yùn)動行為。
對由EN 139492誘導(dǎo)的消化道誘導(dǎo)行為的進(jìn)食模式進(jìn)行的精細(xì)分析，揭示松弛和收縮行為的頻率和振幅與消化道的MMC行為的松弛和收縮行為的頻率和振幅至少是可比的((數(shù)據(jù)未給)。因此，與EN 139491相同，DON衍生物EN 139492能誘導(dǎo)消化道運(yùn)動行為的進(jìn)食模式，該進(jìn)食模式與DON(EN 139491和EN 139492的結(jié)構(gòu)性母體)誘導(dǎo)的模式是可比的。
也采用與上述研究EN 139491和EN 139492的方法相同的方法測試DON衍生物DON碳酸酯(EN 139494)和3-乙?；鵇ON碳酸酯(EN 139495)(見圖3B)，結(jié)果顯示它們能以至少與那些由結(jié)構(gòu)性母體DON誘導(dǎo)的水平誘導(dǎo)消化道運(yùn)動行為的進(jìn)食模式是可比的。靜脈內(nèi)注射單端孢霉烯基衍生物EN 139495(10mg/kg)引起從被氟烷麻醉的雄性Sprague Dawley大鼠(n＝4)的近端十二指腸(D1)和胃竇(S1)記錄得到的消化道內(nèi)典型的體內(nèi)進(jìn)食模式運(yùn)動行為。EN 139495的影響在注射后40秒內(nèi)是明顯的，且作用持續(xù)40-60分鐘。在S1，收縮振幅和頻率分別減少到對照運(yùn)動行為的59±8.7％和64.25±12.0％標(biāo)準(zhǔn)偏差。胃竇松弛振幅和頻率分別減到28.4±3.4％和48.0±10.5％標(biāo)準(zhǔn)偏差。在腸中(D1)，機(jī)能亢奮更強(qiáng)收縮振幅和頻率分別增加到對照運(yùn)動行為的119.0±12.0％和1598.8±421.9％標(biāo)準(zhǔn)偏差。松弛振幅和頻率也分別增加到331.0±39.8％和724.4±180.75％標(biāo)準(zhǔn)偏差。
在約20％的實驗中，3-乙?；?DON和EN 139491誘導(dǎo)的機(jī)能亢奮并未顯示快速的大振幅行為。圖15顯示了這種情況的一個例子。雖然存在原始高頻率的運(yùn)動行為，但是大振幅的運(yùn)動行為還是被延遲，代之以比“組間”反應(yīng)大但小于MMC運(yùn)動行為的反應(yīng)。當(dāng)這種振幅中的“延遲”發(fā)生時，它通常持續(xù)3-10分鐘。此后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的機(jī)能亢奮的振幅增加到如圖16-19所示的MMC水平。這些DON衍生物化合物最初的不同的作用并未影響到誘導(dǎo)產(chǎn)生的消化道運(yùn)動行為的進(jìn)食模式的持續(xù)時間。
在第一次注射后90分鐘內(nèi)以最短時間再使用DON或其衍生物通常不產(chǎn)生影響。120分鐘后，DON和其衍生物又是有效的，并且能誘導(dǎo)消化道運(yùn)動行為的進(jìn)食模式。
前面所述的結(jié)果證明了DON和DON的類似衍生物3-乙?；腄ON(據(jù)報道此化合物在所有的單端孢霉烯中毒性最低)誘導(dǎo)消化道運(yùn)動行為的進(jìn)食模式的有效性。另外，合成了兩種新的DON基的衍生物(EN 139491和EN 139492)，它們能以至少與DON可比的方式誘導(dǎo)消化道運(yùn)動行為的進(jìn)食模式。所有的衍生物(以10mg/kg的劑量作為單獨的1ml大丸劑靜脈內(nèi)測試)具有與靜脈內(nèi)注射單獨大丸劑的DON相類似的性質(zhì)在麻醉的Sprague Dawley大鼠中進(jìn)行靜脈內(nèi)注射后的1分鐘內(nèi)，胃腸的自發(fā)的禁食模式變?yōu)榈湫偷倪M(jìn)食模式運(yùn)動行為。在胃竇中，振動的運(yùn)動行為被靜止的模式取代；在十二指腸中，DON誘導(dǎo)的持續(xù)的機(jī)能亢奮代替了環(huán)狀的“組合”MMC模式。這種影響持續(xù)40-60分鐘，然后該自發(fā)的運(yùn)動行為恢復(fù)到運(yùn)動行為的禁食模式。DON及其衍生物都沒有引起任何對血壓、心跳速率或呼吸速率可辨別的影響。
實施例5選擇性P2X1-2X3嘌呤受體拮抗劑2′，3′-O-(2，4，6-三硝基苯)基腺苷三磷酸(TNP-ATP)的影響。
本實施例證明存在于消化道組織的平滑肌上的P2X1嘌呤受體直接參與了調(diào)節(jié)消化道的運(yùn)動行為，以及P2X1-2X3嘌呤受體拮抗劑TNP-ATP封阻P2X1嘌呤受體從而抑制由DON或DON基的衍生物誘導(dǎo)的消化道運(yùn)動行為的進(jìn)食模式的能力。
先前的實施例使用一氧化氮(NO)合成抑制劑和嘌呤受體(如一般的P2受體拮抗劑蘇拉明、一般的P2X激動劑α，β-亞甲基ATP和P2Y激動劑甲基-硫醇-ATP)介導(dǎo)的反應(yīng)的抑制劑表示了大鼠和豬胃腸的固有的運(yùn)動抑制性神經(jīng)分布的藥理學(xué)特征。在最短的時間間隔內(nèi)用這些嘌呤受體激動劑再刺激表明產(chǎn)生了明顯的組織快速減敏，可使用這種減敏來封阻各嘌呤受體。其結(jié)果顯示大鼠近端十二指腸模擬的自發(fā)運(yùn)動行為中的松弛有差別地依賴于NO或ATP十二指腸“組合”MMC松弛對α，β-亞甲基ATP處理敏感，而“組間”松弛被NO合成抑制劑L-NAME抑制。另外，數(shù)據(jù)顯示NO不是自發(fā)的回腸松弛的介體。這些回腸松弛依賴于ATP通過P2X嘌呤受體以類似于MMC有關(guān)的松弛的形式起作用。
先前的實施例還顯示，任一運(yùn)動行為的干涉都有效地阻止了DON誘導(dǎo)的運(yùn)動行為的進(jìn)食模式。在本實施例中，我們進(jìn)一步研究了DON誘導(dǎo)的腸進(jìn)食模式運(yùn)動行為中產(chǎn)生的松弛是被P2X1嘌呤受體亞型介導(dǎo)的假設(shè)。這個研究使用一種新的嘌呤受體拮抗劑TNP-ATP〔Lewis等人，Br.J.Pharmacol.，1241463-1466(1998)〕，此拮抗劑已被用作離體測定P2X1和P2X3同聚體型的和P2X2/3異聚體型的嘌呤受體的作用的亞型選擇性拮抗劑(全組織的IC50在μM范圍內(nèi))〔Virginio等人，Mol.Pharmacol.，53969-973(1998)〕。據(jù)報道P2X3受體僅在感覺神經(jīng)元上表達(dá)〔Evans和Suprenant，Semin.Neurosci.，8217-223(1996)〕。這個研究代表P2X1選擇性拮抗劑TNP-ATP首次在體內(nèi)使用。目標(biāo)是確定P2X1受體在控制模擬胃腸的運(yùn)動行為中的作用以及直接測試P2X1嘌呤受體亞型介導(dǎo)DON誘導(dǎo)的消化道機(jī)能亢奮的假設(shè)。
如上面所述在大鼠模型中體內(nèi)測試4劑TNP-ATP。連續(xù)監(jiān)測Sprague Dawley大鼠的血壓、呼吸速率、蒼白和總體的健康狀況。在整個實驗中TNP-ATP沒有對這些參數(shù)產(chǎn)生明顯的影響，這種結(jié)果常常持續(xù)達(dá)6小時。
TNP-ATP沒有影響自發(fā)的胃運(yùn)動行為(未給數(shù)據(jù))。相反，靜脈內(nèi)注射單一大丸劑的TNP-ATP顯著地和特異性地影響了自發(fā)的十二指腸松弛。2.5mg/kg的TNP-ATP，其作用幾乎觀察不到。相反，4.5和5mg/kg的量則表現(xiàn)為超大的劑量，其效力也不一致。有時這些較高的劑量還對消化道運(yùn)動行為有一些非特異性的作用。
發(fā)現(xiàn)3.5mg/kg的TNP-ATP對于其作用是可再現(xiàn)地有效和特異的。在接下來的模型中的評估中選擇此劑量進(jìn)行。靜脈內(nèi)注射TNP-ATP(3.5mg/kg)對大鼠十二指腸(十二指腸位點D1)中自發(fā)的運(yùn)動行為的影響的典型的體內(nèi)記錄顯示在圖21中。TNP-ATP在注射時沒有產(chǎn)生任何反應(yīng)。但是，在注射后1分鐘內(nèi)，MMC有關(guān)的松弛減少了。“組間”運(yùn)動行為并未被顯著地影響。TNP-ATP注射后的30分鐘內(nèi)MMC有關(guān)的松弛運(yùn)動行為恢復(fù)到對照水平的90％以內(nèi)。
靜脈內(nèi)注射TNP-ATP(3.5mg/kg)對DON誘導(dǎo)的大鼠胃和十二指腸中的進(jìn)食模式運(yùn)動行為的影響的體內(nèi)記錄顯示在圖22(記錄十二指腸位點D1)和圖23(記錄十二指腸位點D2和胃竇位點S1)中。與其它所有的實驗一致，TNP-ATP在注射時并未引起任何反應(yīng)。但是，在注射后1分鐘內(nèi)，DON(10mg/kg，i.v.)的影響被顯著地減少。TNP-ATP的這種抑制作用由持續(xù)約5分鐘的最初顯著的影響(達(dá)到80％的抑制)、接著長時間的較淺的影響(達(dá)到40％的抑制)，但是DON作用的顯著拮抗作用組成。
TNP-ATP抗DON作用的能力表示在圖24-27的圖表中。圖24-27的柱形圖顯示靜脈內(nèi)用TNP-ATP進(jìn)行處理對DON誘導(dǎo)的近端十二指腸(D1)的松弛和收縮的影響。將TNP-ATP對DON誘導(dǎo)的松弛的振幅(圖24)和頻率(圖25)的影響與設(shè)為100％的“組合”MMC和對照“組間”運(yùn)動行為的松弛行為的振幅和頻率相比。同樣，將TNP-ATP對DON誘導(dǎo)的收縮的振幅(圖26)和頻率(圖27)與“組合”MMC和對照“組間”運(yùn)動行為的收縮行為的振幅和頻率比較。TNP-ATP作用的一致特征是DON誘導(dǎo)的十二指腸機(jī)能亢奮的振幅而非頻率的特異性減弱(比較圖24-27中的空白柱和方格柱)。TNP-ATP對DON誘導(dǎo)的十二指腸中機(jī)能亢奮的松弛行為的頻率的影響在給予TNP-ATP后的20秒內(nèi)是明顯的，松弛行為的頻率的最大減弱在2分鐘內(nèi)發(fā)生。DON引起的機(jī)能亢奮在給予TNP-ATP的35分鐘內(nèi)恢復(fù)，并恢復(fù)到給予TNP-ATP前的水平的90％。
評估了選擇性P2X1嘌呤受體拮抗劑TNP-ATP的效力。靜脈內(nèi)注射單一大丸劑的這種拮抗劑快速且特異地減弱MMC有關(guān)的松弛，這表明P2X1嘌呤受體涉及了消化道運(yùn)動行為。靜脈內(nèi)注射單一大丸劑的TNP-ATP以劑量依賴性的方式(暫時地)減少了DON誘導(dǎo)的進(jìn)食模式。這些結(jié)果證實使用一般的P2X受體拮抗劑得到的數(shù)據(jù)的趨勢。P2X嘌呤能位點代表腸途徑的高度受限的組份。該結(jié)果清除地顯示，P2X1受體亞型介導(dǎo)了十二指腸固有的嘌呤能抑制性神經(jīng)分布，封阻這些受體可代表一種抵消消化道中DON的影響的簡單方法。此外，數(shù)據(jù)支持這些受體位點是發(fā)展修改進(jìn)食行為的制劑的潛在靶標(biāo)。
本文納入所引用的所有的出版物作為參考。
權(quán)利要求
1.一種治療脊椎動物肥胖癥的方法，它包括給予所述動物無毒的、消化道活動調(diào)節(jié)量的單端孢霉烯或其衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的治療肥胖癥的方法，其特征在于，所述單端孢霉烯或其衍生物選自DON、瓜萎鐮毒素、曲古?？她?、單端孢菌素、3-乙?；鵇ON、7-乙?；撗豕衔牰舅亍?，15-二乙?；撗豕衔牰舅亍?-乙?；衔牰舅?鐮刀菌酮-X)、4，15-二乙?；衔牰舅?、異亞丙基DON、異亞丙基-3-乙酰基-DON、DON碳酸酯、3-乙?；?DON碳酸酯、3-乙?；?DON亞芐基縮醛和DON亞芐基縮醛。
3.如權(quán)利要求2所述的治療肥胖癥的方法，其特征在于，所述單端孢霉烯是DON。
4.如權(quán)利要求1所述的治療肥胖癥的方法，其特征在于，經(jīng)口、腸道外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)給予所述單端孢霉烯。
5.如權(quán)利要求4所述的治療肥胖癥的方法，其特征在于，經(jīng)口給予所述單端孢霉烯。
6.如權(quán)利要求1所述的治療肥胖癥的方法，其特征在于，所述脊椎動物選自靈長類動物、豬、牛、羊、鳥、馬、貓、狗和嚙齒動物。
7.如權(quán)利要求1所述的治療肥胖癥的方法，其特征在于，所述脊椎動物是人。
8.一種刺激脊椎動物消化道活動的進(jìn)食模式的方法，所述方法包括給予所述動物以無毒的、消化道活動調(diào)節(jié)量的單端孢霉烯或其衍生物、單端孢霉烯類似物、或者P2X1受體的非脫敏激動劑。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述單端孢霉烯或其衍生物選自DON、瓜萎鐮毒素、曲古?？她?、單端孢菌素、3-乙?；鵇ON、7-乙酰基脫氧瓜萎鐮毒素、3，15-二乙?；撗豕衔牰舅?、4-乙?；衔牰舅?鐮刀菌酮-X)、4，15-二乙?；衔牰舅亍悂啽鵇ON、異亞丙基-3-乙?；?DON、DON碳酸酯、3-乙?；?DON碳酸酯、3-乙?；?DON亞芐基縮醛和DON亞芐基縮醛。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述單端孢霉烯是DON。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，經(jīng)口、腸道外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)給予所述單端孢霉烯。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，經(jīng)口給予所述單端孢霉烯。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述脊椎動物選自靈長類動物、豬、牛、羊、鳥、馬、貓、狗和嚙齒動物。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述脊椎動物是人。
15.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述P2X1受體的非脫敏激動劑是ATP的類似物。
16.一種增加脊椎動物體重的方法，該方法包括給予所述動物以足夠量的ATP類似物，抑制進(jìn)食模式的消化道運(yùn)動行為。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述ATP類似物是P2X1嘌呤受體的脫敏激動劑或拮抗劑。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述ATP類似物選自α，β-亞甲基ATP和2′，3′-O-(2，4，6-三硝基苯基)-ATP。
19.一種阻止脊椎動物進(jìn)食模式的消化道運(yùn)動行為的方法，該方法包括給予ATP類似物。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述ATP類似物是P2X1受體的脫敏激動劑或拮抗劑。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述ATP類似物選自α，β-亞甲基ATP和TNP-ATP。
22.一種鑒定用于治療肥胖癥的化合物的方法，該方法包括確定該化合物是否能誘發(fā)進(jìn)食模式的消化道運(yùn)動行為。
23.如權(quán)利要求22所述的鑒定用于治療肥胖癥的化合物的方法，其特征在于，使用體外消化道器官浴試驗、離體消化道器官試驗或體內(nèi)消化道器官運(yùn)動活性試驗檢測所述化合物誘發(fā)進(jìn)食模式的消化道運(yùn)動活性的能力。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，將由所述化合物誘發(fā)的進(jìn)食模式的消化道運(yùn)動行為與由DON誘發(fā)的進(jìn)食模式的消化道運(yùn)動行為進(jìn)行比較。
25.一種誘發(fā)進(jìn)食模式的消化道運(yùn)動行為的藥學(xué)組合物，該組合物包括(a)選自瓜萎鐮毒素、4-脫氧瓜萎鐮毒素、曲古?？她?、單端孢菌素、3-乙酰基瓜萎鐮毒素、7-乙?；撗豕衔牰舅亍?，15-二乙?；撗豕衔牰舅?、4-乙?；衔牰舅?鐮刀菌酮-X)、4，15-二乙?；衔牰舅?、3-羥基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮-7，15-碳酸酯、3-乙酰氧基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮-7，15-碳酸酯、3-乙酰氧基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮、3-羥基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮、3-羥基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮、3-乙酰氧基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮的化合物及其組合；和(b)藥學(xué)上可接受的載體。
26.化合物3-羥基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮。
27.化合物3-乙酰氧基-7，15-異亞丙基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮。
28.化合物3-羥基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮-7，15碳酸酯。
29.化合物3-乙酰氧基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮-7，15-碳酸酯。
30.化合物3-乙酰氧基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮。
31.化合物3-羥基-7，15-亞芐基-12，13-環(huán)氧基-9-單端孢霉-8-酮。
全文摘要
本發(fā)明描述了調(diào)節(jié)消化道活動性和食物攝取的方法和組合物?？捎眠@些組合物和方法治療肥胖癥或刺激體重增重。控制食物攝取的優(yōu)選化合物是DON(4－乙?；衔牰舅?及其衍生物。本發(fā)明還公開了新穎的DON衍生物。
文檔編號A61P3/00GK1370066SQ00811624
公開日2002年9月18日 申請日期2000年7月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月6日
發(fā)明者A·克蘭蒂斯, T·德斯特 申請人:En法瑪有限公司