專利名稱：具有甲狀腺素5'脫碘酶活力抗體酶的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于具有甲狀腺素5’脫碘酶活力抗體酶的制備方法。
甲狀腺素是人體的一種必須激素，甲狀腺素與臨床上許多疾病相關(guān)。人體內(nèi)的甲狀腺素以兩種活性形式存在3，5，3’，5’-四碘甲狀腺素原氨酸(T4)和3，5，3’-三碘甲狀腺素原氨酸(T3)。T3的生物學(xué)活性是T4的8倍，是體內(nèi)活性甲狀腺素的主要形式。所有外周組織和血液中的T4都由甲狀腺合成，T3有85％以上來自于外周組織的甲狀腺素5’脫碘酶的催化產(chǎn)物。可見甲狀腺素5’脫碘酶對于甲狀腺素發(fā)揮生理功能具有重要意義。目前，人們共發(fā)現(xiàn)三種甲狀腺素脫碘酶，其中，I型甲狀腺素脫碘酶(IT45’D)是一種含硒的膜蛋白，廣泛存在于肝、腎、甲狀腺、肌肉等部位，大部分T3都由這種酶催化產(chǎn)生。1990年，有報道采用凝膠電泳法從相關(guān)組織中分離到了IT45’D。采用放射性同位素Se75標記，發(fā)現(xiàn)IT45’D是一種含硒酶。1991年Berry等(Nature，1991，349438-440)在蟾蜍卵母細胞中運用克隆表達技術(shù)從鼠肝中分離到了IT45’D的互補DNA，其中含有一個TGA密碼子來編碼硒代半胱氨酸。IT45’D中的硒以硒代半廣氨酸形式存在，并且是酶催化的必須氨基酸?？贵w酶是80年代后期發(fā)展起來的新的研究領(lǐng)域。它將免疫球蛋白的可變區(qū)賦予了酶的屬性，是具有催化活性的抗體蛋白。1986年，在單克隆抗體技術(shù)的基礎(chǔ)上，Schultz和Lerner才分別報道了首例具有水解酶活性的單克隆抗體。在短短十幾年中，抗體酶催化的反應(yīng)已達到了70多種。疏水腔修飾法是抗體酶設(shè)計的最新思想。中國專利96112628．0公開了丁蘭等人利用這種方法首次成功地制備出比天然酶活力高八倍的具有GSH-Px活力的抗體酶，采用谷胱甘肽衍生物為半抗原，以戊二醛共價交聯(lián)到牛血清白蛋白上，得到抗原結(jié)合部位存在疏水腔的與抗原具有強結(jié)合力的抗體，將催化中心通過化學(xué)誘變的方法，引入抗原結(jié)合部位，使抗體具有GSH-Px活性。
本發(fā)明的目的是提供一種具有甲狀腺素5’脫碘酶活力抗體酶的制備方法。該方法以甲狀腺素為半抗原，與牛血清白蛋白連接，免疫小鼠，制備具有與甲狀腺素結(jié)合能力的抗體，通過化學(xué)修飾，將IT45’D催化中心引入抗體，獲得具有IT45’D活力的抗體酶。
天然甲狀腺素側(cè)鏈為兩個鹵代的苯環(huán)，具有在抗體的抗原結(jié)合部位誘導(dǎo)出疏水結(jié)合環(huán)境的能力，本身就是很好半抗原分子。由于天然甲狀腺素不具備免疫原性，不能刺激動物產(chǎn)生抗體，所以首先將甲狀腺素通過戊二醛連接到牛血清白蛋白上，選擇個體較小，免疫機理較為清晰，免疫過程相對簡單、易于操作的純系Bab／C小鼠為免疫對象，通過對小鼠免疫，刺激免疫細胞，使其分泌具有甲狀腺素結(jié)合能力的抗體。為使免疫細胞的快速分裂，以便于大規(guī)模制備抗體，將小鼠免疫細胞與骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細胞進行克隆化，得到分泌目的抗體的單細胞克隆。將得到的細胞株擴大培養(yǎng)，注射入小鼠腹腔，從小鼠腹腔中制備含有目的抗體的腹水。通過親和層析分離純化，提純目的抗體。根據(jù)甲狀腺素脫碘酶的催化中心的結(jié)構(gòu)，將得到的具有甲狀腺素結(jié)合力的抗體通過化學(xué)修飾，以苯甲基磺酰氟將抗體甲狀腺素結(jié)合部位的絲氨酸的羥基活化，與硒氫化鈉反應(yīng)，將IT45’D的催化中心一SeH引入抗體的甲狀腺素結(jié)合部位，賦予抗體IT45’D的活力。本發(fā)明的制備具體步驟如下A．全抗原的制備將T4與牛血清白蛋白以30-50∶1(摩爾比)的比例溶解于pH8-11的Tris-HCl緩沖液中，其中，T4濃度為1-5mg／ml攪拌，逐漸滴加戊二醛，反應(yīng)10-24小時，加入甘氨酸終止反應(yīng)，除鹽，凍干。
B．單克隆抗體的制備a．免疫小鼠將抗原1-3mg／ml與福氏完全佐劑1∶1混合，搖勻，每只Bab／c小鼠注射100-300μl，兩周后進行二次免疫，第四到十周每隔兩周以福氏不完全佐劑免疫，用ELISA檢測抗體。
b．融合及抗體制備拉頸法處死小鼠，取脾臟，無菌條件下在預(yù)先放置培養(yǎng)液的平皿中去除脂肪組織，壓碎，吸取細胞懸液，離心，棄上清。用完全培養(yǎng)液反復(fù)洗滌，得到0．5-1．5×108個脾細胞。加入0．1-0．5倍數(shù)量的骨髓瘤細胞，混合，離心。棄去上清的培養(yǎng)液，吸取1ml聚乙二醇(PEG)／二甲亞砜(DMSO)加入細胞中，混合1分鐘。
將含有PEG的細胞懸液反復(fù)洗滌，加入選擇培養(yǎng)基，在培養(yǎng)板上37度、5％二氧化碳濃度下培養(yǎng)。一周后鏡檢，對明顯的細胞集落孔進行ELISA，取陽性孔梯度稀釋，擴大培養(yǎng)，進行初次克隆化。反復(fù)克隆化3-5次，即可獲得單細胞克隆。
將0．5-1．5×106的雜交瘤細胞注入Bab／C小鼠腹腔或采用體外培養(yǎng)法，在培養(yǎng)瓶中，得到腹水或培養(yǎng)上清。
c．分離提純抗體將腹水或體外細胞培養(yǎng)液離心，取上清采用親和層析或離子交換柱提純抗體，凍干。
C．抗體酶的制備將提純的抗體凍干粉5-10mg溶解在1ml除氧的pH6-8的磷酸緩沖液中，加入10-30μl 20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液， 室溫振蕩0．5-1小時，以氮氣為載體通入H2Se氣體10分鐘或加入50-200μl預(yù)先除氧的1MNaHSe溶液，30-40度在氮氣保護下反應(yīng)20-40小時。將反應(yīng)液離心，除鹽后凍干。即制得抗體酶凍干粉。
人們過去一直認為硒蛋白在體內(nèi)只是起到清除自由基和過氧化物的功能，IT45’D的發(fā)現(xiàn)又為硒蛋白和硒在人體內(nèi)的功能研究提供了新的研究領(lǐng)域。天然IT45’D由于具有親脂性、含量低等特點，使得其分離提純困難，大大限制了其研究和應(yīng)用，直到目前，人們對其機理的認識還只是一個假說。IT45’D的人工模擬酶的出現(xiàn)，對硒在該酶中所起到的作用及機理的假說提供了重要的證據(jù)。臨床上的亞急性克汀病的癥狀之一就是體內(nèi)T4含量高，而T3含量低，從而對整個機體的代謝產(chǎn)生影響。少數(shù)地方性甲狀腺腫的患者在補充了碘之后，癥狀仍得不到緩解，這些都被認為與甲狀腺素5’脫碘酶相關(guān)。天然酶不僅很難得到，而且穩(wěn)定性差，使其臨床應(yīng)用和研究受到了限制。抗體酶具有穩(wěn)定性好，易大規(guī)模制備等特點，為相關(guān)疾病治療提供了一種可行的途徑。
本發(fā)明提供的實施例如下實施例1(1)全抗原的合成將T41mg與牛血清白蛋白以50∶1(摩爾比)的比例溶解于pH9．020mmol／L的Tris-HCl的緩沖液中，攪拌，逐漸滴加等摩爾比的1ml戊二醛溶液，反應(yīng)12小時，加入1ml10mmol／L甘氨酸終止反應(yīng)，用20mmol／L pH 7．4磷酸緩沖液透析過夜，用紫外光譜測定半抗原連接量，每個牛血清白蛋白連接30個半抗原分子，凍干保存。
(2)單克隆抗體的制備a．免疫將全抗原2mg／ml與福氏完全佐劑以1∶1的比例混合，搖勻，每只Bab／c小鼠注射200μl，兩周后進行二次免疫，每隔兩周以福氏不完全佐劑免疫一次，融合前三天加強免疫。
b．抗體的檢測將酶標板每孔加入100μl5％戊二醛溶液，37度保溫15min，洗滌，拍干。加入100μl 1mg／ml的T4溶液，保溫1小時。每孔加入200μl的0．1mg／ml的牛血清白蛋白溶液，保溫1小時。加入待測血清或腹水，保溫1小時。每孔加入一個活力單位的酶標二抗，保溫1小時。加入底物反應(yīng)液100μl，37度反應(yīng)半小時，每孔加入50μl 2mmol／L硫酸溶液終止反應(yīng)，用酶標儀檢測。
c．融合及抗體的制備將血清檢測為陽性的小鼠用拉頸法處死，取脾臟，無菌條件下在預(yù)先放置培養(yǎng)液的平皿中去除脂肪組織，壓碎，吸取細胞懸液，離心，棄上清。用完全培養(yǎng)液反復(fù)洗滌，得到1．2×108個脾細胞。加入0．1倍數(shù)量的骨髓瘤細胞，混合，離心。棄去上清的培養(yǎng)液，吸取1ml PEG／DMSO加入細胞中，混合1分鐘。
將含有PEG的細胞懸液反復(fù)洗滌，加入選擇培養(yǎng)基，在培養(yǎng)板上37度、5％二氧化碳濃度下培養(yǎng)。一周后鏡檢，對明顯的細胞集落孔進行ELISA，取陽性孔梯度稀釋，擴大培養(yǎng)，進行初次克隆化。反復(fù)克隆化3次，獲得單細胞克隆。
將1×106的雜交瘤細胞注入Bab／C小鼠腹腔，得到腹水。
d．抗體的分離提純將小鼠腹腔內(nèi)的腹水6000rpm／min離心15分鐘，取上清，用60％硫酸胺沉淀，6000rpm／min離心20分鐘，棄上清，將沉淀用pH7．0的PBS溶解，過G-25柱除鹽。將洗脫液經(jīng)γ-Protein A親和層析柱分離提純，凍干得到精制抗體。
(3)抗體酶的制備及活力測定a．抗體酶的制備將提純的抗體凍干粉5mg溶解在1ml除氧的pH7．0的PBS中，加入20μl 20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液，室溫振蕩0．5小時，加入100μl預(yù)先除氧的1MNaHSe溶液，30度在氮氣保護下反應(yīng)40小時。將反應(yīng)液8000rpm／min離心，經(jīng)G-25除鹽后凍干。制得抗體酶凍干粉。
b．抗體酶活力測定采用放射免疫分析(RIA)法測活將抗體酶溶解在pH 7．4的700μlPBS中，加入100μl 10mM的DTT，加入10μM T4100μl，加入1f／100ml的BSA溶液100μl，37度反應(yīng)半小時，加入二倍體積的預(yù)冷乙醇，6000g離心10min，取上清，將反應(yīng)液稀釋至1-30／100ml T4，將反應(yīng)稀釋液加入預(yù)先包被有T4或T3的試管中，溫浴0．5小時，再加入帶有放射性I125標記的T4或T3溶液，溫浴0．5-1小時，測定每管的放射劑量。相同條件下以不同濃度的T4和T3制作標準曲線，在標準曲線中找出相應(yīng)的T4、T3濃度。
采用放射免疫法測得抗體酶活力為275U／mgPr(U-每分鐘轉(zhuǎn)化底物的pmol數(shù))實施例2(1)全抗原的合成將T4與牛血清白蛋白以30∶1(摩爾比)的比例混合于pH10的Tris-HCl 20mmol／L緩沖液中，攪拌，逐漸滴加戊二醛，反應(yīng)15小時，其它反應(yīng)條件同實施例1中(1)。
(2)單克隆抗體的制備a．將全抗原3mg／ml與福氏完全佐劑以1∶1的比例混合，搖勻，每只Bab／c小鼠注射200μl，兩周后進行二次免疫，每隔兩周以福氏不完全佐劑免疫一次，融合前三天加強免疫。
b．抗體的檢測同實施例1中(2)b。
c．融合及抗體的制備將血清檢測為陽性的小鼠用拉頸法處死，取脾臟，無菌條件下在預(yù)先放置培養(yǎng)液的平皿中去除脂肪組織，壓碎，吸取細胞懸液，離心，棄上清。用完全培養(yǎng)液反復(fù)洗滌，得到1．5×108個脾細胞。加入0．3倍數(shù)量的骨髓瘤細胞，混合，離心。棄去上清的培養(yǎng)液，吸取1mlPEG／DMSO加入細胞中，混合1分鐘。
將含有PEG的細胞懸液反復(fù)洗滌，加入選擇培養(yǎng)基，在培養(yǎng)板上37度、5％二氧化碳濃度下培養(yǎng)。一周后鏡檢，對明顯的細胞集落孔進行ELISA，取陽性孔梯度稀釋，擴大培養(yǎng)，進行初次克隆化。反復(fù)克隆化4次，獲得單細胞克隆。
將1．5×106的雜交瘤細胞注入Bab／C小鼠腹腔，得到腹水。
d．抗體的分離提純同實施例1中(2)d。
(3)抗體酶的制備及活力測定a．抗體酶的制備將10mg提純的抗體凍干粉溶解在1ml除氧的pH8的PBS中，加入30μl20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液，室溫振蕩50分鐘。加入200μl預(yù)先除氧的1mol／L NaSeH，40度在氮氣保護下反應(yīng)30小時，將反應(yīng)液8000轉(zhuǎn)每分鐘離心后，經(jīng)G-25柱除鹽，凍干，制得抗體酶凍干粉。
b．抗體酶活力測定采用放射免疫法測得抗體酶活力為290U／mgPr實施例3(1)全抗原的制備將T4與牛血清白蛋白以40∶1(摩爾比)的比例混合于pH11的Tris-HCl 20mmol／L緩沖液中，逐漸滴加戊二醛，攪拌24小時，其它反應(yīng)條件同實施例1中(1)。
(2)單克隆抗體的制備a．將全抗原(1mg／ml)與福氏完全佐劑以1∶1的比例混合，搖勻，每只Bab／c小鼠注射300μl，兩周后進行二次免疫，每隔兩周以福氏不完全佐劑免疫一次，融合前三天加強免疫。共免疫六周。
b．抗體的檢測同實施例1中(2)b。
c．融合及抗體的制備將血清檢測為陽性的小鼠用拉頸法處死，取脾臟，無菌條件下在預(yù)先放置培養(yǎng)液的平皿中去除脂肪組織，壓碎，吸取細胞懸液，離心，棄上清。用完全培養(yǎng)液反復(fù)洗滌，得到0．5×108個脾細胞。加入0．5倍數(shù)量的骨髓瘤細胞，混合，離心。棄去上清的培養(yǎng)液，吸取1ml PEG／DMSO加入細胞中，混合1分鐘。
將含有PEG的細胞懸液反復(fù)洗滌，加入選擇培養(yǎng)基，在培養(yǎng)板上37度、5％二氧化碳濃度下培養(yǎng)。一周后鏡檢，對明顯的細胞集落孔進行ELISA，取陽性孔梯度稀釋，擴大培養(yǎng)，進行初次克隆化。反復(fù)克隆化3次，獲得單細胞克隆。
將0．5×106的雜交瘤細胞注入Bab／C小鼠腹腔，得到腹水。
d．抗體的分離提純同實施例1中(2)d。
(3)抗體酶的制備及活力測定a．抗體酶的制備將5mg提純的抗體凍干粉溶解在1ml除氧的pH6的PBS中，加入10μl 20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液，室溫振蕩1小時。加入50μl預(yù)先除氧的1mol／L NaSeH，40度在氮氣保護下反應(yīng)20小時，將反應(yīng)液8000轉(zhuǎn)每分鐘離心后，經(jīng)G-25柱除鹽，凍干，制得抗體酶凍干粉。
b．抗體酶活力測定采用放射免疫法測得抗體酶活力為230U／mgPr
權(quán)利要求
1．一種具有甲狀腺素5’脫碘酶活力抗體酶的制備方法，其特征在于采用以下步驟完成A．全抗原的制備將T4與牛血清白蛋白以30-50∶1(摩爾比)的比例溶解于pH8-11的Tris-HCl緩沖液中，其中，T4濃度為1-5mg／ml攪拌，逐漸滴加戊二醛，反應(yīng)10-24小時，加入甘氨酸終止反應(yīng)，除鹽，凍干；B．單克隆抗體的制備a．免疫小鼠將抗原1-3mg／ml與福氏完全佐劑1∶1混合，搖勻，每只Bab／c小鼠注射100-300μl，兩周后進行二次免疫，第四到十周每隔兩周以福氏不完全佐劑免疫，用ELISA檢測抗體；b．融合及抗體制備拉頸法處死小鼠，取脾臟，無菌條件下在預(yù)先放置培養(yǎng)液的平皿中去除脂肪組織，壓碎，吸取細胞懸液，離心，棄上清，用完全培養(yǎng)液反復(fù)洗滌，得到0．5-1．5×108個脾細胞，加入0．1-0．5倍數(shù)量的骨髓瘤細胞，混合，離心，棄去上清的培養(yǎng)液，吸取1ml聚乙二醇(PEG)／二甲亞砜(DMSO)加入細胞中，混合1分鐘；將含有PEG的細胞懸液反復(fù)洗滌，加入選擇培養(yǎng)基，在培養(yǎng)板上37度、5％二氧化碳濃度下培養(yǎng)，一周后鏡檢，對明顯的細胞集落孔進行ELISA，取陽性孔梯度稀釋，擴大培養(yǎng)，進行初次克隆化，反復(fù)克隆化3-5次，獲得單細胞克隆，將0．5-1．5×106的雜交瘤細胞注入Bab／C小鼠腹腔或采用體外培養(yǎng)法，在培養(yǎng)瓶中，得到腹水或培養(yǎng)上清；c．分離提純抗體將腹水或體外細胞培養(yǎng)液離心，取上清采用親和層析或離子交換柱提純抗體，凍干；C．抗體酶的制備將提純的抗體凍干粉5-10mg溶解在1ml除氧的pH6-8的磷酸緩沖液中，加入10-30μl 20mg／ml的苯甲基磺酰氟的乙腈溶液， 室溫振蕩0．5-1小時，加入50-200μl預(yù)先除氧的1MNaHSe溶液，30-40度，在氮氣保護下反應(yīng)20-40小時，將反應(yīng)液離心，除鹽后凍干，制得抗體酶凍干粉。
全文摘要
本發(fā)明屬于具有甲狀腺素5’脫碘酶活力抗體酶的制備方法。該方法以甲狀腺素為半抗原,通過共價交聯(lián)的方法,與牛血清白蛋白連接,制備成全抗原,采用單克隆抗體技術(shù),制備具有甲狀腺素結(jié)合能力的抗體,通過化學(xué)修飾,將甲狀腺素脫碘酶的催化中心－SeH引入到抗體的抗原結(jié)合部位,賦予其甲狀腺素脫碘酶的活性。制得的抗體酶穩(wěn)定性好,活力達290U/mgPr。
文檔編號C12P21/08GK1294192SQ99121250
公開日2001年5月9日 申請日期1999年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月22日
發(fā)明者趙大慶, 陳默, 廉革偉, 林鳳, 丁蘭, 劉仔, 倪嘉纘 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所