專利名稱：用于診斷和治療的呼吸道合胞病毒表位和含有它們的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及呼吸道合胞病毒，特別是鑒定可用于由該病毒所致疾病的治療、預(yù)防和診斷領(lǐng)域的新表位和相應(yīng)的抗體。
呼吸道合胞病毒(RSV)是常見于嬰兒和老人中的病原體。細(xì)支氣管炎常是兒童中嚴(yán)重的疾病，需要住院治療?，F(xiàn)在還沒有預(yù)防由RSV引起的疾病的方法，RSV的第一次感染并不能阻止以后的感染?？股委?Ribayirine)和/或結(jié)合免疫治療(人免疫球蛋白)對于重病例并不能減輕病情。而且這類治療一直是很昂貴的。用ORAVAX的HNK20單克隆抗體(抗RSV的F蛋白)最近進(jìn)行的臨床試驗(yàn)表明，與安慰劑相比對兒童的RSV感染沒有治療效果。在60年代曾試圖用以甲醛滅活的RSV疫苗對兒童接種，結(jié)果是病情加重而非保護(hù)肺對抗RSV的自然感染。與此問題相關(guān)，現(xiàn)在的診斷試劑并不能可靠地鑒定RSV的感染，至少在成人中是如此。
RSV被歸于副粘病毒科，肺病毒屬，含有非節(jié)段負(fù)極性RNA基因組，編碼10種特異蛋白。
專利申請WO 87/04185提出在疫苗中使用RSV的結(jié)構(gòu)蛋白，如稱為蛋白F(融合蛋白)或蛋白G的包膜蛋白、22Kd的糖蛋白、9.5Kd的蛋白或衣殼的主蛋白(蛋白N)。
專利申請WO 89/02935描述了RSV的全蛋白F的保護(hù)特性，其以單體形式或脫糖化形式被修飾或未修飾。
已克隆了蛋白F的一系列片段以研究它們的中和特性。
WO 95/27787證明RSV的蛋白G可用于制備治療和/或預(yù)防RSV(A或B亞型)所致感染的產(chǎn)品。
本發(fā)明現(xiàn)發(fā)現(xiàn)含有特定表位的RSV病毒蛋白G的片段具有特別有利的性質(zhì)。因而可以制備RSV蛋白G的許多新肽片段，特別用于以下應(yīng)用
(i)通過化學(xué)方法或通過遺傳工程與載體偶聯(lián)或融合的所述肽片段構(gòu)成對抗RSV感染的有效疫苗，而無論疫苗施用方式如何；(ii)這些同樣的肽片段用于產(chǎn)生在RSV感染宿主的預(yù)防或治療中很有效的多克隆抗體和單克隆抗體；(iii)這些肽片段和單克隆抗體用作診斷試劑盒中的反應(yīng)物，該試劑盒可用于顯示和確認(rèn)RSV-A或RSV-B感染的宿主感染。
本發(fā)明的目的是提供抗RSV蛋白G之表位的多克隆抗體或單克隆抗體，所述表位相當(dāng)于選自RSV A或B蛋白G全序列中150-159、176-189、194-207和155-176氨基酸殘基間肽序列或具有至少80％、優(yōu)選至少98％相同性的序列的一種序列。
這些抗體能識(shí)別A亞型或B亞型RSV蛋白G的130-230氨基酸殘基間序列所含有的肽。
相應(yīng)于RSV A蛋白G 130-230氨基酸的該區(qū)域以下稱為G2Na。G2Na在細(xì)菌如大腸桿菌中產(chǎn)生，因而是非糖基化的。它可提供抗RSV感染的免疫保護(hù)，特別是當(dāng)它與一種載體偶聯(lián)時(shí)，載體如為革蘭氏陰性菌如克雷伯氏菌的OmpA(蛋白p40，描述于WO 96/14415)或衍生自鏈球菌的蛋白(如與人血清白蛋白結(jié)合的蛋白，以下稱為BB，描述于WO96/14416)。
已令人意外地證明，按本發(fā)明制備的一系列肽提供抗A亞型或B亞型RSV的交叉保護(hù)。
尤其是，重組蛋白BBG2a1在BALB/c小鼠中提供RSV-A或RSV-B的交叉保護(hù)，BB2a1是BBG2Na的一種衍生物，其中僅在G2Na基礎(chǔ)上修飾了4個(gè)殘基殘基Asn(aa191)、Lys(aa192)、Gly(195)和Thr(aa198)分別被殘基Ser、Asn、Lys和Pro置換。為了提高交叉保護(hù)的相同目的，制備了兩種新分子BBG2a2，其中殘基Asn(aa157)、Asn(aa160)、Asn(aa161)和Phe(aa163)分別被殘基Lys、Lys、Asp和Tyr置換；BBG2a3，其含有BBG2a1和BBG2a2的8個(gè)修飾氨基酸。
按照本發(fā)明特別有利的肽具有選自下列序列的一種序列在附件中給出的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21和/或SEQ ID No.22，這種肽另外還可以在N-末端或C-末端處含有至少一個(gè)半胱氨基酸殘基。
這些肽的反應(yīng)性通過單克隆或多克隆探針來證明。利用該技術(shù)揭示了G2Na的4個(gè)區(qū)域G5a(aa144-159)、G11a(aa164-176)、G4a(aa172-187)和G9a(aa190-204)。
因而本發(fā)明還涉及抗含有SEQ ID No.1至SEQ ID No.22的至少一種序列的肽的單克隆或多克隆抗體。
具有相應(yīng)于RSV蛋白G序列中表位150-159、176-189、194-207和155-176的一個(gè)或多個(gè)單元的肽，在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中將非常有用。
與載體蛋白偶聯(lián)的本發(fā)明可用作免疫原性劑。
載體蛋白有利地選自革蘭氏陰性細(xì)菌的OmpA和它們的片段、TT蛋白(破傷風(fēng)毒素)、鏈球菌的人血清白蛋白結(jié)合蛋白和其片段、及霍亂毒素的B亞單位(CTB)；優(yōu)選載體蛋白是克雷伯氏菌屬細(xì)菌的OmpA。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，肽與載體蛋白通過一種連接蛋白偶聯(lián)；該連接蛋白特別可以選自哺乳動(dòng)物血清白蛋白的受體和粘膜細(xì)胞表面的受體。
所述偶聯(lián)優(yōu)選是共價(jià)偶聯(lián)，這可以通過化學(xué)方法或通過DNA重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
另一方面，本發(fā)明涉及編碼如上所述肽或免疫原性劑的核苷酸序列。這特別可以是通過在編碼載體蛋白的DNA分子中插入或融合編碼權(quán)利要求4或5的肽或其片段的DNA(與啟動(dòng)子融合)而產(chǎn)生的雜合DNA分子；還可以是一種RNA分子。
本發(fā)明的肽、抗體、免疫原性劑和核苷酸序列可用作藥物，特別是用于制備治療或預(yù)防RSV A或B亞型所致感染的組合物。
例如，已制備了特異性識(shí)別G5a和G11a和G1ΔCa肽的單克隆抗體。在自然小鼠中被動(dòng)轉(zhuǎn)移單克隆抗體5C2(抗G5a)和18D1(抗G1ΔCa)能夠預(yù)防RSV-A的感染。另一方面，同樣的單克隆抗體5C2在免疫缺陷小鼠中能迅速消除RSV-A的慢性感染。
本發(fā)明因此還涉及一種藥物組合物，其特征在于它含有如上所定義的至少一種單克隆或多克隆抗體、本發(fā)明的肽或表位、免疫原性劑或核苷酸序列，及藥物可接受的賦形劑。
單克隆抗體優(yōu)選是人源化的，并通過重組方法產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，它們通過噬菌體文庫的方法獲得。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的肽、免疫原性劑、抗體和核苷酸序列可進(jìn)入診斷試劑盒的組成中。
如上文所述，免疫原性劑可通過DNA重組技術(shù)在宿主細(xì)胞中引入本發(fā)明的核苷酸序列來制備。這種核苷酸序列可以是一種融合基因，通過來源于質(zhì)粒、噬菌體、病毒和/或粘粒的DNA載體來引入。在該制備方法的一種實(shí)施方案中，所述融合基因可以整合在宿主細(xì)胞的基因組中。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，所述載體可以是病毒載體。
宿主細(xì)胞可以是原核的，特別選自大腸桿菌、芽孢桿菌、乳桿菌、葡萄球菌和鏈球菌。
但宿主細(xì)胞還可以是酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物來源的細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)方面，表達(dá)的融合蛋白是分泌的、處于胞漿中或暴露在宿主細(xì)胞的膜上。
下列實(shí)施例用于說明本發(fā)明。在這些實(shí)施例中參考下列附圖。


圖1和2在載體中克隆基因G2a1、G2a2和G2a3的原理。
圖3A-考馬斯藍(lán)染色的20％SDS-PAGE膠。M＝分子大小標(biāo)準(zhǔn)，泳道1和2為在HSA-Sepharose上親和純化的BBG2a1蛋白(理論分子量38.7Kd)。
B-BBG2a1蛋白用單克隆抗體18D1的免疫印跡。
圖4A-肽G5a和G9a的免疫原性。
B-肽G5a和G9a對肺的保護(hù)效力。
圖5A-肽G7a和G8a的免疫原性。
B-肽G7a和G8a對肺的保護(hù)效力。
圖6BBG2a1與RSV A(圖6A)和RSV B(圖6B)的免疫原性，和對抗RSVA(6C)和RSV B(6D)的保護(hù)效力。
圖7單克隆抗體18D1和5C2的治療效果。
圖8A-單克隆抗體18D1的預(yù)防效力。
B-單克隆克隆5C2的預(yù)防效力。
圖9BBG2Na免疫小鼠血清中存在的G2Na B表位的鑒定。A總體顯示；B未顯示155-176區(qū)。
圖10用Pepscan B方法確定單克隆抗體5B7的識(shí)別區(qū)域。
實(shí)施例實(shí)施例1肽的合成·肽G5aCys和CysG5a合成的實(shí)例?？s寫AA 氨基酸Boc叔丁氧羰基BHA溴代氫化琥珀酰亞胺基酸(Bromo hydrosuccimidyl acid)CE 毛細(xì)管電泳ESMS 電噴霧質(zhì)譜FMOC 芴基甲氧羰基FZCE 自由區(qū)毛細(xì)管電泳HBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽HMP對羥甲基苯氧基甲基聚苯乙烯MBHA 甲基二苯甲基胺NMPN-甲基-2-吡咯烷酮Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；鵕P-HPLC反相高效液相色譜SPPS 固相肽合成tBOC 叔丁氧羰基tBu叔丁基TFA三氟乙酸Trt三苯甲基肽G5a是一種16個(gè)氨基酸的肽，相應(yīng)于RSV-A蛋白G的一個(gè)片段(144-159)。通過固相化學(xué)合成法從C端到N端合成得到。肽CysG5a和G5aCys分別相應(yīng)于該肽在N-或C-端增加一個(gè)半胱氨酸，用于與載體蛋白的單一偶聯(lián)。這兩個(gè)肽可用于研究肽與載體蛋白的偶聯(lián)方向?qū)γ庖叻磻?yīng)的可能影響。
利用一種固相肽自動(dòng)合成儀從C端到N-端合成了這些肽(FMOC化學(xué)法，規(guī)模為0.1、0.25或1.0mmol)。肽GysG5a的合成從HMP型樹脂上預(yù)載的脯氨酸開始進(jìn)行，在裂解后可以獲得C-端的游離酸功能團(tuán)；或用Rink-酰胺MHBA型樹脂，在裂解后可以獲得C-端的酰胺功能團(tuán)。肽G5aCys的合成從該兩種樹脂中任一種上預(yù)載的半胱氨酸開始。所用氨基酸的側(cè)鏈反應(yīng)性功能團(tuán)用FMOC化學(xué)的適宜基團(tuán)保護(hù)[Cys(Trt)；Arg(Pmc)；Asn(Trt)；Gln(Trt)；Lys(Soc)；Ser(tBu)；Thr(tBu)]。偶聯(lián)循環(huán)按如下方式進(jìn)行用哌啶將第一個(gè)氨基酸的N-端胺功能團(tuán)脫保護(hù)，將待偶聯(lián)的第二個(gè)氨基酸的酸功能團(tuán)用HBTU/HMP活化，然后偶聯(lián)。在合成結(jié)束時(shí)將肽從樹脂上解下，通過與水/TFA混合物的反應(yīng)將側(cè)鏈脫保護(hù)。用預(yù)冷至-40℃的醚沉淀肽，并離心混合物。用醚洗脫沉淀三次，然后在氮?dú)庀赂稍铩Ｓ煤?.1％TFA的水重懸沉淀。將懸液再離心，將含有肽的上清液與沉淀分離，沉淀中含有樹脂。粗肽用半制備性反相HPLC純化。純化肽的均質(zhì)性通過反相HPLC及毛細(xì)管電泳(FZCE)驗(yàn)證。通過比較ES-MS質(zhì)譜測得的質(zhì)量與從氨基酸理論序列計(jì)算的質(zhì)量的相符性，證實(shí)了理論結(jié)構(gòu)。·肽CysG5aNH2合成用于合成的樹脂-肽理論重量593mg氮?dú)庀赂稍锖鬁y得的重量 619mg樹脂-肽裂解和粗肽分析200mg(批重的1/3)凍干后裂解粗肽的質(zhì)量 84mg(肽凈重的75％，即收率為97％)粗肽的均質(zhì)性 97％(RP-HPLC；UV210nm)97％(FZCE/MicrocoatTM)純化凍干后純化肽的質(zhì)量 50mg(肽凈重的75％，即收率為58％)鑒定純化肽的均質(zhì)性 ＞99％(RP-HPLC；UV210nm)＞99％(FZCE/MicrocoatTM；UV200nm)質(zhì)譜(ES-MS)計(jì)算質(zhì)量1951.29Da實(shí)測質(zhì)量1950.80Da±0.31。實(shí)施例2肽G5a、G7a、G8a、G9a、G11a和G11ΔCa與載體蛋白(P40、BB、TT、KLH)的偶聯(lián)·肽G11ΔCa與蛋白P40偶聯(lián)的實(shí)例肽G11ΔCa(SEQ ID No.14)是一個(gè)源自RSV蛋白G的13個(gè)氨基酸的肽，它相應(yīng)于該蛋白的164-176間的序列。在合成時(shí)，173位的Cys殘基已被Ser殘基置換，以便僅保留176位的一個(gè)Cys殘基，避免形成天然蛋白G(1-4/2-3配對)中不存在的1-2二硫橋。
該肽已借助戊二醛偶聯(lián)(均雙官能反應(yīng)物，與胺和硫醇功能團(tuán)偶聯(lián))或借助于BHA進(jìn)行單一偶聯(lián)(異雙官能反應(yīng)物，與C末端位半胱氨酸的硫醇功能團(tuán)偶聯(lián))?！ねㄟ^BHA的單一偶聯(lián)·肽G11ΔCa的溶解將2mg G11ΔCa溶解在2ml pH7 0.1M磷酸緩沖液+0.1％Zwittergent 3-14中?！そ柚诋愲p官能反應(yīng)物(BHA)與蛋白P40的單一偶聯(lián)將3mg BHA在25μl DMF中的溶液加入到預(yù)先對pH7 0.1M磷酸緩沖液+0.1％Zwittergent 3-14透析過的2.5mg蛋白P40中，并在室溫下攪拌1小時(shí)。在PD10柱上脫鹽后，用pH7 0.1M磷酸緩沖液+0.1％Zwittergent 3-14洗脫，每500μl一管進(jìn)行收集，將含有溴代乙酰化蛋白的管合并(在280nm下測OD)在含有0.95ml G11ΔCa溶液的管中。將反應(yīng)介質(zhì)用氮?dú)怙柡停覝叵潞诎抵袛嚢?小時(shí)。然后將該溶液對pH7 0.1M磷酸緩沖液+0.1％Zwittergent 3-14于+4℃攪拌下透析過夜，冷凍保存所得溶液?！そ柚诰p官能反應(yīng)物(戊二醛)與蛋白P40的偶聯(lián)將10mg P40對pH7 0.1M磷酸緩沖液+0.1Zwittergent 3-14透析。用pH9 0.1M碳酸鹽緩沖液+0.1％Zwittergent 3-14調(diào)節(jié)濃度至2mg/ml?？谌?00mg SDS的4％溶液。
將55.5μl 2.5％的戊二醛加入到肽G11ΔCa在pH9 0.1M碳酸鹽緩沖液+0.11％Zwittergent 3-14中的2.5ml 1mg/ml溶液(pH在9-10之間)中。+4℃下攪拌反應(yīng)介質(zhì)24小時(shí)，然后升至室溫。加入25μl 1M賴氨酸阻止反應(yīng)。將該溶液于+4℃攪拌下對pH7 0.1M磷酸鹽緩沖液+0.1％Zwittergent 3-14透析24小時(shí)。收集透析液，用0.02M KCl溶液沉淀6次除去SDS。最終的上清液中含有P40-G11ΔCa戊二醛偶聯(lián)物，于-20℃下冷凍保存?！づ悸?lián)物的滅菌將偶聯(lián)物解凍，無菌過濾(0.22μm)，分份于+4℃下保存以避免沉淀問題。·偶聯(lián)物的分析鑒定偶聯(lián)物通過如下方法鑒定用Lowry法進(jìn)行蛋白測定，用SDS-PAGE電泳(考馬斯藍(lán)顯色)；氣相酸水解后測定氨基酸，用PITC衍生化并經(jīng)HPLC分析
實(shí)施例3基因G2a1、G2a2在表達(dá)載體pvaBB308中的克隆，融合蛋白BBG2a1和BBG2a2在大腸桿菌中的產(chǎn)生基因G2a1(SEQ ID No.15)、G2a2(SEQ ID No.16)和G2a3(SEQ IDNo.17)在載體中克隆的原理示于圖1和2中。3.1 G2a1的構(gòu)建利用質(zhì)粒pRIT28G2Na作為起始材料通過定向誘變構(gòu)建編碼蛋白G2a1的基因(SEQ ID No.15)。為此，在下列條件下用寡核苷酸對RIT29/TH137(PCR1)和RIT30/TH136(PCR2)進(jìn)行了兩個(gè)PCR反應(yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))PCR(94℃，15秒25個(gè)循環(huán) (55℃，30秒(72℃，30秒·在磁珠上固定將分別從反應(yīng)1和2中獲得約262bp和208bp的片段固定在磁珠上。將25μl與鏈親和素偶聯(lián)的磁珠DYNALM-280預(yù)先用T.E.緩沖液(10mM Tris；1mM EDTA，pH7.5)洗兩次，然后在37℃與90μl擴(kuò)增反應(yīng)液1和2保溫20分鐘。固定后，將磁珠與50μl 0.5M NaOH在室溫下保溫10分鐘，片段被變性。收集2種上清液，用無水乙醇沉淀，重懸于5μ1水中?！ぱ由旆磻?yīng)該反應(yīng)是在如下條件下取每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)液10μl通過PCR完成的(95℃，15秒5個(gè)循環(huán) (35℃，30秒(72℃，30秒。
產(chǎn)生的片段用寡核苷酸RIT27和RIT28進(jìn)行PCR擴(kuò)增(95℃，15秒25個(gè)循環(huán) (55℃，30秒(72℃，30秒。
將509 bp的擴(kuò)增片段用限制酶Pst I和HindIII消化。將產(chǎn)生的169bp的片段克隆到用相同酶消化的載體pRIT28中。
所得質(zhì)粒pRIT28G2a1 down用染料脫氧終止子化學(xué)按AppliedBiosystem(Perkin Elmer)描述的方法測序。
將pRIT28G2a1 down的PstI/Hind III片段(PstI位點(diǎn)下游的片段)克隆在載體pRIT28G2Na中得到質(zhì)粒pRIT28G2a1。
基因G2a1然后被克隆到表達(dá)載體pvaBB308的限制位點(diǎn)EcoRI/HindIII上，生成載體pyaBBG2a1。
寡核苷酸的序列如下所示RIT275′-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3′RIT285′-AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG-3′TH1365′-CCGAAGAAAAAACCGACGACCAAACCGACC-3′TH1375′-TTTTTTCTTCGGTTTGTTGCTCGGG-3′RIT295’生物素化的RIT27。
RIT305’生物素化的RIT28。3.2.G2a2的構(gòu)建(SEQ ID No.16)
克隆原理示意圖見圖2的下方。
在該構(gòu)建中使用的寡核苷酸對如下RIT29/TNG193(PCR1)，和TNG192/RIT30(PCR2)。寡核苷酸的序列如下所示TNG 1925′-CCGCCGAAAAAACCGAAAGACGAT-3′TNG 1935′-CGAAATGGTAATCGTCTTTCGG-3′3.3 G2a3的構(gòu)建(SEQ ID No.17)將單一PstI位點(diǎn)上游和下游的兩個(gè)片段集中在同一個(gè)載體中，產(chǎn)生pRIT28G2a3。
三個(gè)插入片段G2a1、G2a2和G2a3已克隆在大腸桿菌中的不同表達(dá)載體中，特別是我們實(shí)施例中的載體pvaBB308，其中BB為編碼白蛋白受體的基因。所產(chǎn)生的融合蛋白BBG2a1、BBG2a2和BBG2a3可通過HSA-Sepharose(人血清白蛋白)柱很容易地親和純化。3.4融合蛋白BBG2a1和BBG2a2的發(fā)酵和純化在兩個(gè)錐形燒瓶中含氨芐青霉素(100μg/ml，Sigma)和四環(huán)素(8μg/ml，Sigma)的250ml TSB培養(yǎng)基(胰蛋白酶大豆培養(yǎng)液，Difco)中，接種分別用質(zhì)粒pvaBBG2a1和pvaBBG2a2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌RV308。在T°＝37℃及攪拌下培養(yǎng)16小時(shí)。將200ml該培養(yǎng)液接種在含有2升培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中(CHEMAP CF3000，ALFA LAVAL)。培養(yǎng)基中含有(克/升)甘油，5；硫酸銨，2.6；磷酸二氫鉀，3；磷酸氫二鉀，2；檸檬酸鈉，0.5；酵母提取物，1；氨芐青霉素，0.1；四環(huán)素，0.008；硫胺素，0.07；硫酸鎂，1和1ml/l微量元素溶液及0.65ml/l維生素溶液。發(fā)酵過程中的控制參數(shù)為pH、攪拌、溫度，通氧率、聯(lián)合供料(甘油或葡萄糖)。pH調(diào)至7.0，溫度固定在37℃。以恒定流量(12ml/h)的甘油(87％)供料控制生長，保持溶解氧的張力信號(hào)為30％。當(dāng)培養(yǎng)液的濁度(580nm下測定)達(dá)到80(培養(yǎng)約24小時(shí)后)時(shí)，加入吲哚丙烯酸(IAA)至終濃度25mg/l誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。誘導(dǎo)后約4小時(shí)，離心收集細(xì)胞。所獲生物量的收率為約200克(濕重)。BBG2a1和BBG2a2的產(chǎn)率為約4-6mg蛋白/克生物量。
將30克濕生物量重懸于70mlTST溶液(pH8.0 50mM Tris-HCl，200mM NaCl，0.05％Tween20和0.5mM EDTA)。超聲破碎細(xì)胞(Vibracell72401，Sonics & Materials)。離心細(xì)胞裂解液后，過濾(1.2μM)上清液并在500ml TST中稀釋。以溶解形式獲得的融合蛋白按已述方法(Stanl等，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)，1989；12443-52)在親和柱HSA-Sepharose(人血清白蛋白)上純化。
離心后，不溶的裂解物用緩沖液洗一次(pH8.5 50mM Tris-HCl；5mM MgCl2)。洗滌后將沉淀溶解在30ml 7M鹽酸胍、25mMTris-HCl(pH8.5)、10mM二硫蘇糖醇(DTT)中，然后在37℃保溫2小時(shí)。將溶解的蛋白加入到變性緩沖液中(25mM Tris-HCl(pH8.5)；150mM NaCl和0.05％Tween 20)。在加入溶解的融合蛋白前，調(diào)節(jié)變性緩沖液中鹽酸胍的終濃度為0.5M。中度攪拌下室溫下將混合物保溫16小時(shí)。離心后，上清液中的可溶融合產(chǎn)物在HSA-Sepharose柱上純化。純化的融合蛋白在MINI PROTEAN II SYSTEM(BIORADS)儀器上用SDS-PAGE(12％)膠分析。用考馬斯亮藍(lán)R250將蛋白顯色。另外，用RSV特異抗體進(jìn)行的免疫印跡對重組蛋白的分析表明，這些蛋白是抗原性的(見圖3中BBG2a的SDS膠和免疫印跡的實(shí)例)。實(shí)施例4與P40偶聯(lián)的肽G5a和G9a的免疫原性和保護(hù)效力材料和方法每組7只的各組小鼠用20μg P40-G9aCys、P40-CysG5a或P40-G5aCys腹膜內(nèi)免疫2次。對照小鼠用PBS免疫。水凝膠(20％v/v)用作所有免疫的佐劑。最后一次免疫后2周從眶后竇取血以證實(shí)對RSV-A的血清轉(zhuǎn)化，再過一周后用105TCID50RSV-A鼻內(nèi)(i.n.)攻擊，攻擊后5天處死小鼠。取出肺并測定肺中的病毒滴度。結(jié)果體液免疫反應(yīng)如圖4A中所述，肽G5a的免疫原性依賴于與P40的偶聯(lián)方向。用肽的C-末端偶聯(lián)時(shí)，在血清中誘導(dǎo)了弱到中度的抗-RSV-A抗體滴度。而用N-末端偶聯(lián)時(shí)，G5a不誘導(dǎo)這種抗體。一般而言，肽G9a以C-末端與P40偶聯(lián)時(shí)就誘導(dǎo)抗RSV-A抗體而言具有弱免疫原性。用P40-G9aCys免疫的小鼠中，7只中一只產(chǎn)生了高滴度血清抗體。肽G5a和G9a的肺保護(hù)效力如圖4B中所示，與抗RSV-A抗體的檢測結(jié)果直接相關(guān)，肽G5a當(dāng)以C-末端偶聯(lián)時(shí)誘導(dǎo)了保護(hù)性免疫反應(yīng)，而以N-末端偶聯(lián)時(shí)則不能。實(shí)際上，7只用P40-G5aCys(以C-末端偶聯(lián))免疫的小鼠中6只被保護(hù)，在肺中沒有出現(xiàn)病毒，最后一只只出現(xiàn)試驗(yàn)檢測限水平的病毒。而用P40-CysG5a(以N-末端偶聯(lián))免疫的小鼠在肺中有與對照小鼠同樣高的病毒滴度，對照組用PBS免疫。這些結(jié)果證實(shí)該肽與載體蛋白的偶聯(lián)方向是其保護(hù)效力的關(guān)鍵所在。這種保護(hù)與抗RSV-A抗體誘導(dǎo)間的關(guān)聯(lián)提示這種肺保護(hù)至少部分是由抗體介導(dǎo)的。
雖然就誘導(dǎo)抗RSV-A血清抗體而言P40-G9aCys在小鼠中只有弱免疫原性，但7只中5只小鼠的肺受到對抗RSV-A攻擊的保護(hù)。實(shí)際上，7只中一只小鼠在肺中沒有出現(xiàn)病毒，甚至在血清中沒有抗RSV-A的抗體。結(jié)論肽G5a和G9a含有針對RSV-A肺感染的保護(hù)性表位。G5a與載體蛋白的偶聯(lián)方向?qū)ζ浔Ｗo(hù)效力是關(guān)鍵的。實(shí)施例5肽G7a和G8a的免疫原性和保護(hù)效力材料和方法每組3-4只的各組小鼠用20μg G7a、G8a、BB-G7a或BB-G8a腹膜內(nèi)免疫2次。對照小鼠用PBS免疫。水凝膠(20％v/v)用作所有免疫的佐劑。最后一次免疫后2周從眶后竇取血以證實(shí)對RSV-A的血清轉(zhuǎn)化，再過一周后用105TCID50RSV-A鼻內(nèi)(i.n.)攻擊，攻擊后5天處死小鼠。取出肺并洗滌鼻道測定肺和鼻道中的病毒滴度。結(jié)果體液免疫反應(yīng)如圖5A中所示，兩種肽G7a和G8a與BB偶聯(lián)與否都對RSV-A是免疫原性的。如果考慮血清的抗體滴度，非偶聯(lián)的肽看來比偶聯(lián)肽的免疫原性強(qiáng)些。肽G7a和G8a的肺保護(hù)效力如圖5B中所示，用肽G7a或G8a(與BB偶聯(lián)或否)免疫的所有小鼠的肺都被保護(hù)對抗了RSV-A的攻擊，不出現(xiàn)病毒或僅有試驗(yàn)檢測限水平的病毒。結(jié)論肽G7a和G8a含有對肺的保護(hù)性表位。這些肽與BB偶聯(lián)或不偶聯(lián)均有效。實(shí)施例6融合蛋白BBG 2a1的免疫原性和保護(hù)效力材料和方法為了確定BBG 2a1對RSV-A和B的免疫原性和保護(hù)效力，每組3只的各組小鼠用20μg蛋白以2周的間隔腹膜內(nèi)分別免疫2次和3次。對照小鼠用PBS免疫。水凝膠(20％v/v)用作所有免疫的佐劑。最后一次免疫后2周從眶后竇取血以證實(shí)對RSV-A的血清轉(zhuǎn)化，再過一周后用105TCID50RSV-A鼻內(nèi)(i.n.)攻擊，攻擊后5天處死小鼠。取出肺并測定肺中的病毒滴度。結(jié)果BBG2a1針對RSV-A和B的免疫原性示于圖6A和B中的結(jié)果證明BBG2a1能夠誘導(dǎo)抗RSV-A和B的抗體。如所預(yù)料的那樣，抗RSV-A抗體的滴度比抗RSV-B抗體的滴度高得多。但抗RSV兩個(gè)株的抗體滴度都提高了。BBG2a1針對RSV-A和RSV-B的保護(hù)效力如圖6C和D中所示，用BBG2a1免疫小鼠誘導(dǎo)了能夠保護(hù)肺對抗RSV-A攻擊及對抗RSV-B攻擊的免疫應(yīng)答。用RSV-A攻擊的小鼠受到保護(hù)，使得在肺中不出現(xiàn)病毒(2/3小鼠)或僅有檢測限水平的病毒(1/3小鼠)。用RSV-B攻擊的小鼠受到保護(hù)，使得在肺中不出現(xiàn)病毒(1/3小鼠)，或只有檢測限水平的病毒(1/3小鼠)或有略大于該檢測限的病毒(1/3小鼠)。結(jié)論融合蛋白BBG2a1對RSV-A和對RSV-B是高免疫原性的。BBG2a1能夠誘導(dǎo)保護(hù)肺對抗RSV兩個(gè)亞型攻擊的應(yīng)答。實(shí)施例718D1、5C2和5B7抗體的獲取免疫接種的肽為(i)與KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白)偶聯(lián)的G1ΔCa，(ii)G2ΔCa，和(iii)BBG2aNa。
在第0天用CFA(完全弗氏佐劑)中的50μg抗原腹膜內(nèi)免疫小鼠，在第14天用IFA(不完全弗氏佐劑)中的10μg各抗原腹膜內(nèi)免疫，然后在第38天用10μg各肽無佐劑靜脈內(nèi)免疫。在第42天取出脾，與SP2-0骨髓細(xì)胞以1/1的比例融合。保留抗各抗原的陽性雜交瘤。將這些雜交瘤注射給小鼠以獲得腹水，然后所得的不同抗體用不同的肽篩選，以確定所得抗體的特異性。以其抗肽G1ΔCa、G5a特異性被篩選出來的單克隆抗體18D1、5C2特異性地識(shí)別RSV-A。從BBG2Na獲得并識(shí)別肽G11a的單克隆抗體5B7能夠識(shí)別RSV-A。實(shí)施例8單克隆抗體18D1和5C2對SCID小鼠中RSV-A慢性感染的治療效果材料和方法用105TCID50的RSV-A(50μl)鼻內(nèi)(i.n.)攻擊C.B-17 scid/scid小鼠。26天后，每組7只小鼠，鼻內(nèi)(i.n.)途經(jīng)接受抗RSV-A ELISA滴度為104的50μl 18D1抗體或5C2抗體制備液。對照小鼠接受抗BBELISA滴度為104的抗BB血清。5天后處死動(dòng)物，并取出它們的肺用于病毒測定。結(jié)果圖7中所示結(jié)果證明單克隆抗體18D1和5C2能夠消除SCID小鼠的RSV-A慢性感染，而且是殺毒性質(zhì)的。在處死動(dòng)物時(shí)沒有檢測到任何病毒痕跡。在用5C2處理的小鼠肺中獲得的結(jié)果相應(yīng)于該實(shí)驗(yàn)的平均檢測限，該檢測限由于缺少樣本而較高，但不相當(dāng)于病毒存在。結(jié)論抗克隆抗體5C2和18D1可以用于RSV-A肺感染領(lǐng)域的治療。實(shí)施例9單克隆抗體18D1對小鼠RSV-A感染的預(yù)防效果材料知方法一組RSV-A血清陰性的自然BALB/c小鼠接受抗RSV-A ELISA滴度調(diào)至105的18D1抗體制備液200μl的腹膜內(nèi)注射。對照小鼠腹膜內(nèi)接受抗P40 ELISA滴度調(diào)至104的200μl抗P40血清(不相關(guān)血清)的平行注射。次日，所有的小鼠鼻內(nèi)(i.n.)用含105TCID50RSV-A的50μl病毒懸液感染。5天后處死動(dòng)物，用于肺中病毒的檢測。結(jié)果如圖8A所示，抗體18D1在腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移后能夠誘導(dǎo)對抗RSV-A攻擊的小鼠肺保護(hù)。在注射105滴度的18D1 300μl后，所有的小鼠都得到了保護(hù)。7只中3只的保護(hù)程度為肺中不出現(xiàn)病毒。其余的小鼠中顯示僅達(dá)實(shí)驗(yàn)檢測限的痕量病毒(3只/7只)，或略高于該檢測限(1只/7只)。對照小鼠的滴度在每克肺log103.70-4.45之間。結(jié)論抗體18D1能夠預(yù)防RSV-A對BALB/c小鼠的肺感染，證明了其強(qiáng)預(yù)防效力。實(shí)施例10單克隆抗體5C2對小鼠RSV-A感染的預(yù)防效果材料和方法RSV-A陰性血清的自然小鼠鼻內(nèi)(i.n.)轉(zhuǎn)移接受抗RSV-A ELISA滴度調(diào)至104的5C2制備液50μl。對照小鼠平行接受抗BB ELISA滴度調(diào)至104的抗BB血清。
次日，所有小鼠用含105TCID50RSV-A的病毒懸液50μl鼻內(nèi)(i.n.)感染。5天后處死動(dòng)物用于肺中病毒測定。結(jié)果如圖8B中所示，所有用104滴度的5C2處理的小鼠的肺均被保護(hù)。7只中只有一只有病毒痕跡。對照小鼠的病毒滴度在每克肺log103.70到4.70間。結(jié)論5C2抗體能夠預(yù)防BALB/c小鼠的RSV-A肺感染，證明了其強(qiáng)預(yù)防效力。實(shí)施例11Pepscan覆蓋G2Na的aa130-230序列并以一個(gè)氨基酸互相重疊的94個(gè)八肽的多重合成實(shí)例按Geysen等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci)，1984，81，3998-4002描述的MULTIPINTM技術(shù)準(zhǔn)備一個(gè)平行合成96個(gè)八肽的“PEPSCAN”板(2個(gè)對照肽+94個(gè)覆蓋RSV-A蛋白G 130-230序列的肽)。
這些肽在ELISA微滴定板的互補(bǔ)96“針”(8×12)末端固體支持物上合成，將在該板中直接進(jìn)行單克隆或多克隆(血清)抗體的篩選?！め樅涂椎亩ㄎ幌到y(tǒng)使用下列編號(hào)系統(tǒng)A1(1)位＝A號(hào)板，1行(共12行)1列(ELISA中的H1位)A2(1)位＝A號(hào)板，2行，1列(ELISA中的H2位)A1(1)對照肽#1PLAQGGGGA2(1)對照肽#2PLAQGGGGA3(1)八肽#1TVKTKNTTA4(1)八肽#2VKTKNTTT等等A12(8)八肽#94KEVPTTKP?！ず铣稍摵铣上鄳?yīng)于脫保護(hù)、洗滌和偶聯(lián)的多個(gè)循環(huán)，直到獲得目的肽序列。在合成結(jié)束時(shí)，將肽N-乙?；?，再將側(cè)鏈脫保護(hù)。
用于在針上合成的氨基酸是用基團(tuán)Fmoc(9-芴基甲氧羰基)和下列側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的叔丁基醚(tBu)用于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，叔丁基酯(OtBu)用于天冬氨酸和谷氨酸，叔丁氧羰基(Boc)用于賴氨酸，組氨酸和色氨酸，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基(Pmc)用于精氨酸，三苯甲基(Trt)用于半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。酸功能團(tuán)的活化用溶于DMF中的二異丙基碳二亞胺(DIC)和1-羥基苯并三唑(HOBt)進(jìn)行。·Fmoc脫保護(hù)和洗滌在室溫?cái)嚢柘?。，將針板浸入在?00ml 20％哌啶DMF溶液(40/160ml)的浴槽中達(dá)20分鐘。然后從浴槽中取出這些針。將這些針在紙巾上拍打除去多余的溶劑。在200ml DMF中于室溫?cái)嚢柘孪瘁槨⑦@些針在紙巾上拍打，并完全浸入甲醇溶中2分鐘，無攪拌。然后將這些針浸入在200ml甲醇中(3個(gè)浴，每個(gè)2分鐘，200ml/浴)。將板干燥30分鐘。·Fmoc-氨基酸的偶聯(lián)在能夠偶聯(lián)之前Fmoc-氨基酸要經(jīng)過一個(gè)活化步驟。偶聯(lián)步驟的持續(xù)時(shí)間對于100mM的濃度、1.5當(dāng)量HOBt和1.2當(dāng)量DIC來說為2小時(shí)。有軟件可以計(jì)算偶聯(lián)步驟所需的反應(yīng)物的量。在按氨基酸單字代碼字母順序排列的試管中進(jìn)行稱重。在天平外的一張紙巾上填充試管，然后稱重直到獲得接近稱量紙上所指示的重量。該重量與理論值相比不應(yīng)少0.2mg，也不應(yīng)多出0.9mg?！づ悸?lián)步驟將針輕輕地放入各孔中。小心地關(guān)閉盒子，在2小時(shí)的偶聯(lián)過程中(氨基酸濃度為100mM)放在通風(fēng)廚中。每天可以進(jìn)行3次這樣的2小時(shí)偶聯(lián)?！づ悸?lián)后針堆的處理將針從含有偶聯(lián)溶液的板中取出，攪拌下用200ml甲醇洗滌5分鐘。將針堆在紙巾上拍打并涼干2分鐘。將針置于200mlDMF中，并在攪拌下洗滌5分鐘，然后再進(jìn)行接下來的脫保護(hù)循環(huán)。常規(guī)洗板，如上所述在最后的偶聯(lián)后進(jìn)行裂解Fmoc基團(tuán)的步驟?！つ┒税被囊阴；瘜⑨橆^在含150μl以下反應(yīng)混合物的板孔中保溫DMF/乙酸酐/三乙胺50/5/1(v/v/v)。將這些針封閉在一個(gè)盒子中，室溫下達(dá)90分鐘。這些針然后在200ml甲醇中洗滌15分鐘，然后干燥154分鐘?！?cè)鏈的脫保護(hù)將針在200ml TFA/茴香醚/乙二硫醇190/5/5ml的混合物中室溫浸泡2.5小時(shí)，除去側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)。該脫保護(hù)步驟后，將針從酸溶液中取出。盒子用甲醇清洗一次，然后充入甲醇，針再在其中浸泡10分鐘。然后將針在紙巾上拍打，然后在200ml甲醇/水/乙酸(100/100/1ml)混合物中浸泡1小時(shí)，再在紙巾上拍打。將這些針放在干燥器中真空過夜。實(shí)施例12ELISA將帶有針的滴定板在飽和緩沖液(PBS，Tween 0.1％，明膠1％)中37℃飽和1小時(shí)，在PBS中洗滌10分鐘，攪拌下于4℃與預(yù)稀釋的待分析血清保溫過夜。然后用PBS洗板4次，每次10分鐘，在室溫下與過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(1/5000的比例稀釋的)保溫1小時(shí)。用PBS洗滌4次后，加入底物TMB。加入硫酸終止反應(yīng)。
用Pepscan B方法分析抗BBG2Na鼠血清產(chǎn)生的數(shù)據(jù)總結(jié)在圖9中。
圖9A和9B顯示抗G2Na分子4個(gè)區(qū)域(黑體的殘基代表在Ac/Ag識(shí)別中起重要作用的氨基酸)的抗BBG2Na小鼠血清的反應(yīng)性-第一區(qū)位于150-159殘基間，其序列為QRQNKPPNKP。該區(qū)域包含于肽G5a(144-159)中，并相應(yīng)于單克隆抗體5C2的反應(yīng)活性區(qū)；-第二區(qū)位于176-189殘基間，其序列為CSNNPTCWAICKPI。這是一個(gè)位于肽G1ΔCa(174-187)位置的區(qū)域，并相應(yīng)于單克隆抗18D1和5D3的反應(yīng)活性；-第3區(qū)位于194-207殘基間，其序列為PGKKTTTKPTKKPT。該序列相應(yīng)于肽G9(194-204)水平的反應(yīng)活性，該反應(yīng)活性已在產(chǎn)生抗BBG2Na的單克隆抗體中得到證實(shí)；-第4區(qū)跨越從155殘基到176殘基的較寬區(qū)域，看來它是各種反應(yīng)性的總體結(jié)果。這些反應(yīng)活性中覆蓋G2Na分子高疏水區(qū)的一個(gè)(G11a)相應(yīng)于單克隆抗體5B7(用侯選疫苗BBG2Na免疫BALB/c小鼠后獲得)的識(shí)別區(qū)域，其Pepscan B示于下面的圖10中。
該單克隆抗體識(shí)別序列FEVFNFVP(165-172)。
上述四個(gè)反應(yīng)活性的總和另外已通過用對每個(gè)反應(yīng)活性進(jìn)行的不同ELISA對抗BBG2Na血清的測定得以證實(shí)。表I顯示抗BBG2Na血清很好地代表了“抗-G4a、G5aCys、G9aCys和G11a”活性。表I用抗BBG2Na血清ref.BE-02的log10表示的抗G4a、G5aCys、G9aCys和G11ΔCa滴度
結(jié)論用Pepscan技術(shù)對抗BBG2Na血清的研究表明，用BBG2Na免疫小鼠產(chǎn)生了抗4個(gè)表位的抗體，這4個(gè)表位分別位于150-159、176-189、194-207和155-176區(qū)。從而利用該技術(shù)證實(shí)了164-176區(qū)(G11ΔCa)的重要性。
另外，這些結(jié)果與關(guān)于抗BBG2Na血清與肽G4a、G5aCys、G9aCys和G11ΔCa反應(yīng)活性的ELISA數(shù)據(jù)完全一致。
序列表SEQ ID No.1的信號(hào)G1ΔCa序列類型氨基酸和核苷酸序列長度14個(gè)氨基酸，42個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽174 176 182 186 187N -Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Tnr Cys Trp Ala Ile Ser Lys-C5′-AGC ATC TGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC AGC AAA-3′SEQ ID No.2的信號(hào)G1’ΔCa序列類型氨基酸序列長度14個(gè)氨基酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽174 176 182 186 187N-Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Orn Trp Ala Ile Ser Lys-CSEQ ID No.3的信號(hào) G1ΔCb序列類型氨基酸和核苷酸序列長度14個(gè)氨基酸，42個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽174 176 182 186 187N -Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Ieu Cys Lys Ser Ile Ser Lys-C5′-AGC ATC TGC GGC AAC AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC AGC AAA-3′SEQ ID No.4的信號(hào) G1’ΔCb序列類型氨基酸序列長度14個(gè)氨基酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽174 176 182 186 187N-Ser Ile Asp Gly Asn Asn Gln Leu Orn Lys Ser Ile Ser Lys-CSEQ ID No.5的信號(hào)G5a序列類型氨基酸和核苷酸序列長度16個(gè)氨基酸，48個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽144 159N -Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro-C5′-AGC AAA CCG ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG-5＇SEQ ID No.6的信號(hào)GSb序列類型氨基酸和核苷酸序列長度16個(gè)氨基酸，48個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽144 159N- Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro-C5′-AAC AAA CCG AGC ACC AAA AGC CGT AGC AAA AAC CCG CCG AAA AAA CCG-3′SEQ ID No.7的信號(hào)G7a序列類型氨基酸和核苷酸序列長度33個(gè)氨基酸，99個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)158 173N -Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile5′-AAA CCG AAC AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG TGC AGC ATC176 182 186 190Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro-CTGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG-3′SEQ ID No.8的信號(hào) G7b序列類型氨基酸和核苷酸序列長度33個(gè)氨基酸，99個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)158 173 176N -Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly5′-AAA CCG AAA GAT GAT TAC CAC TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCC TGC AGC ATC TGC GGC182 186 190Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys lys Thr Ile Pro-CAAC AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC TGC AAA ACC ATC CCG-3′SEQ ID No.9的信號(hào) G8a序列類型氨基酸和核苷酸序列長度43個(gè)氨基酸，129個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)158 173 176N -Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser5′-AAA CCG AAC AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC182 186 197Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys ThrAAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA CCG GGC AAA AAA ACC200Thr Thr-CACG ACC-3′SEQ ID No.10的信號(hào) G8b序列類型氨基酸和核苷酸序列長度43個(gè)氨基酸，129個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)158 173 176N -Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly5′-AAA CCG AAA GAT GAT TAC CAC TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCC TGC AGC ATC TGC GGC178 182 186 198Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys ProAAC AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC TGC AAA ACC ATC CCG AGC AAC AAA CCG AAA AAG AAA CCG200Thr Ile-CACC ATC-3′SEQ ID No.11的信號(hào)G9a序列類型氨基酸和核苷酸序列長度15個(gè)氨基酸，45個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)190 204N -Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys-C5′-CCG AAC AAA AAA CCG GGC AAA AAA ACC ACG ACC AAA CCG ACC AAA-3′SEQ ID No.12的信號(hào) G9b序列類型氨基酸和核苷酸序列長度15個(gè)氨基酸，45個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)190 204N -Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn-C5＇-CCG AGC AAC AAA CCG AAA AAG AAA CCG ACC ATC AAA CCG ACC AAC-3′SEQ ID No.13的信號(hào)G11a序列類型氨基酸和核苷酸序列長度13個(gè)氨基酸，39個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)164 176N -His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys-C5′-CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG TGC AGC ATC TGC-3′SEQ ID No.14的信號(hào) G11ΔCa序列類型氨基酸和核苷酸序列長度13個(gè)氨基酸，39個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)164 176N -His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys-C5′-CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG AGC AGC ATC TGC-3′SEQ ID No.15的信號(hào) G2a1序列類型氨基酸和核苷酸序列長度101個(gè)氨基酸，303個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)130N -Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys5′-ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG CCG AGC AAA CCG ACC ACC AAA150Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn PheCAG CGT CAT AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC171 173 176 182 186 191Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro SerGTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG AGC192 195 198Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr LysAAC AAA CCG AAG AAA AAA CCG ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA ACC ACC AAA213 230Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro-CAAA GAT CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA CCG AAA GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCG-3′SEQ ID No.16的信號(hào)G2a2序列類型氨基酸和核苷酸序列長度101個(gè)氨基酸，303個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)130N -Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys5′-ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG CCG AGC AAA CGG ACC ACC AAA150 157 160 161 163Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn PheCAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAA AAA CCG AAA GAC GAT TAC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC171 173 176 182 186Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro AsnGTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG CCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG AAC192Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr LysAAA AAA CCG GGC AAA AAA ACC ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA ACC ACC AAA213 230Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro-CAAA GAT CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA CCG AAA GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCG-3′SEQ ID No.17的信號(hào) G2a3序列類型氨基酸和核苷酸序列長度101個(gè)氨基酸，303個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)130N -Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys5′-ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG CCG AGC AAA CCG ACC ACC AAA150 157 160 161 163Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn PheCAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAA AAA CCG AAA GAC GAT TAC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC171 173 176 182 186 191Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro SerGTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG AGC192 195 198Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr LysAAC AAA CCG AAG AAA AAA CCG ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA ACC ACC AAA213 230Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro-CAAA GAT CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA CCG AAA GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCG-3′SEQ ID No.18的信號(hào)G9v序列類型氨基酸和核苷酸序列長度15個(gè)氨基酸，45個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)190 204N -Thr Glu Arg Ala Pro Ser Arg Ala Pro Thr Ile Thr Leu Lys Lys-C5′-ACG GAA AGA GCA CCA AGC AGA GCA CCA ACA ATC ACC CTC AAA AAG-3′SEQ ID No.19的信號(hào)G5v序列類型氨基酸和核苷酸序列長度16個(gè)氨基酸，48個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽144 159N -Arg Lys Pro Pro Ile Asn Pro Ser Gly Ser Ile Pro Pro Glu Asn His-C5′-AGA AAA CCA CCA ATT AAT CCA TCA GGA AGC ATC CCA CCA GAA AAC CAT-3′SEQ ID No.20的信號(hào)G4A序列類型氨基酸和核苷酸序列長度17個(gè)氨基酸，42個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽
171 173 176 182 186 187N -Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys-C5′-GTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC AAC AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA-3′SEQ ID No.21的信號(hào) G4B序列類型氨基酸和核苷酸序列長度17個(gè)氨基酸，42個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽171 173 176 182 186 187N -Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys-C5′-GTG CCC TGC AGC ATC TGC GGC AAC AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC TGC AAA-3′SEQ ID No.22的信號(hào)G4V序列類型氨基酸和核苷酸序列長度17個(gè)氨基酸，51個(gè)核苷酸鏈數(shù)單鏈構(gòu)型線性分子類型肽171 173 176 182 186 187N -Val Pro Cys Ser Thr Cys Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser Leu Cys His-C5′-GTT CCC TGC AGT ACA TGT GAA GGT AAT CTT GCA TGC TTA TCA CTC TGC CAT-權(quán)利要求
1.抗RSV蛋白G之表位的多克隆或單克隆抗體，所述表位相應(yīng)于選自RSV A或B蛋白G全序列中150-159、176-189、194-207和155-176氨基酸殘基間肽序列或具有至少80％相同性的序列的一種序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其特征在于它是抗RSV A亞型或B亞型蛋白G 130-230氨基酸殘基間序列所含肽的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗體，其特征在于它是抗具有至少下列序列之一的肽的抗體SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21和/或SEQ ID No.22。
4.能產(chǎn)生權(quán)利要求1-3之一的抗體的肽，其特征在于它具有選自下列序列的至少一種序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21和/或SEQ ID No.22。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的肽，其特征在于它另外在N-末端或C-末端位置含有至少一個(gè)半胱氨酸殘基。
6.一種免疫原性劑，其特征在于它含有與載體蛋白偶聯(lián)的至少一個(gè)權(quán)利要求4或5的肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的免疫原性劑，其特征在于載體蛋白選自革蘭氏陰性細(xì)菌的OmpA和其片段、TT蛋白、鏈球菌的人血清白蛋白結(jié)合蛋白和其片段及霍亂毒素B亞單位(CTB)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的免疫原性劑，其特征在于載體蛋白為克雷伯氏菌屬細(xì)菌的OmpA。
9.根據(jù)權(quán)利要求6～8之一的免疫原性劑，其特征在于肽與載體蛋白通過連接蛋白偶聯(lián)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的免疫原性劑，其特征在于連接蛋白選自哺乳動(dòng)物血清白蛋白受體和存在于粘膜細(xì)胞表面的受體。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10之一的免疫原性劑，其特征在于所述偶聯(lián)是共價(jià)偶聯(lián)。
12.編碼權(quán)利要求6-11之一的免疫原性劑的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的核苷酸序列，其特征在于它是一種在編碼載體蛋白的DNA分子中插入或融合與啟動(dòng)子融合的編碼權(quán)利要求4或5的肽或其片段的DNA所產(chǎn)生的雜合DNA分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的核苷酸序列，其特征在于它是一種RNA分子。
15.作為藥物的權(quán)利要求1-3之一的抗體、權(quán)利要求4或5的肽、權(quán)利要求6-11之一的免疫原性劑或權(quán)利要求12-14之一的核苷酸序列。
16.一種藥物組合物，其特征在于它含有權(quán)利要求1-3之一的抗體、權(quán)利要求4或5的肽、權(quán)利要求6-11之一的免疫原性劑或權(quán)利要求12-14之一的核苷酸序列，及藥物可接受的賦形劑。
17.至少一種權(quán)利要求1-3之一的抗體、權(quán)利要求4或5的肽、權(quán)利要求6-11之一的免疫原性劑或權(quán)利要求12-14之一的核苷酸序列在制備用于治療或預(yù)防RSV亞型A或B所致感染的組合物中的用途。
18.一種診斷試劑盒，其特征在于它包含權(quán)利要求1-3之一的抗體、權(quán)利要求4或5的肽、權(quán)利要求6-11之一的免疫原性劑或權(quán)利要求12-14之一的核苷酸序列。
19.制備權(quán)利要求6-11之一的免疫原性劑的方法，其特征在于肽與載體蛋白間的偶聯(lián)是經(jīng)過化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)的。
20.制備權(quán)利要求6-11之一的免疫原性劑的方法，其特征在于肽與載體蛋白間的偶聯(lián)是經(jīng)過DNA重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的制備方法，其特征在于它包括向宿主細(xì)胞中引入權(quán)利要求12-14之一的核苷酸序列的步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的制備方法，其特征在于核苷酸序列是借助于源自質(zhì)粒、噬菌體、病毒和/或粘粒的DNA載體引入的融合基因。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其特征在于融合基因是整合在宿主細(xì)胞基因組中的。
24.根據(jù)權(quán)利要求21-23之一的方法，其特征在于宿主細(xì)胞是原核的。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其特征在于宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、芽孢桿菌、乳桿菌、葡萄球菌和鏈球菌。
26.根據(jù)權(quán)利要求21-23之一的方法，其特征在于宿主細(xì)胞是一種酵母。
27.根據(jù)權(quán)利要求21-23之一的方法，其特征在于宿主細(xì)胞是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求21-23之一的方法，其特征在于宿主細(xì)胞是一種植物來源的細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求21-23之一的方法，其特征在于宿主細(xì)胞是一種昆蟲細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求21-23之一的方法，其特征在于使用病毒載體。
31.根據(jù)權(quán)利要求20-27之一的方法，其特征在于融合分子被表達(dá)、錨定并暴露在宿主細(xì)胞膜上。
32.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其特征在于單克隆抗體是人源化的，并經(jīng)重組方法產(chǎn)生。
33.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其特征在于單克隆抗體經(jīng)噬菌體文庫方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗RSV蛋白G之表位的多克隆或單克隆抗體,所述表位相應(yīng)于選自RSV A或B蛋白G全序列中150—159、176—189、194—207和155—176氨基酸殘基間肽序列或具有至少98%相同性的序列的一種序列。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1264425SQ9880730
公開日2000年8月23日 申請日期1998年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月17日
發(fā)明者T·N·恩谷元, U·泊爾, L·格斯特克, A·貝克 申請人:皮埃爾法博赫藥品公司