專利名稱：具有1,3和1,4－β－葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株的制作方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及具有β-葡聚糖酶活性的需氧真菌寄生性真菌小盾殼霉(Coniothyrium minitans)菌株。相關領域介紹影響動物生產(chǎn)量的一個主要因素是飼料利用的效率。有效的飼料利用需要有效消化存在于飼料中的復雜β-葡聚糖底物。β-葡聚糖是天然多糖中最為豐富的多糖之一。具有(1，3)、(1，4)、(1，6)和(1，2)鍵的β-葡聚糖已經(jīng)在細菌和植物中鑒定到(Stone和Clark1992)，而具有(1，3)和(1，6)鍵的β-葡聚糖酶則富含于真菌細胞壁中(Wessels和Sietsma 1981)。飼料中的纖維和β-葡聚糖經(jīng)常被動物，尤其是單胃動物消化不完全，從而導致浪費。含有某些形式的聚糖(如小麥和黑麥中的阿拉伯木聚糖，或大麥與燕麥中的β-葡聚糖)的飼料也可能對營養(yǎng)物的吸收具有有害作用并且可能通過腸道病原體而促發(fā)腸道疾病。
通過酶的補充可以改善家畜對飼料中纖維和β-葡聚糖的消化(Shutte 1995)。據(jù)認為聚糖水解酶飼料添加劑能增加纖維降解和/或降低胃腸道的粘滯性，繼而增加飼料的攝入和通過的速率(Sears1993)。目前，飼料酶補充受到生產(chǎn)酶的高成本的限制。工業(yè)上依賴批量發(fā)酵來生產(chǎn)飼料酶并且局限于以一小類真菌(主要為曲霉、青霉和木霉)和細菌(凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、卷曲芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌變種)作為這些酶的來源(Sears 1993)。因此，愈來愈需要β-葡聚糖降解酶(β-葡聚糖酶)新的微生物來源。理想地，這樣的微生物能夠容易而廉價地通過液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵來培養(yǎng)，并且將具有高水平的β-葡聚糖酶活性。在需氧的真菌寄生性真菌小盾殼霉中已報道有內切-和外切-1，3-β-葡聚糖酶活性(Jones等，1973)。然而，Jones等的文獻沒有講述具有內切-1，3和內切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性的小盾殼霉。內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性是對降解動物飼料中的β-葡聚糖最為有用的β-葡聚糖酶活性。此外，由于Jones等的培養(yǎng)小盾殼霉的培養(yǎng)基基本上由核盤菌的菌核(一種天然的β-葡聚糖來源)所組成，故Jones等的文獻沒有講述在無β-葡聚糖來源的豐富培養(yǎng)基上的小盾殼霉的組成性β-葡聚糖酶活性。這樣的培養(yǎng)基將優(yōu)選用于工業(yè)發(fā)酵的應用中。由于既未講述小盾殼霉的內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性，又未講述其組成性β-葡聚糖酶活性，故Jones等的文獻沒有提示用小盾殼霉作為β-葡聚糖酶的有用來源。
發(fā)明概述本發(fā)明提供在液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)時具有高水平β-葡聚糖酶活性的需氧真菌寄生性真菌小盾殼霉的生物學純的菌株(小盾殼霉菌株ATCC 74415、74416和74417)。通過對菌株ATCC 74415的誘變，也獲得了具有高水平β-葡聚糖酶活性的其他小盾殼霉菌株(小盾殼霉菌株ATCC 74418、74419、74435和74436)。
也提供了制備具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉的方法，廣義地說，該方法包括1. 提供多個小盾殼霉ATCC 74415細胞；2. 將這些細胞暴露于紫外線輻射以誘變這些細胞；3. 在培養(yǎng)基上或其中培養(yǎng)該誘變的細胞以制備小盾殼霉的多個培養(yǎng)物；4. 檢測誘變細胞培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶活性；5. 從步驟(d)中回收那些具有β-葡聚糖酶活性的培養(yǎng)物。
可以使用固體或液體培養(yǎng)基。所用的培養(yǎng)基可以是其中僅僅碳水化合物源為β-葡聚糖來源的基本培養(yǎng)基。這樣的培養(yǎng)基將篩選出下面的突變體，它們具有增加β-葡聚糖酶活性的突變，因此可利用培養(yǎng)基中的β-葡聚糖作為碳水化合物來源，并且因此將把具有下調β-葡聚糖酶活性的突變或無突變的小盾殼霉競爭出去。另外，也可以使用含有淀粉和簡單糖來源而無β-葡聚糖來源的豐富培養(yǎng)基。在豐富培養(yǎng)基上仍然表現(xiàn)出β-葡聚糖酶活性的誘變的小盾殼霉細胞具有組成性β-葡聚糖酶活性，因為無需β-葡聚糖來源來誘導β-葡聚糖酶活性，并且并未由于淀粉和簡單糖的存在而使β-葡聚糖酶活性受到抑制。淀粉和簡單糖類是一般在β-葡聚糖之前得到利用的容易代謝的營養(yǎng)物來源，因而會導致β-葡聚糖酶活性的抑制。
經(jīng)過紫外誘變，獲得了具有較母本源菌株小盾殼霉ATCC 74415平均高10倍β-葡聚糖酶活性水平的小盾殼霉突變菌株。這些突變體(ATCC 74435和74436)具有組成性β-葡聚糖酶活性，其無需β-葡聚糖底物來源的誘導，并且不受碳水化合物來源如淀粉或簡單糖類存在的抑制。這些特征使本發(fā)明的小盾殼霉菌株成為商業(yè)β-葡聚糖酶生產(chǎn)的優(yōu)良候選菌株，因為高β-葡聚糖酶活性菌株可培養(yǎng)于廉價的固體培養(yǎng)基如廢土豆皮上。這樣的培養(yǎng)基的簡單糖類和淀粉含量高，并且不含有作為誘導物發(fā)揮作用的β-葡聚糖來源。固體生長培養(yǎng)基可用具有高的組成性β-葡聚糖酶活性的本發(fā)明小盾殼霉菌株的孢子或菌絲體進行接種，在培養(yǎng)物生長期間，生長培養(yǎng)基將由大量具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌絲體所消化和代替。此β-葡聚糖酶活性然后可通過冷凍干燥該菌絲體并將其研磨成粉末而加以回收。這樣的培養(yǎng)條件較液體發(fā)酵系統(tǒng)要廉價得多并且更易于操作，特別是如果需要，僅僅含有β-葡聚糖作為碳水化合物來源的特化基本培養(yǎng)基來培養(yǎng)具有需要β-葡聚糖來源的存在作為誘導物，并且受簡單糖類或淀粉存在抑制的β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株時更是如此。
附圖
簡介附圖為小盾殼霉野生型菌株和突變體遺傳相關性的分枝圖。該分枝圖是僅僅用產(chǎn)生多態(tài)性片段和差異性強度片段的引物組合來使野生型和突變菌株之間的分離最大化而制做的。用數(shù)值分類系統(tǒng)軟件(“NTSYS”)(Exeter Software，Setauket，紐約，美國)中的未加權對群方法產(chǎn)生相異度指數(shù)。
發(fā)明詳述為了提供對本說明書和權利要求書(包括權利要求書的語言所限定的范圍)清晰而一致的理解，提供下面的定義。
小盾殼霉“生物學純的培養(yǎng)物”是其中的所有細胞來自單一孢子或單一菌絲頂端，并且因此在遺傳上基本上是一致的小盾殼霉培養(yǎng)物。
“β-葡聚糖酶”是能夠水解聚合底物β-葡聚糖的酶。β-葡聚糖酶包括但不限于水解β-1，3-鍵的內切-1，3-β-葡聚糖酶、水解β-1，4-鍵的內切-1，4-β-葡聚糖酶和既水解β-1，3又水解β-1，4-鍵的內切-1，3-1，4-β-葡聚糖酶。下面是由國際生化與分子生物學聯(lián)合會(“IUBMB”)命名委員會命名為“β-葡聚糖酶”的酶，根據(jù)IUBMB和酶學委員會(“EC”)編號所建議的名稱列出纖維素酶(EC 3.2.1.4)-別名包括內切葡聚糖酶、內切-1，4-β-葡聚糖酶和羧甲基纖維素酶。纖維素酶催化纖維素中1，4-β-D-糖苷鍵的內切水解。它也水解也含有1，3-鍵的β-D-葡聚糖中的1，4-鍵；內切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)-別名包括內切-1，4-β-葡聚糖酶、內切-1，3-β-葡聚糖酶和昆布多糖酶。內切-1，3(4)-β-葡聚糖酶在待水解鍵涉及還原性基團的葡萄糖殘基本身在C-3處被取代時，催化β-D-葡聚糖中1，3-或1，4-鍵的內切水解。底物包括昆布多糖、地衣淀粉和禾谷d-葡聚糖。
葡聚糖內切-1，3-β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.39)-別名包括(1→3)-β-葡聚糖內切水解酶、內切-1，3-β-葡聚糖酶和昆布多糖酶。葡聚糖內切-1，3-β-D-葡糖苷酶催化1，3-β-D-葡聚糖中1，3-β-D-糖苷鍵的水解，但是對混合鍵(1，3-1，4-)-β-D-葡聚糖的作用很有限。底物包括昆布多糖、副淀粉和茯苓多糖。
葡聚糖1，3-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.58)-別名包括外切-1，3-β-葡聚糖酶和外切-1，3-β-葡糖苷酶。葡聚糖1，3-β-葡糖苷酶催化β-D-葡萄糖單位從1，3-β-D-葡聚糖非還原末端的依次水解，釋放出α-葡萄糖。葡聚糖1，3-β-葡糖苷酶作用于寡糖但對昆布二糖作用很慢。
葡聚糖內切-1，2-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.71)-別名包括內切-1，2-β-葡聚糖酶。葡聚糖內切-1，2-β-葡糖苷酶催化1，2-β-D-葡聚糖中1，2-糖苷鍵的隨機水解。
地衣淀粉酶(EC 3.2.1.73)-別名包括地衣多糖酶(lichenase)、β-葡聚糖酶、內切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶、1，3-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶和混合鍵β-葡聚糖酶。地衣淀粉酶催化含有1，3-和1，4-鍵的β-D-葡聚糖中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解。地衣淀粉酶作用于地衣淀粉(也稱為“地衣多糖”)和禾谷類β-D-葡聚糖，但對僅含1，3-或1，4-鍵的β-D-葡聚糖沒有作用。
葡聚糖內切-1，6-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.75)-別名包括內切-1，6-β-葡聚糖酶。葡聚糖內切-1，6-葡糖苷酶催化1，6-β-D-葡聚糖中1，6-鍵的隨機水解。底物包括lutean、石耳素和1，6-寡聚-β-D-葡糖苷。
從前面的內容，特別是提供的別名，很容易看出用于命名β-葡聚糖酶類型酶的命名法還不完全一致。這部分是由于早期的命名法用所水解的底物命名這些酶(例如，水解昆布多糖的酶為昆布多糖酶)，后來又被根據(jù)所催化的特定反應而命名酶的做法所取代。
為了一致性和明確性的目的，在本說明書和權利要求書中，β-葡聚糖酶活性用所水解的底物來命名，如在這里的實施例1所列舉的情形，實施例1中各種多糖底物的水解通過將各種小盾殼霉部分或樣品與各種多糖底物溫育期間還原性糖(以葡萄糖測定)的釋放加以測定。用于測定小盾殼霉菌株β-葡聚糖酶活性的底物包括羧甲基纖維素、地衣多糖、昆布多糖和大麥β-葡聚糖。因此，正如在本文和權利要求書中所使用的“纖維素水解活性”為催化纖維素水解從而釋放還原性糖(以葡萄糖測定)的小盾殼霉菌株的β-葡聚糖酶活性；“地衣多糖水解活性”為催化地衣多糖水解從而釋放還原性糖(以葡萄糖測定)的小盾殼霉菌株的β-葡聚糖酶活性；“昆布多糖水解活性”為催化昆布多糖水解從而釋放還原性糖(以葡萄糖測定)的小盾殼霉菌株的β-葡聚糖酶活性；“大麥β-葡聚糖水解活性”為催化大麥β-葡聚糖水解從而釋放還原性糖(以葡萄糖測定)的小盾殼霉菌株的β-葡聚糖酶活性。
上述的多糖底物可容易地從如下的商業(yè)來源得到纖維素-可獲自Sigma-Aldrich公司(St.Louis.，Missouri，美國)的羧甲基纖維素(“CMC”)，Sigma目錄號C 5013；地衣多糖-可獲自Sigma，目錄號L 6133，或可獲自Megazyme愛爾蘭國際有限公司(Bray Business Park，Bray，County Wicklow，愛爾蘭)，Megazyme目錄號P-LICHN；
昆布多糖-可獲自Sigma，目錄號L 9634；大麥β-葡聚糖-可獲自Sigma，目錄號G 6513，或可獲自Megazyme，目錄號P-BGBL、P-BGBM和P-BGBH。
CMC底物僅僅由1，4-β-D-葡聚糖所組成。昆布多糖底物僅僅由1，3-β-D-葡聚糖所組成。地衣多糖和大麥β-葡聚糖同時由1，3-和1，4-β-D-葡聚糖所組成，盡管其中具有不同比例的這兩種類型鍵。由于這些底物的組成不同，因此已知水解CMC釋放還原性糖的β-葡聚糖酶必定水解1，4-鍵。類似地，水解昆布多糖釋放還原性糖的β-葡聚糖酶必定水解1，3-鍵。水解地衣多糖或大麥β-葡聚糖的β-葡聚糖酶可以水解1，3-鍵、1，4-鍵或同時水解這二種鍵。在本發(fā)明中，據(jù)信由于觀察到這些酶的高活性，故本發(fā)明小盾殼霉菌株的水解地衣多糖和水解大麥β-葡聚糖的β-葡聚糖酶同時水解1，3-和1，4-鍵。預計僅僅水解這些鍵中其中一種鍵的酶將具有明顯較低的活性。同樣，本發(fā)明小盾殼霉菌株產(chǎn)生的β-葡聚糖酶的活性水平清楚地表明該β-葡聚糖酶具有內切-β-葡聚糖酶活性(水解多糖鏈內的內糖苷鍵)而不是外切-β-葡聚糖酶活性(僅僅水解多糖鏈末端單體的糖苷鍵)。預計外切-β-葡聚糖酶較本發(fā)明小盾殼霉菌株中觀察到的酶具有明顯較低的活性水平。
“具有β-葡聚糖酶活性”的小盾殼霉菌株為在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下顯示至少一種上述β-葡聚糖水解活性的小盾殼霉菌株。這種β-葡聚糖酶活性可與培養(yǎng)基中的小盾殼霉菌絲體一起回收，或從用于提取菌絲體的溶劑或培養(yǎng)基中回收。β-葡聚糖酶活性可通過這里的實施例1中列出的不同分析方法加以定量，這些方法在此定義為“多孔板擴散分析”、“OBR-HEC分析”、“改良的還原糖分析”、和“β-葡聚糖酶平板清除分析”。實施例1提供了允許本領域技術人員定量測定小盾殼霉培養(yǎng)物β-葡聚糖酶活性的這些分析中每種分析可重復的分析條件。
具有“組成性”β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株為當培養(yǎng)于富含簡單糖類和淀粉(如土豆葡萄糖培養(yǎng)基)并且不含有β-葡聚糖來源(如干燥的核盤菌菌核)的培養(yǎng)基中時，顯示β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株。
“包括可吸收淀粉或糖類來源并且基本上無可吸收β-葡聚糖來源的培養(yǎng)基”為豐富培養(yǎng)基，如富含淀粉和簡單糖類，但不含有β-葡聚糖來源(如，1％核盤菌干燥菌核或大麥β-葡聚糖)的土豆葡萄糖培養(yǎng)基。
“基本上無可吸收淀粉或糖類來源并且包括可吸收β-葡聚糖來源的培養(yǎng)基”為基本培養(yǎng)基，如含有β-葡聚糖來源如1％干燥核盤菌菌核的改良Czapek-Dox培養(yǎng)基。
至于本發(fā)明的小盾殼霉菌株，“其具有β-葡聚糖酶活性的突變體”為一種具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株，該菌株來自本發(fā)明的小盾殼霉菌株并且在其DNA結構或組成變化上與本發(fā)明菌株不同，無論是由于正常的分離、遺傳重組過程、自發(fā)突變還是由誘變劑誘導的突變的結果，但仍然保持β-葡聚糖酶活性。
“β-葡聚糖酶活性單位(“U”)”，包括但不限于羧甲基纖維素水解活性、地衣多糖水解活性、大麥β-葡聚糖水解活性或昆布多糖水解活性，為在37℃，pH4.5時每分鐘導致1μmol葡萄糖當量的還原性糖釋放的β-葡聚糖酶活性的量。
發(fā)現(xiàn)從加拿大大草原收集到的一種野生型菌株小盾殼霉菌株2134，為培養(yǎng)于液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵中時，顯示高水平的β-葡聚糖酶活性。該β-葡聚糖酶主要顯示出昆布多糖水解活性，而具有較低水平的羧甲基纖維素水解活性。小盾殼霉菌株2134于1997年6月13日保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”)(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia，20110-2209，美國)，保藏號為74415。小盾殼霉菌株2134的菌落具有黃棕色色素、平滑邊緣并且產(chǎn)生孢子(這部分中所有的表型描述均是對在室溫(20-22℃)光照下培養(yǎng)于土豆葡萄糖瓊脂上14天的真菌菌落的描述)。
發(fā)現(xiàn)從加拿大大草原收集到的野生型菌株小盾殼霉菌株2130和2135具有β-葡聚糖酶活性，包括大麥β-葡聚糖酶水解活性、地衣多糖水解活性、昆布多糖水解活性和纖維素水解活性。菌株2130已于1997年6月13日以保藏號74417保藏于ATCC。小盾殼霉菌株2130的菌落具有橄欖綠的色素、平滑的邊緣并且產(chǎn)生孢子。菌株2135已于1997年6月13日以保藏號74416保藏于ATCC。小盾殼霉菌株2135的菌落具橄欖棕色的色素、光滑的邊緣并且產(chǎn)生孢子。
通過紫外線輻射誘導小盾殼霉菌株2134的突變。分離到數(shù)種顯示出增加的β-葡聚糖酶活性的突變體，并且將這些突變體命名為菌株M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4。發(fā)現(xiàn)突變菌株M11-3B2、A8-1和A10-4相對穩(wěn)定。2種組成性突變體菌株A8-1和A10-4在無補充誘導物(β-葡聚糖底物)時表達大麥β-葡聚糖水解活性。培養(yǎng)于土豆葡萄糖培養(yǎng)液(“PDB”)中的A8-1和A10-4培養(yǎng)上清液具有平均比母本菌株高10倍的最高水平的β-葡聚糖酶活性。M11-3B2當在富含β-葡聚糖的底物存在下培養(yǎng)時具有低水平的組成性β-葡聚糖酶表達和增加的昆布多糖水解活性。
菌株M11-3B2為原初突變體M11在0.2％AZCL-β-葡聚糖瓊脂培養(yǎng)基上8次傳代后的子代。菌株M11-3是從原初M11突變體的單個孢子中分離到的姐妹菌落并于1997年6月13日以保藏號74418保藏于ATCC。小盾殼霉菌株M11-3的菌落具有黃棕色色素、光滑的邊緣并且形成孢子。小盾殼霉菌株M11-3B2的菌落具有橄欖黃棕色色素、平滑的邊緣并且形成孢子。
菌株A8-1于1998年3月31日以保藏號74436保藏于ATCC。小盾殼霉菌株A8-1的菌落具有黃白色色素、鋸齒狀邊緣并且產(chǎn)生很少的孢子。菌株A10-4已于1998年3月31日以保藏號74435保藏于ATCC。小盾殼霉菌株A10-4的菌落具有黃白色色素、鋸齒狀邊緣并且產(chǎn)生很少的孢子。
也發(fā)現(xiàn)小盾殼霉菌株A7-3D具有β-葡聚糖酶活性，雖然該活性隨著時間推移而下降。菌株A7-3D已于1997年6月13日以保藏號74419保藏于ATCC。菌株A7-3D的菌落具有黃棕色色素、鋸齒狀邊緣并且產(chǎn)生孢子。
突變 小盾殼霉菌株M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4是通過紫外線輻射而對本說明書實施例1中所述小盾殼霉孢子懸液進行誘變而從小盾殼霉野生型菌株2134制得的。在一種方法中，含有0.2％大麥β-葡聚糖的改良Czapek-Dox(“MCD”)培養(yǎng)基用作選擇性生長培養(yǎng)基。MCD是不提供碳水化合物來源的基本培養(yǎng)基。加入β-葡聚糖作為碳水化合物來源(例如大麥β-葡聚糖)。具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株可利用大麥β-葡聚糖作為碳水化合物來源。在該方法中，具有上調β-葡聚糖酶活性的突變的突變孢子培養(yǎng)物將具有更高的β-葡聚糖酶活性，并且應該因此生長更快，并將來自具有下調β-葡聚糖酶活性的突變或無β-葡聚糖酶活性突變的孢子的菌絲體競爭出去。然而，該方法沒有鑒定出在沒有作為誘導物的β-葡聚糖來源存在時具有β-葡聚糖酶活性的組成性突變體。此外，使用基本培養(yǎng)基如MCD不能區(qū)分其中的β-葡聚糖酶活性受到簡單糖類如葡萄糖或其它單糖或二糖、或淀粉的存在抑制的菌株與其中的β-葡聚糖酶活性不受到抑制的菌株。
為了對具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株進行大規(guī)模經(jīng)濟發(fā)酵，需要具有無需β-葡聚糖來源誘導并且不受簡單糖類存在抑制的組成性β-葡聚糖酶活性。雖然β-葡聚糖的天然來源可以得到，如在本說明書的實施例中所述的“誘導物”就是從真菌核盤菌的菌核制得的一種β-葡聚糖來源，但許多廉價且易得的生長培養(yǎng)基，如土豆皮，不提供β-葡聚糖來源。優(yōu)選不必添加β-葡聚糖來源至培養(yǎng)基中。
在大規(guī)模發(fā)酵中，由于至少兩個原因而還優(yōu)選使用具有不受簡單糖類或淀粉存在抑制的β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株。首先，優(yōu)選能夠使用廉價培養(yǎng)基如富含淀粉和簡單糖類的土豆皮而不是使用非天然存在的基本培養(yǎng)基如MCD。其次，即使使用基本培養(yǎng)基如MCD并且提供β-葡聚糖作為碳水化合物來源，小盾殼霉培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶活性對β-葡聚糖的降解也將導致簡單糖類的積累，而這些糖類必須去除以避免β-葡聚糖酶活性的抑制。
因此，在優(yōu)選的誘變方法中，將誘變的孢子培養(yǎng)于不提供β-葡聚糖來源并且富含簡單糖類的培養(yǎng)基如PDB中，以篩選具有不受淀粉或簡單糖類存在抑制的組成性β-葡聚糖酶活性的突變體。
無論將培養(yǎng)物培養(yǎng)于0.2％大麥β-葡聚糖MCD培養(yǎng)基還是PDB中，使用本說明書實施例1中詳述的多孔板擴散分析都能有效地篩選出多個來自誘變孢子的小盾殼霉培養(yǎng)物。多孔板擴散分析包括同時將從源自誘變孢子的小盾殼霉培養(yǎng)物中采集的多個樣品與固體分析培養(yǎng)基接觸，使每個樣品都與所述固體分析培養(yǎng)基的部分表面之間流體相通，但與每個其他樣品都流體分離。固體分析培養(yǎng)基含有一種分析組合物，它在其中一種小盾殼霉培養(yǎng)物樣品中的β-葡聚糖活性存在下，以與該樣品的β-葡聚糖酶活性成比例的量釋放擴散至該樣品中的可定量的標記。優(yōu)選該分析組合物為用于同時檢測內切-1，3-β-葡聚糖酶活性和內切-1，4-β-葡聚糖酶活性的組合物，如天青色苯胺染料交聯(lián)的β-葡聚糖(“AZCL-β-葡聚糖”)(如上所述，大麥β-葡聚糖底物同時包括1，3-和1，4-鍵，因此預計顯示出高的大麥β-葡聚糖水解活性的β-葡聚糖酶既具有內切-1，3-β-葡聚糖酶活性又具有內切-1，4-β-葡聚糖酶活性)。由內切-1，3-β-葡聚糖酶活性或內切-1，4-β-葡聚糖酶活性對AZCL-β-葡聚糖的降解釋放出可定量的標記，即天青藍染料。由于降解的AZCL-β-葡聚糖的量與樣品中的β-葡聚糖酶活性水平成比例，故釋放至該樣品中的天青藍染料的量與該樣品的β-葡聚糖酶活性成比例。
標準的96孔板(或其它多孔板)既可用于培養(yǎng)誘變的孢子懸液樣品又可用于進行多孔板擴散分析。將培養(yǎng)于第一個多孔分析板中的每個小盾殼霉培養(yǎng)物的樣品轉移到第二個多孔分析板的小孔中。該分析板的蓋子內部襯有含有AZCL-β-葡聚糖分析組合物的固體瓊脂分析培養(yǎng)基。將一層干酪布置于分析培養(yǎng)基的頂部以加固該分析培養(yǎng)基，并且在酶促消化期間維持其完整性。將蓋子置于平板上，使固體分析培養(yǎng)基封住每個孔的頂部，從而分離每個孔，然后將蓋好蓋子的平板小心倒置。溫育該平板使該樣品中的β-葡聚糖酶活性裂解AZCL-β-葡聚糖分析組合物，釋放出天青藍染料至該樣品中，從而得到可見的藍色，可通過用自動平板讀數(shù)器測定該樣品的光密度而加以定量。擴散至該樣品中的天青藍染料的量愈大，則該樣品的β-葡聚糖酶活性愈高。通過傳代培養(yǎng)得自該生長中的菌絲體的單個菌絲頂端可進一步純化具有高β-葡聚糖酶活性的突變小盾殼霉菌株。
誘變和分離具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株的優(yōu)選方法如下進行。提供具有約10ml體積和大約1×104個孢子/ml密度的小盾殼霉孢子懸液，然后暴露于紫外光足以殺死該懸液中大約97-99％孢子的時間。然后將輻射過的孢子懸液樣品以大約10-30個活孢子/孔的量培養(yǎng)于96孔板(或其它多孔板)的每個小孔中，通過分析法如本說明書的實施例1中所述的多孔平板擴散分析來篩選β-葡聚糖酶活性。將具有最高活性的孔鋪于0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂板上。然后挑取來自培養(yǎng)于0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂平板上的菌落的單個菌絲頂端，并培養(yǎng)于豐富培養(yǎng)基如土豆葡萄糖瓊脂(“PDA”)上。從突變培養(yǎng)物中取出菌絲體塊并培養(yǎng)于MCD+1％菌核“誘導物”(β-葡聚糖來源)培養(yǎng)基中，然后通過多孔板擴散分析檢測β-葡聚糖酶活性。將來自具有最高β-葡聚糖酶活性的培養(yǎng)物的單個菌絲頂端傳代培養(yǎng)于PDA/0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂上并將培養(yǎng)物保存于液氮中。通過在MCD+β-葡聚糖來源培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自該培養(yǎng)物的菌絲體塊并通過多孔板擴散分析檢測β-葡聚糖酶活性而測定該培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶活性。將具有最高β-葡聚糖酶活性的培養(yǎng)物保存于液氮中，并在搖瓶中進行放大試驗。用本說明書實施例1中所述的改良還原性糖分析法測定放大培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶活性。將放大培養(yǎng)物的樣品保存于液氮中。如上所述，當用該誘變和分離方法篩選具有組成性，不受抑制的β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株時，用豐富培養(yǎng)基如富含簡單糖類但不含β-葡聚糖來源的PDB代替基本培養(yǎng)基MCD+β-葡聚糖來源。
在本說明書實施例1中討論的另一種方法中，可將小盾殼霉的培養(yǎng)物培養(yǎng)于暴露于誘變劑的固體培養(yǎng)基上，并且隨后直接在固體培養(yǎng)基上，通過例如實施例1中所述的β-葡聚糖酶平板清除分析法測定該培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶活性。
本說明書的表3顯示當培養(yǎng)于PDB(富含簡單糖類和淀粉，無β-葡聚糖誘導物來源)上時組成性突變體A10-4和A8-1與母本野生型菌株2134的內切-1，3-β-葡聚糖酶和內切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性(大麥β-葡聚糖水解活性)。β-葡聚糖酶活性單位(“U”)定義為導致在37℃時每分鐘釋放1μmol葡萄糖當量的還原性糖類的β-葡聚糖酶活性的量。在表3中很明顯，在三次測試中，突變體A10-4和A8-1顯示出7.3到13.8倍于母本菌株2134的組成性、不受抑制的大麥β-葡聚糖水解活性，其中的突變菌株是通過本發(fā)明的誘變方法而從該母本菌株中獲得的。平均起來，突變體A10-4和A8-1顯示出大約10倍于母本菌株2134的組成性、不受抑制的大麥β-葡聚糖水解活性。在表3中也很明顯，菌株A10-4和A8-1的15天PDB培養(yǎng)物通過多孔板擴散分析而測定出分別具有大于2.0U/ml和2.5U/ml大麥β-葡聚糖水解活性。
表4總結了本發(fā)明小盾殼霉菌株的其它優(yōu)越特性。表4比較了小盾殼霉母本菌株2134和突變體A8-1、A10-4和M11-3B2的細胞外羧甲基纖維素水解活性。檢測各種培養(yǎng)條件，包括PDB(受簡單糖類的抑制，無β-葡聚糖誘導物來源)、PDB+誘導體(受簡單糖類的抑制，有β-葡聚糖誘導物來源)、和MCD+誘導物(無抑制性簡單糖的來源但具有β-葡聚糖誘導物來源的基本培養(yǎng)基)。主要結果為PDB的結果。如前面所討論的，PDB類似于將優(yōu)選用于商業(yè)發(fā)酵設備中的粗培養(yǎng)基。在PDB上具有β-葡聚糖酶活性的菌株具有不受簡單糖類的存在抑制的組成性β-葡聚糖酶活性。正如表4中的第3欄中所見到的，雖然菌株2134在PDB上沒有顯示羧甲基纖維素水解活性，但突變體M11-3B2、A10-4和A8-1中都在PDB上顯示出顯著的羧甲基纖維素水解活性。在表4中也很明顯，當通過OBR-HEC分析進行測定時，菌株A10-4和A8-1的15天PDB培養(yǎng)物分別具有大于0.4U/ml和0.7U/ml的纖維素水解活性。β-葡聚糖酶活性在表4中表示為每ml測定的酶溶液的單位數(shù)。即，對每種菌株測定等體積的培養(yǎng)上清。
在表5中顯示了本發(fā)明小盾殼霉菌株的大麥β-葡聚糖水解活性、地衣多糖水解活性、昆布多糖水解活性和纖維素水解活性?？偨Y于表5中的結果相應于培養(yǎng)在提供了1％核盤菌菌核作為誘導物(一種天然β-葡聚糖來源)的MCD上的菌株。因此，這些結果就在MCD+誘導物培養(yǎng)基上篩選的突變體M11-3B2而言特別重要，而對于在PDB上篩選的突變體A8-1和A10-4則提供較少的信息。在一個15天培養(yǎng)物中，突變體M11-3B2顯示出比母本菌株2134高8％的大麥β-葡聚糖水解活性，高46％的地衣多糖水解活性，即平均比母本非誘變菌株(2134)高25％的內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性。如前所述，由于大麥β-葡聚糖和地衣多糖兩者均受內切-1，3-β-葡聚糖酶活性和內切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性最為有效的水解，故這些結果表明M11-3B2突變體的內切-1，3-β-葡聚糖酶與內切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性較母本2134菌株提高。如表5中所顯示的，突變體M11-3B2顯示出寬范圍的β-葡聚糖酶活性，即，當對培養(yǎng)于含有1％核盤菌菌核的MCD培養(yǎng)基中的15天培養(yǎng)物通過改良的還原糖分析法測定時，具有高于7.0U/ml的昆布多糖水解活性、6.0U/ml的大麥β-葡聚糖水解活性、6.0U/ml的地衣多糖水解活性和2.0U/ml的纖維素水解活性。
表5a顯示對培養(yǎng)于含有1％核盤菌菌核的MCD培養(yǎng)液中的9天培養(yǎng)物測得的小盾殼霉菌株2130和2135相對于菌株2134、2132和2136的昆布多糖水解活性、大麥β-葡聚糖水解活性、地衣多糖水解活性和纖維素水解活性。菌株2132和2136是從加拿大大草原中收集到的其它小盾殼霉菌株，并且保藏于Lethbridge研究中心培養(yǎng)物保藏中心(Lethbridge Research Centre Culture Collection)。盡管對每種測試的底物都較菌株2134顯示出更低的β-葡聚糖酶活性，但是菌株2130和2135對四種底物都一致具有強的β-葡聚糖酶活性。
描述于本說明書實施例2中的擴增片段長度多態(tài)性(“AFLP”)分析測得野生型菌株2134和突變體M11-3、M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4(通過誘變獲得)聚集在一個密組中，它們的相異度指數(shù)小于0.50，表明它們高水平的遺傳相關性，盡管有些突變體相對于母本菌株2134的β-葡聚糖酶活性有實質性的增加。因此很明顯，源自小盾殼霉菌株2134(ATCC 74415)的小盾殼霉突變菌株可保持β-葡聚糖酶活性，盡管具有可以識別的(通過AFLP或其它形式的分析)結構或組成上的基因組變化，本領域技術人員將會認識到，源自小盾殼霉ATCC 74415的這種突變菌株可容易地通過本說明書實施例1中給出的分析方法測定其β-葡聚糖酶活性，并且應當明白，具有β-葡聚糖酶活性的這種菌株屬于本發(fā)明的范圍和精神之內。
本發(fā)明通過下面的非限制性實施例進一步加以說明。
實施例1小盾殼霉的β-葡聚糖酶活性真菌及培養(yǎng)條件從加拿大Manitoba(Huang 1981)和Alberta收集到的小盾殼霉菌株保藏于Lethbridge研究中心模式培養(yǎng)物保藏中心。突變菌株M11-3B2、A10-4和A8-1來自紫外輻射后的母本菌株2134(野生型)。誘變方案的細節(jié)描述如下。所有的原種培養(yǎng)物保存于液氮中的10％甘油中。在PDA(Difco Laboratories，Detroit，Michigan，美國)上短時間維持工作培養(yǎng)物。通過可見的自發(fā)突變如形態(tài)或顏色連續(xù)篩選PDA上的培養(yǎng)物中的培養(yǎng)變異體。下面詳細描述真菌特征分析的方法。振蕩液體培養(yǎng)物中胞外酶的制備測定培養(yǎng)于MCD+1％“誘導物”液體培養(yǎng)基中的小盾殼霉培養(yǎng)物上清液的胞外β-葡聚糖酶活性。培養(yǎng)基中含有以下成分(每升蒸餾水)NH4H2PO4，2.0g；K2HPO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；FeSO4，0.01g；“誘導物”(富含β-葡聚糖的核盤菌菌核干粉)，10.0g；1％ZnSO4，1ml；0.5％CuSO4，1ml。測定培養(yǎng)于PDB(Difco)中的小盾殼霉培養(yǎng)物上清液中的酶組成性表達。將培養(yǎng)物在20℃連續(xù)光照(12.5μmole m-2s-1)并且振蕩條件(振速200rpm)下培養(yǎng)。小盾殼霉的干重收集在PDB、PDB+1％“誘導物”和MCD+1％“誘導物”中培養(yǎng)15天后的真菌培養(yǎng)物固體物質(取樣后45ml)，并且以5,000×g離心10分鐘。將菌絲體沉淀物轉移到鋁箔測量皿中并于90℃加熱48小時。稱量每只平板中剩余的干物質。酶分析用下面的方法測定樣品上清液中小盾殼霉的胞外酶活性1)多孔板擴散分析；2)OBR-HEC分析；3)改良的還原糖分析；4)β-葡聚糖酶平板清除分析。對培養(yǎng)于PDB中培養(yǎng)物的上清液進行多孔板擴散分析、β-葡聚糖酶平板清除分析和OBR-HEC分析。β-葡聚糖酶平板清除分析也可適用于直接測定生長中的培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶活性。由于培養(yǎng)基中大量的已還原糖的存在而導致高背景，不能用改良的還原糖分析法來分析培養(yǎng)于PDB中的培養(yǎng)物。然而，OBR-HEC分析僅可測定內切-1，4-β-葡聚糖酶活性，并且多孔板擴散分析受到商業(yè)上制備的不溶性AZCL底物(Megazyme國際愛爾蘭有限公司，Bray，County Wicklow，愛爾蘭)來源的限制。改良的還原糖分析可用任何高質量的底物如可得自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，Missouri，美國)的β-葡聚糖、昆布多糖、地衣多糖或纖維素進行。多孔板擴散β-葡聚糖酶分析正如在本說明書和權利要求書中所使用的，在該部分中描述的β-葡聚糖酶分析應該定義為“多孔板擴散分析”。
在該分析以及下文所述的每種β-葡聚糖酶分析中，將β-葡聚糖酶活性表示為每ml小盾殼霉培養(yǎng)上清液中β-葡聚糖酶活性的單位數(shù)(“U”)。如前面所討論的，一單位的β-葡聚糖酶活性定義為在37℃每分鐘導致1μmol葡萄糖當量的還原糖釋放的β-葡聚糖酶活性的量。
為了進行這里所述的每種β-葡聚糖酶活性分析，將用于β-葡聚糖酶活性測定的真菌培養(yǎng)物以三份培養(yǎng)于250ml錐形瓶中的50ml培養(yǎng)液中。用3個采自PDA上旺盛生長菌落(4-5日齡)邊緣的菌絲體塊(用3號打孔器)接種每只錐形瓶。將培養(yǎng)物于20℃在持續(xù)光照(12.5μmol m-2s-1)以及200rpm的搖床中溫育。在接種后3、6、9、12和15天從每只瓶中取出1ml生長培養(yǎng)基而取真菌培養(yǎng)物樣品。將樣品收集于1.5ml的Eppendorf管中并于5000×g離心5分鐘。
用于通過多孔板擴散分析篩選產(chǎn)生高水平β-葡聚糖酶的真菌分離物的分析培養(yǎng)基，含有溶解于25mM pH4.5乙酸鈉中的0.2％AZCL-β-葡聚糖和2.0％瓊脂。將該分析培養(yǎng)基高壓滅菌并且冷卻至55℃，在傾倒前攪拌以確保AZCL-β-葡聚糖顆粒的均勻分布。小心地準確吸取20ml的分析培養(yǎng)基移至位于水平表面上96孔板的蓋子中。一旦固化后，將切成與該96孔板匹配的單層滅菌干酪布小心置于該分析培養(yǎng)基上，從而將蓋子襯上。加入干酪布是為加強基質分析培養(yǎng)基，繼而強化在酶消化后易于降解的瓊脂分析培養(yǎng)基層。
將50μl每種標準的內切葡聚糖酶樣品加入96孔擴散分析板的第一排孔(1a-f)和剩余的孔中，從96孔誘變板中將50μl每種測試真菌培養(yǎng)上清液轉移到96孔擴散分析板的相應小孔中。然后向該擴散分析板中的所有孔中加入25mM乙酸鈉(pH4.5)至350μl的終體積。然后將襯有分析培養(yǎng)基的蓋子小心置于填充有樣品的96孔分析板的頂部，并在將此蓋與平板緊壓在一起的同時倒置。緊壓平板底部而去除所有的氣泡(迫使所有氣泡升至倒置小孔的底部)，以確保酶樣品與分析培養(yǎng)基之間直接接觸。在室溫將分析平板溫育數(shù)小時(通常過夜)。為了增加酶反應速度，該分析平板可在更高的溫度(即，37℃-40℃)溫育，從而縮短進行此分析所需的時間長度。雖然天青色苯胺染料交聯(lián)的β-葡聚糖在緩沖液中是不溶的，然而，該分析培養(yǎng)基對底物的快速水化將形成可被內切葡聚糖酶消化的可溶性凝膠顆粒。內切-1，3-β-葡聚糖酶或內切-1，4-β-葡聚糖酶的消化釋放出藍色染料片段至該培養(yǎng)基中，從而導致可見的藍色。將商業(yè)上可得到的內切葡聚糖酶(或是對大麥β-葡聚糖具有測得比活為76.5U/mg的纖維素酶(EC 3.2.1.4)，Megazyme，或是對大麥β-葡聚糖具有測得比活為118U/mg的地衣淀粉酶(EC 3.2.1.73))在25mM乙酸鈉(pH4.5)中稀釋至終濃度為2、1、0.5、0.25、0.125、0.06及0.00U/ml。因此，藍色染料滲透性地從固體瓊脂分析培養(yǎng)基中擴散至96孔平板小孔中接觸的樣品/酶溶液中。結果，在含有較高β-葡聚糖酶活性的樣品孔中將顯現(xiàn)較強的藍色。為了測定酶活性，將平板小心地立起來，并小心地取下蓋子。于590nm處在自動平板讀數(shù)器上讀取樣品的吸收值。根據(jù)由每個小孔中標準內切葡聚糖酶樣品相對光密度制作的標準曲線預測樣品的活性。為了使染料與酶在樣品孔間的擴散最少，在分析平板孔中一見到藍色就立即取下蓋子而終止酶反應溫育步驟。將分析平行進行兩次。Ostazin亮紅羥乙基纖維素(OBR-HEC)分析正如本說明書及權利要求書中所使用的，在該部分中描述的β-葡聚糖酶分析應該定義為“OBR-HEC分析”。
用于β-葡聚糖酶活性測定的小盾殼霉培養(yǎng)物的制備與多孔板擴散β-葡聚糖酶分析中相同。
在25mM pH4.5的乙酸鈉中制備8mg/ml的OBR-HEC(Sigma-Aldrich目錄號O-6879)底物溶液。將樣品上清液(酶溶液)適當稀釋于25mM pH4.5的乙酸鈉中。將底物與酶溶液均平衡至37℃5分鐘。將100μl的底物與100μl的酶溶液在1.5ml Eppendorf小管中混合。將酶反應液于37℃水浴中溫育120分鐘。通過加入0.8ml冰冷的乙醇-丙酮(2∶1)而終止反應。將樣品混合并于室溫靜置30分鐘。將樣品以12,000×g在小型離心機中離心2分鐘。在550nm處在0.5ml的比色杯中測定上清液的光密度。每個樣品與背景對照一起平行測定2次。對照如上所述制備，但是在用乙醇-丙酮終止溫育后將底物加入到酶溶液中。通過減去背景對照值而校正樣品測試值。由用商業(yè)上可得到的纖維素酶(EC 3.2.1.4)(Megazyme)制做的標準曲線估計酶活性在0.1到1U/ml的范圍。改良的還原糖分析正如在本說明書和在權利要求書中所使用的，在該部分中描述的β-葡聚糖酶分析應該定義為“改良的還原糖分析”。
用于β-葡聚糖酶活性測定的小盾殼霉培養(yǎng)物制備與多孔板擴散β-葡聚糖酶分析中相同。
分析在96孔滴定板中進行。將50μl的樣品上清液/酶加入到每小孔中并平衡至37℃。然后，將50μl在25mM，pH4.5的乙酸鈉中以5mg/ml的濃度稀釋并平衡至37℃的羧甲基纖維素(#C-5013 Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，美國)、地衣多糖(Sigma #L-6133)、昆布多糖(Sigma，9634)和β-葡聚糖(Megazyme P-BGBH)加入到該酶中。使分析物在37℃反應15分鐘并通過加入在使用前混合的100μl冷溶液B(0.3％二硝基苯二酸)和溶液C(1.8M K2CO3+0.1M Na2S2O31∶1 v/v)而終止。將樣品在95℃加熱45分鐘直到反應完成。用平板讀數(shù)器測定410nm光密度的吸收。背景吸收通過對照樣品加以測定并從樣品吸收中減去。按照與上面概述的無溫育測試分析相同的方法，制備每種樣品的對照反應物，在加入底物到對照樣品中后立即加入終止液B+C。根據(jù)用從50μg/ml到500μg/ml的一系列葡萄糖濃度制做的標準曲線估計酶活性。除了用100μl葡萄糖標準物代替50μl底物+50μl上清液混合物之外，標準物的制備與上述用于測試分析的方法相同。將得到大于3.0光密度的樣品稀釋并且再次測定。樣品如下進行稀釋第3天的樣品不稀釋，第6天的樣品以1∶2稀釋，第9和第12天的樣品以1∶5稀釋，第15天的樣品以1∶10稀釋。一單位酶活性定義為在37℃每分鐘釋放1μmol葡萄糖當量的還原糖所需的酶量。β-葡聚糖酶平板清除分析正如本說明書及權利要求書中所使用的，在該部分中描述的β-葡聚糖酶分析應該定義為“β-葡聚糖酶平板清除分析”。
用于β-葡聚糖酶活性測定的小盾殼霉的制備與多孔板擴散分析相同。
可直接在AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂培養(yǎng)基上篩選小盾殼霉培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶活性。AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂培養(yǎng)基含有以下組分(每升蒸餾水中)NH4H2PO4，2.0g；K2HPO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；FeSO4，0.01g；AZCL-β-葡聚糖(Megazyme)，0.2g；1％ZnSO4，1ml；0.5％CuSO4，1ml；瓊脂，20.0g。由于AZCL-β-葡聚糖顆粒是不溶性的，故在高壓滅菌后冷卻培養(yǎng)基至55℃并且在臨傾倒前攪拌從而確保AZCL-β-葡聚糖顆粒的均勻分布是很重要的。通過測定真菌菌落周圍由于不溶性AZCL-β-葡聚糖顆粒水解和藍色染料釋放而導致的清亮區(qū)來監(jiān)測0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂培養(yǎng)基上的β-葡聚糖酶活性。
也可用對上述方法稍作調整的這種平板清除方法分析液體培養(yǎng)物上清液的胞外酶活性。為了建立小孔，將無菌的不銹鋼環(huán)(1.0cm直徑)置于高壓滅菌的溶解于25mM pH4.5乙酸鈉中的0.2％AZCL-β-葡聚糖和2％瓊脂的頂部。將50μl體積測試液(酶)置于小孔中并讓其擴散入培養(yǎng)基中過夜(18小時)。一旦所有的溶液都被吸收入培養(yǎng)基中，則取下該環(huán)。于37℃溫育24小時后，測定并記錄清亮區(qū)直徑。用商業(yè)上可得到的稀釋于25mM乙酸鈉(pH4.5)中至終濃度0.25、0.5、1.0、2.5和5U/ml的內切葡聚糖酶(或者為對大麥β-葡聚糖具有76.5U/mg測得比活的纖維素酶(EC 3.2.1.4)(Megazyme)，或者為對大麥β-葡聚糖具有118U/mg測得比活的地衣淀粉酶(EC 3.2.1.73))的結果制做標準曲線。小盾殼霉的表型特征分析在0.2％大麥β-葡聚糖MCD瓊脂、0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂、MCD+1％“誘導物”瓊脂和PDA上，對小盾殼霉培養(yǎng)物進行表型特征分析。大麥β-葡聚糖MCD瓊脂、0.2％AZCL-β-葡聚糖瓊脂和PDA的制備與上述相同。通過再加入20.0g瓊脂到1升上述的MCD液體培養(yǎng)基中制備MCD瓊脂。還在補充0.2％AZCL-β-葡聚糖的PDA上篩選β-葡聚糖酶的組成性表達。
為了對小盾殼霉母本和突變培養(yǎng)物表型進行特征分析，用3號打孔器(6mm直徑)從PDA上的4到5日齡培養(yǎng)物邊緣的菌絲體墊上切下瓊脂塊。將菌絲體塊接種于PDA、0.2％大麥β-葡聚糖MCD瓊脂和0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂上，其中將1個菌絲體塊置于每個培養(yǎng)平板的中央。將培養(yǎng)物在光照和20℃下溫育。接種后14天記錄菌落顏色、培養(yǎng)物形狀、生長速度和孢子形成的表型變化。同時用75％乙醇清洗培養(yǎng)物15分鐘以從真菌菌落中提取有色物質(Huang，1981)。小盾殼霉突變體的誘變與分離方法A在瓊脂上對孢子進行紫外輻射將來自菌株2134的小盾殼霉孢子劃線接種到PDA上并使其在20℃萌發(fā)48小時。然后分別挑取萌發(fā)的孢子并轉移至AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂培養(yǎng)基中。將萌發(fā)的孢子(9個培養(yǎng)平板)置于距短波(254nm)紫外滅菌燈(782 L30型，Westinghouse電子公司，Pittsburgh，Pennsylvania，美國)30cm距離處。取下培養(yǎng)平板蓋，對萌發(fā)的孢子進行紫外輻射1分鐘、2.5分鐘或5分鐘。將未暴露至紫外光的一平板萌發(fā)孢子用作對照。輻射后，將平板于20℃置于黑暗中48小時，然后于20℃置于光照下。輻射后，每天監(jiān)測真菌的生長和β-葡聚糖酶的表達。由于輻射過的孢子已接種于AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂培養(yǎng)基上，可通過β-葡聚糖酶平板清除分析方法直接監(jiān)測β-葡聚糖酶的活性。從在菌落周圍形成最大清亮區(qū)的那些菌落中獲取單個菌絲頂端培養(yǎng)物。將產(chǎn)生高活性酶的培養(yǎng)物在補充了0.2％AZCL-β-葡聚糖、0.2％大麥β-葡聚糖或0.2％“誘導物”作為唯一碳水化合物來源的基本選擇培養(yǎng)基(MCD)上反復傳代培養(yǎng)。在20℃光照下溫育5-7天后，由最初暴露于紫外光的原初0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂平板上的存活輻射孢子培養(yǎng)物，在PDA和0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂上建立單個菌絲頂端培養(yǎng)物。
方法B在懸液中對孢子進行紫外輻射在含有以下成分(每升蒸餾水中)的0.2％大麥β-葡聚糖MCD液體培養(yǎng)基中制備孢子懸液(～10ml，1×104個孢子/ml)NH4H2PO4，2.0g；K2HPO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；FeSO4，0.01g；大麥β-葡聚糖，0.2g(Megazyme)；1％ZnSO4，1ml；0.5％CuSO4，1ml。將孢子懸液置于距短波(254nm)紫外光滅菌燈(Westinghouse 782 L30)10cm距離處的開口培養(yǎng)皿中。在暴露于紫外光之前從該平板中取出對照樣品(1ml)。暴露于紫外光1、3和5分鐘后取出處理后的樣品。調整紫外光輻射時間長度至3分鐘，從而殺死大約97-99％懸液中的孢子。輻射后，將200μl孢子懸浮轉移至96孔板中的每孔中(或者1×103個輻射孢子/孔或大約10-30個活孢子/孔)。將第一排留作對照排，其中含有200μl未輻射的孢子。頭48小時中將平板置于20℃黑暗中以防止光復活，然后再轉移到20℃完全光照下14天。為了篩選組成性突變體的β-葡聚糖酶活性，除了將孢子懸浮于PDB中以外，如上所述用紫外光輻射小盾殼霉孢子。產(chǎn)生高活性β-葡聚糖酶的小盾殼霉的初步篩選通過上述的多孔板擴散分析篩選含有具有高β-葡聚糖酶活性的突變小盾殼霉培養(yǎng)物的孔。在96孔板中，將50μl濃度為2、1、0.5、0.25、0.125、0.06和0.00U/ml(稀釋于25mM乙酸鈉(pH4.5)中)的纖維素酶標準物加入到第一排(孔1a-g)中。用八管微加樣器，將該96孔培養(yǎng)板每孔中的50μl培養(yǎng)物無菌轉移至96孔擴散分析板的相應孔中(注在培養(yǎng)板中的對照第1排不轉移至用于酶標準物的分析平板中)。
用Mohler等所述的方法(1996)在波長650nm處讀取光密度，從而估計培養(yǎng)板每孔中存在的菌絲體的量。將具有低菌絲體量但具有高酶活性的孔列為分離的目標。具有增加的β-葡聚糖酶活性的遺傳純小盾殼霉系的分離將具有最高酶活性的孔中的菌絲體轉移至0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂平板上。3-4天后，從菌落中分離單個菌絲頂端(～10個/板)，轉移至培養(yǎng)平板中的PDA上，并于20℃光照下溫育4-5天。選擇表型不同的單個菌絲頂端培養(yǎng)物并測定其酶產(chǎn)量。用3號打孔器從PDA上突變培養(yǎng)物的邊緣取出菌絲體塊，并以3塊/試管將其置于15ml試管中的3ml MCD+1％“誘導物”液體培養(yǎng)基中。將試管以一定的角度置于搖床中的試管架中，并于20℃溫育，同時以200rpm振搖。在第7和第14天，用上述的快速擴散平板分析測定培養(yǎng)物的酶活性。將產(chǎn)生最高β-葡聚糖酶的小盾殼霉系保存于液氮中，并傳代培養(yǎng)單個菌絲頂端，再轉移至PDA/0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂中。將二次分離的這些突變培養(yǎng)物再次培養(yǎng)于PDA上，并按上述在3ml MCD+1％“誘導物”液體培養(yǎng)物中再次測定β-葡聚糖酶的產(chǎn)量。在這2次分離步驟后，第三次測定具有最高β-葡聚糖酶產(chǎn)量的所得真菌培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶產(chǎn)量。將真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)于裝有10ml MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液的較大的50ml培養(yǎng)瓶中7到14天，并用優(yōu)化的還原糖分析進行測定。比較突變菌株的酶產(chǎn)量與母本菌株的酶活性。源自誘變及分離方法A和B的小盾殼霉突變體的酶分析測定小盾殼霉母本菌株2134及其衍生突變體M11-3B2、A10-4與A8-1的胞外酶產(chǎn)量。將培養(yǎng)物培養(yǎng)于土豆葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)、PDB加上1％“誘導物”(核盤菌菌核干粉)和含有以下成分(每升蒸餾水中)的MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中NH4H2PO4，2.0g；K2HPO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g；KCl，0.5g；FeSO4，0.01g；“誘導物”，10.0g；1％ZnSO4，1ml；0.5％CuSO4，1ml。PDA與PDB由可從Difco Laboratories(Detroit，Michigan，美國)供應的商業(yè)培養(yǎng)基加以制備。將真菌培養(yǎng)物以三份平行培養(yǎng)于250ml錐形瓶中的50ml培養(yǎng)液中。每只瓶中接種采自PDA上旺盛生長菌落(4-5日齡)邊緣的3個菌絲體塊(用3號打孔器)。將培養(yǎng)物于20℃連續(xù)光照(12.5μmol m-2s-1)下于200rpm搖床中溫育。接種后3、6、9、12和15天通過從每只瓶中取出1ml生長培養(yǎng)基而從真菌培養(yǎng)物中取樣。將樣品收集于1.5ml Eppendorf管中并于5000×g離心5分鐘。用下面的方法測定樣品上清液中的胞外酶活性1)多孔板擴散分析；2)OBR-HEC分析；3)改良的還原糖分析。對培養(yǎng)于PDB上的培養(yǎng)物的上清液進行多孔板擴散分析和OBR-HEC分析。酶譜-CMC通過酶譜分析研究母本小盾殼霉菌株2134的纖維素酶(羧甲基纖維素水解活性)。用在灌膠過程中摻入0.5％羧甲基纖維素(“CMC”)的Laemmli凝膠，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(“SDS-PAGE”)檢測纖維素酶條帶。下面的樣品于該凝膠中電泳A道，20μl上清液；B道，20μl濃縮上清液(10X)；C道，低分子量標記；D道，20μl濃縮上清液(10X)；E道，15μl濃縮上清液(10X)；F道，20μl上清液；G道，20μl來自菌株#2314的濃縮上清液(10X)。電泳后將凝膠于室溫浸泡于1％TritonX-100中1小時(換3次，每次清洗200ml)以去除SDS，于4℃浸泡于50mM磷酸緩沖液(pH6.5)中1小時以使酶復性，并且在37℃浸泡于50mM磷酸緩沖液(pH6.5)中1-18小時以引發(fā)酶活性。通過銀染色觀察蛋白。通過用1％剛果紅染色凝膠1小時并用1M NaCl清洗而觀察酶條帶。用綠色Wratten # 58濾光鏡(Eastman Kodak公司，Rochester，紐約，美國)(用寶麗來系統(tǒng)和寶麗來556正/負膠片(Polaroid Corporation，Cambridge，Massachusetts，USA)，焦距5.6，曝光0.25秒)對凝膠拍照。結果與討論誘變與突變體的分離方法A.瓊脂上孢子的紫外光輻射紫外光輻射1分鐘后大約88％的小盾殼霉孢子維持存活，而輻射2.5分鐘后67％的孢子維持存活，輻射5分鐘后50％的孢子維持存活。大約50％存活的輻射真菌培養(yǎng)物在培養(yǎng)于0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂培養(yǎng)基上7天后具有相對較大的清亮區(qū)(＞3mm)。通過單個菌絲頂端分離而進一步遺傳純化具有大于3mm清亮區(qū)的培養(yǎng)物。將單個菌絲頂端轉移至PDA及0.2％AZCLβ-葡聚糖MCD瓊脂上。同時反復在0.2％AZCLβ-葡聚糖上傳代培養(yǎng)小盾殼霉突變體以強制突變體在β-葡聚糖上生長，并分析β-葡聚糖酶活性的自發(fā)上調。在PDA上光照培養(yǎng)14天后，根據(jù)表型改變如菌落顏色、生長速度、孢子形成及形狀，區(qū)分突變體與母本菌株2134(野生型)。
通過紫外光輻射從母本菌株2134中獲得大約50個菌落的小盾殼霉突變體。將這些突變體分離物隨后培養(yǎng)于0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂培養(yǎng)基上。除了表型特征分析外，還測定了突變體的酶產(chǎn)量。將小盾殼霉培養(yǎng)物培養(yǎng)于125ml錐形瓶中的20ml MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中，并在第3天和第5天通過改良的還原糖方法分析胞外酶活性。產(chǎn)生高水平β-葡聚糖酶的突變體迅速利用“誘導物”底物，從而導致早在接種后4-5天培養(yǎng)基就出現(xiàn)清亮。將產(chǎn)生高水平β-葡聚糖酶的2種突變體(M11和M11-3，姐妹培養(yǎng)物)的酶水平與原初母本2134野生型進行比較。M11培養(yǎng)物是由紫外光輻射1分鐘后在0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂培養(yǎng)基上進行篩選而產(chǎn)生的初級突變體。從原初M11突變體的單個孢子中分離M11-3。開始的酶產(chǎn)量實驗表明，突變體M11-3(1.88U/ml)到培養(yǎng)于MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中5天時，β-葡聚糖酶表達大約較母本菌株2134高5X(0.33U/ml)。為了增加該突變體的β-葡聚糖酶產(chǎn)量，將其連續(xù)傳代培養(yǎng)于0.2％AZCL-β-葡聚糖瓊脂培養(yǎng)基上。突變體M11-3B2是原初突變體M11在0.2％AZCL-β-葡聚糖瓊脂培養(yǎng)基上傳代8次后的子代。在20℃光照下培養(yǎng)于PDA上14天的培養(yǎng)物中突變體M11-3B2與母本菌株2134之間的形態(tài)特征差異明顯。這些突變體的表型特征分析也總結于表1中。同時也發(fā)現(xiàn)，源自突變體M11的突變培養(yǎng)物當培養(yǎng)于PDA上時不穩(wěn)定，因為在PDA上長期培養(yǎng)導致酶活性下降，因此，在基本限制培養(yǎng)基如0.2％AZCL-β-葡聚糖MCD瓊脂培養(yǎng)基上的傳代對于培養(yǎng)物的維持似乎是必需的。
方法B懸液中孢子的紫外光輻射用0.2％β-葡聚糖MCD培養(yǎng)液作為小盾殼霉的選擇性培養(yǎng)基的策略是為了限制來自具有下調β-葡聚糖酶產(chǎn)量的突變的孢子的菌絲體生長，同時選擇性地促進來自具有上調β-葡聚糖酶活性的突變的孢子的菌絲體生長。假設具有高β-葡聚糖酶活性的突變孢子培養(yǎng)物將以比低β-葡聚糖酶產(chǎn)量的突變孢子培養(yǎng)物更快的速度生長并且產(chǎn)生更多的β-葡聚糖酶，則產(chǎn)生高水平β-葡聚糖酶的突變體將在相同的孔中把產(chǎn)生低水平β-葡聚糖酶的突變體競爭出去。
用0.2％β-葡聚糖MCD培養(yǎng)液作為起始培養(yǎng)基，用方法B篩選出大約6000個小盾殼霉菌株2134的活紫外光輻射孢子。從用多孔擴散平板分析測得具有相對較高β-葡聚糖酶活性的孔中得到的小盾殼霉培養(yǎng)物中，通過單個菌絲頂端分離而分離到大約75個突變培養(yǎng)物。通過培養(yǎng)于3ml MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中而測定這些突變體的β-葡聚糖酶產(chǎn)量2次。在這些突變體中，通過在50ml錐形瓶中更大的10ml體積的MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中培養(yǎng)培養(yǎng)物，第三次測定26個突變體的酶產(chǎn)量。產(chǎn)生最高水平酶的突變體似乎為突變體菌株A7-3D。光照下培養(yǎng)于PDA上的A7-3D 14日齡培養(yǎng)物的表型特征描述于表1中。然而，當進一步分析A7-3D培養(yǎng)物的酶活性時，該活性似乎下降，并且未能將突變體M11-3競爭出去。
使用基本限制性培養(yǎng)基0.2％β-葡聚糖MCD作為選擇培養(yǎng)基不能區(qū)分顯示出誘導性或組成性β-葡聚糖酶生產(chǎn)的突變孢子。同樣，0.2％β-葡聚糖MCD培養(yǎng)基將不能區(qū)分β-葡聚糖酶產(chǎn)量受或不受簡單糖類如葡萄糖存在抑制的突變孢子，使用PDB作為選擇培養(yǎng)基將允許活孢子無論在有上調還是下調β-葡聚糖酶產(chǎn)量的突變時都能生長。PDB將提供富含簡單糖類的環(huán)境，因此一般將抑制母本菌株2134中的β-葡聚糖酶表達。PDB也將不會誘導β-葡聚糖酶的表達，因為該培養(yǎng)基中將存在很少的β-葡聚糖底物來誘導表達。因此，任何含有產(chǎn)生β-葡聚糖酶的菌絲體的孔都將表明，得到的突變?yōu)榻M成性的或者至少該真菌菌絲體β-葡聚糖酶的表達部分地不受葡萄糖存在和/或β-葡聚糖缺乏的影響。
同時認為，每孔中菌絲體的生長量影響該孔中β-葡聚糖酶的活性。與較高的β-葡聚糖酶活性相關的更多的菌絲體生長并不表明β-葡聚糖酶的表達增加。因此，為了估計菌絲體的生長，在650nm處讀取96孔培養(yǎng)板的光密度。在解剖顯微鏡下目測證實菌絲體培養(yǎng)物的光密度。與較少菌絲體相關的更高的酶活性表明有強上調β-葡聚糖酶活性的突變。
將大約4000個紫外光輻射的小盾殼霉菌株2134的活孢子培養(yǎng)于PDB中，并且篩選β-葡聚糖酶活性。在352個篩選的孔中，2個孔得到相對較高的β-葡聚糖酶活性，但孔中有相對較低量的菌絲體。將這些孔的菌絲體轉移至并培養(yǎng)于PDA上。從該菌落中制備單個菌絲頂端分離物以在PDA上建立純培養(yǎng)物。將來自這2個孔的培養(yǎng)物培養(yǎng)于3mlPDB試管培養(yǎng)物上，并通過多孔板擴散分析篩選β-葡聚糖的表達。通過測定PDB中的β-葡聚糖酶活性，鑒定組成性表達的β-葡聚糖酶培養(yǎng)物。鑒定出菌株A8-1和A10-4為產(chǎn)生組成性β-葡聚糖酶的突變體。在光照下培養(yǎng)于PDA上的A8-1和A10-4的14日齡培養(yǎng)物的表型特征描述于表1中。液體培養(yǎng)物中小盾殼霉突變體M11-3B2、A8-1和A10-4的酶產(chǎn)量。
小盾殼霉菌株2134及其突變體在液體培養(yǎng)物中的生長在每5ml培養(yǎng)物中培養(yǎng)15天后用干菌絲體量來測定小盾殼霉在PDB、PDB+1％“誘導物”或MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中的生長。菌絲體平均干重表明，四種小盾殼霉菌株中都在PDB+1％“誘導物”中生長最好，其次是PDB，再次是MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液(表2)。PDB富含營養(yǎng)物(淀粉和簡單糖類)。1％“誘導物”是碳水化合物(主要由β-葡聚糖所構成)的天然來源(Saito 1977)。正如所預期的，由于更大量的簡單碳水化合物的存在，培養(yǎng)物在PDB+1％“誘導物”中生長最好。母本菌株2134在PDB中比突變菌株生長快(表2)，這與菌株2134在PDA上的生長速度相關(表1)。
培養(yǎng)于PDB中的小盾殼霉菌株2134、M11-3B2、A8-1和A10-4的β-葡聚糖酶的產(chǎn)量通過多孔板擴散分析測定當培養(yǎng)于PDB中15天時小盾殼霉母本菌株2134與突變菌株M11-3B2、A8-1及A10-4的胞外酶產(chǎn)量。當培養(yǎng)于PDB中時，母本菌株2134的大麥β-葡聚糖水解活性大大受到抑制，培養(yǎng)15天后產(chǎn)生不到0.25U/ml的活性(表3)。在這三個平行實驗的每個實驗中，突變體A10-4與A8-1的大麥β-葡聚糖水解活性顯著較高，大約在1.8-3.5U/ml的范圍。突變體A8-1似乎較A10-4產(chǎn)生略高的大麥β-葡聚糖水解活性(表3)。當培養(yǎng)于補充0.2％AZCL-β-葡聚糖的PDA上時，母本菌株2134相對于突變體A10-4、A8-1和M11-3B2的大麥β-葡聚糖水解活性的抑制可以由培養(yǎng)于補充0.2％AZCL-β-葡聚糖的PDA上時真菌菌落周圍的清亮區(qū)觀察到。PDA富含抑制β-葡聚糖酶表達的淀粉和簡單糖類。當培養(yǎng)于補充0.2％AZCL-β-葡聚糖的PDA上時，母本菌株2134直到淀粉和簡單糖類已被用盡后才產(chǎn)生β-葡聚糖酶。因此，具有組成性表達的突變菌株(A10-4，A8-1)在真菌菌落周圍有一個可見的清亮區(qū)(大約5-7mm寬)，而母本菌株與其它無組成性表達的突變體菌落則沒有清亮區(qū)。突變體M11-3B2也似乎具有一定的組成性表達，并且有一個較小的清亮區(qū)(大約3mm寬)。
小盾殼霉母本菌株2134和突變體M11-3B2、A10-4和A8-1的纖維素水解活性用OBR-HEC分析測定小盾殼霉母本菌株2134和突變菌株M11-3B2、A8-1和A10-4的細胞外纖維素水解活性。當培養(yǎng)于PDB中時母本菌株2134具有不顯著量的纖維素水解活性，而突變菌株M11-3B2、A10-4和A8-1具有不同水平的纖維素水解活性(表4)。A8-1和A10-4顯示出最高水平的纖維素水解活性，測得產(chǎn)生的酶活性大約為0.5-0.9U/ml，而M11-3B2產(chǎn)生較低水平的酶活性，產(chǎn)生活性大約為0.2U/ml。當母本菌株2134培養(yǎng)于含1％誘導物的PDB中6到9天后，該菌株開始緩慢產(chǎn)生一些纖維素酶，到15天時顯示出大約0.2U/ml的纖維素水解活性(表4)。到15天時，在相同的條件下突變體M11-3B2產(chǎn)生大約2U/ml的纖維素水解活性，而突變菌株A8-1和A10-4到6天時，分別產(chǎn)生大約0.5和0.2U/ml的活性。當母本菌株2134培養(yǎng)于MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中時，具有最高的纖維素水解活性，到15天時大約為3U/ml。當培養(yǎng)于MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中時，突變體A10-4和A8-1均具有不顯著的纖維素水解活性，而突變體M11-3B2具有大約0.6U/ml的纖維素水解活性(表4)。
用改良的還原糖分析測得的小盾殼霉內切-1，3-β-葡聚糖酶和內切-1，4-β-葡聚糖酶活性只有培養(yǎng)于MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中的培養(yǎng)物才可用改良的還原糖分析法加以分析，因為培養(yǎng)于基于PDB的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物導致高水平的還原糖背景。用昆布多糖(a)、大麥β-葡聚糖(b)、地衣多糖(c)和CMC(d)作為底物的改良還原糖分析的結果示于表5中。CMC底物僅由β-1，4-D-葡聚糖構成。昆布多糖底物僅由β-1，3-D-葡聚糖構成。地衣多糖和大麥β-葡聚糖由1，3-和1，4-β-葡聚糖組成。到15天時母本菌株2134產(chǎn)生最高水平的纖維素水解活性(～3.4U/ml)，而突變體M11-3B2產(chǎn)生最高水平的昆布多糖水解活性(～7.2U/ml)。同時，M11-3B2突變菌株較母本菌株2134產(chǎn)生更高的地衣多糖水解活性(～6.5U/ml)和類似量的大麥β-葡聚糖水解活性(～6.5U/ml)(母本菌株分別為～4.5U/ml和～6.5U/ml)。底物地衣多糖較大麥β-葡聚糖具有更高的β-1，3對β-1，4鍵的比例，因而解釋了菌株2134略微增加的大麥β-葡聚糖水解活性。突變體A10-4和A8-1較母本菌株2134產(chǎn)生不顯著量的纖維素水解活性，但產(chǎn)生略少量的昆布多糖水解活性(分別為～4.3U/ml和～5.3U/ml)。酶譜-CMC對小盾殼霉菌株2134纖維素水解活性的酶譜分析顯示出一條具有很高纖維素水解活性的66kDa的條帶和具有較低活性的50和35kDa兩個條帶，這表明有多種酶或酶亞單位。最適pH測得培養(yǎng)于PDB上的小盾殼霉菌株A10-4的纖維素水解活性的最適pH為4.5。
測得培養(yǎng)于有β-葡聚糖來源的基本培養(yǎng)基上的小盾殼霉菌株2134的昆布多糖水解活性的最適pH為5.5。最適溫度測得培養(yǎng)于PDB上的小盾殼霉菌株A10-4的纖維素水解活性的最適溫度為45℃。
實施例2小盾殼霉野生型菌株和突變體的DNA指紋分析在該研究中選擇四種野生型小盾殼霉菌株2130、2134、2135和2137以及五種源自野生型菌株2134的突變菌株M11-3、M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4進行DNA指紋分析。所有的小盾殼霉菌株都收集自加拿大大草原(Huang 1981)并保藏于Lethbridge研究中心模式培養(yǎng)物保藏中心，這些菌株在該保藏機構中一直處于保密狀態(tài)，尚未向公眾公開。小盾殼霉菌株和突變體的原初培養(yǎng)物保存于液氮中的10％甘油中，工作培養(yǎng)物維持于PDA培養(yǎng)基上。
將每種小盾殼霉菌株或突變體的三個菌絲體內塊接種到50mlPDB液體培養(yǎng)基中，并在20℃光照下于旋轉搖床(200rpm)上溫育。2周后，過濾收集菌絲體并且凍干備用。用改良的蛋白酶K和苯酚-氯仿方法(Laroche等，1995)從該菌絲體樣品中分離基因組DNA。用分光光度計(Beckman Coulter公司，F(xiàn)ullerton，California，美國，DU-65型)在260nm處測定提取物中的DNA濃度(50μg/ml DNA/光密度單位)。用0.8％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色證實每種樣品DNA的大小。重復接種、溫育和從所有9個菌株或突變體中分離DNA。
用適于小基因組物種如大多數(shù)真菌的原初AFLP技術(Vos 1995)的改進方法，對小盾殼霉菌株及突變體進行DNA指紋分析。將總基因組DNA(0.5μg)在37℃用5U的BglII和5U的MseI在40μl體系中消化1小時。然后，加入含有5pmol BglII-銜接子(表6)、50pmolMseI-銜接子(表6)、1U T4 DNA連接酶的10μl混合物，并在37℃溫育進行限制性消化和連接反應3小時。
用下面的方式以35輪循環(huán)的逐漸降溫(touch-down)方法進行聚合酶鏈反應(“PCR”)DNA在94℃變性30秒，DNA退火步驟1分鐘，在72℃ DNA延伸2分鐘。第一輪循環(huán)中的退火溫度為65℃，然后在以后的10輪循環(huán)中每輪循環(huán)降低1℃，最后在56℃繼續(xù)進行剩下的25輪循環(huán)。用含有4μl模板DNA(來自限制性消化和連接反應混合物的1∶10稀釋液)、一對寡核苷酸引物(每種50ng)、0.5U Taq DNA聚合酶、2mM MgCl2和Tris-HCl緩沖液(pH8.3)中的2mMdNTP的20μl混合物進行此反應。
根據(jù)BglII-銜接子和MseI-銜接子的序列設計并合成AFLP引物(表6)，在每個引物的3′末端也含有一個或兩個額外的選擇性核苷酸。總共64種引物組合用于該研究中，包括四個MseI-引物(PMseA、PMseC、PMseG和PMseT)和16個BglII-引物(PBglAA、PBglAC、PBglAG、PBglAT、PBglCA、PBglCC、PaglCG、PBglCT、PBglGA、PBglGC、PBglGG、PBglGT、PBglTA、PBglTC、PBglTG和PBglTT)。將在該菌株和/或突變體中產(chǎn)生多態(tài)性DNA條帶圖案的引物組合重復至少兩次以確認AFLP標記。
將PCR擴增的產(chǎn)物首先通過2.0％瓊脂糖凝膠電泳(TAE緩沖液，pH8.0)進行大小分級分離，并通過溴化乙錠染色觀察DNA條帶。將這些產(chǎn)物也通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行大小分級分離并通過銀染色加以觀察。將每次PCR反應的等份試樣(10μl)上樣于1×TBE緩沖液(50mM Tris、50mM硼酸、1mM EDTA，pH8.0)中的7.0％聚丙烯酰胺凝膠(29∶1比例的丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺)中。將凝膠在恒定電壓(100V)下電泳并用Promega的DNA銀染色系統(tǒng)(Promega公司，Madison，Wisconsin，美國，目錄號DQ 7050)染色凝膠中的DNA片段。
在本研究中進一步用GeneScan熒光測定儀(Perkin Elmer公司，F(xiàn)oster City，California，美國)進行分子長度的測定和小盾殼霉菌株與突變體間DNA片段的相對定量。將以5-羧基熒光素熒光染料標記以進行大小檢測的5μM dUTP在PCR擴增過程中隨機摻入DNA片段中。將體積為0.5μl的ROX染料(GeneScan-2500)加入到每個上樣樣品中作為內道大小標準物。用GeneAmp檢測膠(Perkin Elmer公司，F(xiàn)oster City，California，美國，目錄號F 2252)在Applied BiosystemsDNA測序儀(373 A型)上進行大小分級分離電泳。用GeneScan672軟件(1993)收集和分析在電泳中檢測到的DNA片段的數(shù)據(jù)。
用數(shù)值分類法和多變量分析系統(tǒng)(Rohlf 1992)對小盾殼霉菌株和突變體AFLP標記進行群集分析。根據(jù)DNA擴增片段的不存在(0)或存在(1-3)，對每個菌株和/或突變體的間隔數(shù)據(jù)用Dist系數(shù)進行相似性距陣配對。根據(jù)依次、簇集、分級和嵌套群集方法進行相應的群集分析，并用不同群集間算術平均連鎖(linkage)的未加權對群方法(“UPGMA”)制做它們的遺傳相關性的分枝圖(Rohlf 1992)。結果和討論用合成的寡核苷酸引物在PCR擴增方法中篩選9個小盾殼霉菌株(四種野生型菌株和五種突變體)的AFLP標記。雖然大多數(shù)引物組合產(chǎn)生容易記錄的帶型，但僅有一部分擴增DNA片段是明顯獨特的并且是多態(tài)性的(表8和9)，這些片段用于DNA指紋分析。在此研究中，在測試的64種引物組合中，測得12種組合能提供信息，在瓊脂糖凝膠中檢測到多于160個DNA片段，僅選擇其中19個獨特且多態(tài)性的片段作為AFLP標記(表7)。在該研究中，PCR擴增片段的大小分級分離在用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠與銀染色的聚丙烯酰胺凝膠之間產(chǎn)生類似的DNA帶型(數(shù)據(jù)未給出)。雖然用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)生較低的分辨率，但可清楚地鑒別出多態(tài)性DNA片段。雖然銀染色的聚丙烯酰胺凝膠對100到600bp范圍的DNA片段具有更高的分辨率，但是難以檢測大于600bp的多態(tài)性片段。GeneScan對檢測不同樣品間DNA的多態(tài)性是很靈敏的，并且該計算機軟件也大大改進了數(shù)據(jù)分析和結果的顯示(表8和9)。
根據(jù)瓊脂糖凝膠中的DNA帶型，僅用PMseA和PBglCT引物組合鑒定在該研究中選擇的四個小盾殼霉菌株(表7和8)。例如，用A/CT 1和A/CT 2標記，將四個菌株首先分成2組(1)菌株2130和2134；(2)菌株2135和2137。由此出發(fā)，可進一步用A/CT 4或A/CT 5對菌株2130和2134進一步再分組和鑒定；菌株2135和2137可用A/CT 3或A/CT 4進一步再分組和鑒定。用其它AFLP引物組合區(qū)分這些小盾殼霉菌株也是可能的(表7)。
與四種小盾殼霉菌株相反，五種小盾殼霉突變體間的DNA多態(tài)性要小得多。在該研究中，在測試的64種引物組合中，在3種突變體M11-3、M11-3B2和A7-3D之間沒有觀察到DNA帶型的差異。然而，2種AFLP標記A/TA和G/CC產(chǎn)生可將A8-1和A10-4與其它三種突變體區(qū)分的多態(tài)性DNA片段(表7和9)。例如，用PMseA和PBglTA引物組合擴增出的低強度448bp DNA片段在突變體M11-3、M11-3B2和A7-3D中見到，而突變體A8-1中觀察到更高強度，在突變體A10-4中檢測到強得多的強度(表9)。
對9個小盾殼霉菌株和突變體的19個AFLP的標記的群集分析得到了與其推斷的系譜良好吻合的遺傳相關性分枝圖(圖)。在該分枝圖中沒有區(qū)分三種突變體(M11-3、M11-3B2和A7-3D)，因為在它們之間沒有檢測到AFLP多態(tài)性。菌株2134及其5個突變體群集于一個密組中，相異性指數(shù)(ID)小于0.50，表明它們之間有高水平的遺傳相關性。例如，菌株2134與三種連鎖突變體(M11-3、M11-3B2和A7-3D)群集在一起，其ID為0.23，A8-1與A10-4之間的ID僅為0.32。然而，四個菌株2130、2134、2135和2137具有大于0.56的ID，表明它們的基因型可能具有一定的多樣性。當所有的AFLP片段用于群集分析時，所有的9個小盾殼霉菌株都群集在一起，難以彼此區(qū)分，因此表明小盾殼霉菌株彼此間高度相關。
我們的結果表明，AFLP技術是鑒定小盾殼霉菌株和突變體的強有力的方法。在本研究中檢測到的AFLP標記是可靠的、可重復的，并且對于不同的小盾殼霉基因型是獨特的，因此很適于DNA指紋分析。由于所有的5個突變體都源自母本菌株2134，并且其基因型可能幾乎一致，在DNA水平上區(qū)分不同突變體較區(qū)分不同菌株更為困難。理論上，AFLP指紋分析技術可用不同的引物組合研究不同DNA之間的任何多態(tài)性。因此，如果更多的AFLP引物組合得到進一步檢測，則檢測不同突變體的獨特DNA指紋應該是可能的。表1.小盾殼霉野生型菌株2130、2134和2135以及突變菌株M11-3、M11-3B2、A7-3D、A8-1和A10-4的表型特征分析。菌株 生長a(cm) 菌落特征分析色素邊緣孢子2130 8.2橄欖綠 平滑有(ATCC 74417)2134 7.5黃棕色 平滑有(ATCC 74415)2135 8.3橄欖棕色平滑有(ATCC 74416)M11-3 7.4黃棕色 平滑有(ATCC 74418)M11-3B2 8.2橄欖黃棕色 平滑有A7-3D 6.5黃棕色 平滑有(ATCC 74419)A8-1 7.2黃白色 鋸齒狀 很少(ATCC 74436)A10-4 6.8黃白色 鋸齒狀 很少(ATCC 74435)a于室溫光照下在PDA上培養(yǎng)14天時三個平行真菌菌落的平均直徑。表2.在不同培養(yǎng)基上x液體培養(yǎng)時小盾殼霉菌株2134(ATCC74415)和突變菌株M11-3B2、A10-4(ATCC 74435)和A8-1(ATCC 74436)菌絲體干重z的比較
xPDB(土豆葡萄糖培養(yǎng)液)、PDB+I(土豆葡萄糖培養(yǎng)液+1％“誘導物”)或MCD+I(改良的Czapek-Dox+1％“誘導物”)。z二次平行實驗的平均菌絲體干重。表3.小盾殼霉突變體A10-4和A8-1的組成性細胞外大麥β-葡聚糖水解活性(內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性)。<
z培養(yǎng)于PDB中15天時2134(ATCC 74415)和突變菌株A10-4(ATCC 74435)和A8-1(ATCC74436)。培養(yǎng)物A、B和C代表培養(yǎng)于PDB上三次平行實驗結果。x酶活性用AZCL-β-葡聚糖作為底物以多孔擴散平板分析加以測定。a表示為每ml上清液中活性單位數(shù)的酶活性。表4.小盾殼霉母本菌株2134和突變體A8-1、A10-4和M113B2的細胞外纖維素水解活性(β-1，4-內切葡聚糖酶)的比較。
*小盾殼霉菌株培養(yǎng)于PDB、PDB+1％“誘導物”(PDB+I)或MCD+1％“誘導物”(MCD+I)培養(yǎng)液中。通過OBR-HEC分析方法測定PDB和PDB+I的纖維素水解活性，通過改良的還原糖分析測定MCD+I的纖維素水解活性。“誘導物”是由核盤菌菌核制成的富含β-葡聚糖的底物。a酶活性表示為每ml上清液中的活性單位數(shù)。表5.培養(yǎng)于MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中時小盾殼霉菌株2134、M11-3B2、A10-4和A8-1的β-葡聚糖酶活性z的比較。
z給出的酶活性為2次平行實驗的平均值。培養(yǎng)物上清液對下列底物的酶活性通過改良的還原糖分析加以測定a用于昆布多糖水解活性(內切-1，3-β-葡聚糖酶活性)的昆布多糖。b用于大麥β-葡聚糖酶活性(內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的大麥β-葡聚糖。c用于地衣多糖水解活性(內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的地衣多糖。d用于纖維素水解活性(內切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的纖維素。e表示為每ml上清液中活性單位數(shù)的酶活性。表5a.培養(yǎng)于MCD+1％“誘導物”培養(yǎng)液中時小盾殼霉菌株z2130、2132、2134、2135和2136對不同底物的β-葡聚糖酶活性y的比較。
y給出的酶活性為三次平行實驗的平均值(avg)及其標準差(std)代表由該培養(yǎng)物在培養(yǎng)的11天內達到的最大活性。酶活性表示為U/ml上清液，用改良的還原糖分析法測得。除了2134連續(xù)增加外，所有的培養(yǎng)物都在9天后到達其最大酶活性。z所有小盾殼霉菌株都為從加拿大大草原中收集的并保藏于Lethbridge研究中心模式培養(yǎng)物保藏中心的野生型菌株。a用于昆布多糖水解活性(內切-1，3-β-葡聚糖酶活性)的昆布多糖。b用于大麥β-葡聚糖水解活性(內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的大麥β-葡聚糖。c用于地衣多糖水解活性(內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的地衣多糖。d用于纖維素水解活性(內切-1，4-β-葡聚糖酶活性)的纖維素。表6.AFLP銜接子和引物z的DNA序列。BglII-銜接子5′CTC GTG GAC TGC GTA C 3′(SEQ ID NO1)3′CAC CTG ACG CAT GCT AG 5′(SEQ ID NO2)MseI-銜接子 5′GAC GAT GAG TCC TGA G 3′(SEQ ID NO3)3′TA CTC AGG ACT CAT 5′(SEQ ID NO4)BglII引物 5′GGA CTG CGT ACG ATC TNN 3′(SEQ ID NO5)MseI引物5′GAT GAG TCC TGA GTA AN 3′(SEQ ID NO6)z根據(jù)銜接子的序列設計并合成引物，引物3′末端的字母N為四種核苷酸A、C、G和T中的一種。表7.小盾殼霉菌株和突變體z的AFLP標記。
z小盾殼霉菌株2130、2134、2135和2137為野生型，菌株M11-3、M11-3B2、A7-D、A8-1和A10-4為源自母本菌株2134的突變體。AFLP標記根據(jù)瓊脂糖凝膠加以篩選和檢測，并通過所選的擴增DNA片段的不存在(0)和存在(1-3)對其計分(1＝較低強度的片段；2＝較高強度的片段；3＝強得多的強度的片段)。表8.小盾殼霉野生型(菌株2130、2134、2135和2137)用AFLP引物組合A/CT得到的DNA指紋。不同片段的分子大小獲自GeneScan圖形。
表9.小盾殼霉菌株(2134)及其突變體(A8-1和A10-4)用AFLP引物組合A/TA得到的DNA指紋。不同片段的分子大小獲自GeneScan圖形。
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在本說明書中提到的所有出版物均表明本發(fā)明涉及領域的技術水平。所有出版物在此列為參考，其參考程度等同于指明每篇單獨的出版物被具體地分別列為參考。
盡管為了清楚和理解的目的將前述的發(fā)明通過舉例說明和實施例的方式進行了較細致的描述，但應當明白在不偏離由下面的權利要求書所限定的本發(fā)明范圍或精神的情況下可作一些改變和修改。序列表<110>Huang，Hung C.
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Zantinge，Jennifer L.
Laroche，Andre J.<120>具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株<130>37015<140>US<141>1998-07-10<150>US 60/052，278<151>1997-07-11<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述BglII-AFLP銜接子<400>1ctcgtggact gcgtac16<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述BglII-AFLP反向銜接子<400>2gatcgtacgc agtccac 17<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述MseI-AFLP銜接子<400>3gacgatgagt cctgag16<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述MseI-AFLP反向銜接子<400>4tactcaggac tcat 14<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述BglII-AFLP引物<400>5ggactgcgta cgatctnn 18<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述MseI-AFLP引物<400>6gatgagtcct gagtaan 1權利要求
1.一種具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉(Coniothyriumminitans)菌株的生物學純培養(yǎng)物，其中所述的小盾殼霉菌株為a.具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉ATCC 74415或其突變體；b.具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉ATCC 74416或其突變體；c.具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉ATCC 74417或其突變體；d.具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉ATCC 74418或其突變體；e.具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉ATCC 74419或其突變體；f.具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉ATCC 74435或其突變體；或g.具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉ATCC 74436或其突變體。
2.一種制備具有β-葡聚糖酶活性的小盾殼霉菌株的方法，該方法包括以下步驟a.提供多個小盾殼霉74415細胞；b.將所述細胞暴露于紫外光輻射以誘變這些細胞；c.在培養(yǎng)基中或培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘變細胞以產(chǎn)生多個小盾殼霉培養(yǎng)物；d.檢測所述誘變細胞培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶活性；e.從步驟(d)中回收具有β-葡聚糖酶活性的培養(yǎng)物。
3.權利要求2所述的方法，其中步驟(d)包括檢測所述培養(yǎng)物的組成性β-葡聚糖酶活性，步驟(e)包括從步驟(d)中回收具有組成性β-葡聚糖酶活性的培養(yǎng)物。
4.權利要求3所述的方法，其中步驟(e)包括回收步驟(d)中具有至少10倍于步驟(a)中提供的小盾殼霉菌株組成性β-葡聚糖酶活性的培養(yǎng)物。
5.權利要求2所述的方法，其中步驟(d)包括檢測所述培養(yǎng)物大麥β-葡聚糖水解活性、地衣多糖水解活性、昆布多糖水解活性或纖維素水解活性中的至少一種活性，步驟(e)包括回收步驟(d)中具有大麥β-葡聚糖水解活性、地衣多糖水解活性、昆布多糖水解活性或纖維素水解活性的培養(yǎng)物。
6.權利要求2所述的方法，其中步驟(d)包括檢測所述培養(yǎng)物的內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶混合活性，步驟(e)包括回收步驟(d)中較步驟(a)中提供的小盾殼霉菌株具有更高的內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶活性的培養(yǎng)物。
7.權利要求6所述的方法，其中步驟(e)包括回收步驟(d)中較步驟(a)中提供的小盾殼霉菌株具有至少高25％的內切-1，3-和內切-1，4-β-葡聚糖酶活性的培養(yǎng)物。
8.權利要求2所述的方法，其中步驟(d)包括同時檢測每個誘變細胞培養(yǎng)物的β-葡聚糖酶活性。
9.權利要求2所述的方法，其中所述的步驟(c)中的培養(yǎng)基基本上不含可吸收的淀粉或糖類來源，并且含有可吸收的β-葡聚糖來源。
10.權利要求2所述的方法，其中所述的步驟(c)中的培養(yǎng)基包括可吸收的淀粉或糖類來源，并且基本上不含可吸收的β-葡聚糖來源。
全文摘要
制得了具有高水平β－葡聚糖酶活性的需氧真菌寄生性真菌小盾殼霉的菌株。優(yōu)選菌株已保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏中心,保藏號為74415、74416、74417、74418、74419、74435和74436。提供了誘變小盾殼霉74415和制備具有β－葡聚糖酶活性的菌株的方法。
文檔編號C12N9/42GK1272880SQ98807117
公開日2000年11月8日 申請日期1998年7月10日 優(yōu)先權日1997年7月11日
發(fā)明者黃鴻章, K·J·程, J·L·贊廷格, A·J·拉洛徹 申請人:加拿大農業(yè)及農業(yè)食品部