專利名稱：一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學領(lǐng)域，特別涉及基因工程領(lǐng)域。
目前常規(guī)生產(chǎn)基因工程藥用蛋白或其它有益蛋白的方法主要是通過細菌發(fā)酵，即把外源基因組裝到細菌基因上，然后培養(yǎng)細菌、收集菌體或外分泌物提取有益蛋白成分，這一方法有以下局限1)、細菌為原核生物，一些對人體有益的蛋白質(zhì)，其基因往往來源于高等動植物，這些基因在細菌中的表達往往具有低等生物的特征，如酰胺化，有的根本不能表達。
2)、細菌中本身蛋白質(zhì)種類繁多，其中大部分是不能被人體吸收利用或是有害的成分。
國外近十年來開始用植物病毒的基因組作為載體表達外源基因，這一方法是把外源基因組裝到植物病毒的基因組上，利用植物病毒的高拷貝快速復(fù)制來實現(xiàn)外源基因的高效表達。但此途徑因為破壞了植物病毒復(fù)制體系的完整性而只能實現(xiàn)瞬時高表達，即接種植物不能持續(xù)、系統(tǒng)地表達基因工程蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的目的在于提供一種以植物為生物反應(yīng)器，持續(xù)、高效地表達基因工程蛋白質(zhì)的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法，其特征在于它以黃瓜花葉病毒(CMV，下同)的衛(wèi)星RNA作為表達載體，通過構(gòu)建含外源基因的重組衛(wèi)星RNA，然后將含外源基因的重組衛(wèi)星RNA與CMV共同接種植物并表達外源基因，或共同接種植物細胞培養(yǎng)物，并在組織培養(yǎng)條件下表達外源基因；所述含外源基因的重組衛(wèi)星RNA是指含有一種外源基因的衛(wèi)星RNA序列，其外源基因的長度為30bp～1800bp，或含有以串聯(lián)方式連接的兩種或兩種以上外源基因的衛(wèi)星RNA序列，其外源基因的總長度為60bp～1800bp。
CMV是一種單鏈的RNA病毒，可接種侵染1000多種植物，如十字花科和茄科蔬菜以及多種藥用植物。CMV衛(wèi)星RNA是CMV基因組以外的一種遺傳因子，其本身不參與與CMV復(fù)制有關(guān)的功能而是在CMV的帶動下復(fù)制，其在寄主植物細胞中的拷貝數(shù)往往可達CMV基因組的數(shù)十倍或上百倍?；谝陨咸攸c，改變衛(wèi)星RNA的結(jié)構(gòu)不會破壞CMV復(fù)制體系的完整性因而CMV的衛(wèi)星RNA可以作為一種持續(xù)、高效表達基因工程蛋白質(zhì)的載體。本發(fā)明適用面廣，通過在衛(wèi)星RNA上裝載不同的目的基因并接種侵染不同植物，滿足生產(chǎn)不同的基因工程蛋白質(zhì)的要求，如具治療、保健、食用作用的蛋白質(zhì)，且基因工程蛋白質(zhì)的表達量大大高于已有表達系統(tǒng)。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。
本發(fā)明以黃瓜花葉病毒(CMV，下同)的衛(wèi)星RNA作為表達載體，通過構(gòu)建含外源基因的重組衛(wèi)星RNA，然后將含外源基因的重組衛(wèi)星RNA與CMV共同接種植物并表達外源基因，或共同接種植物細胞培養(yǎng)物，并在組織培養(yǎng)條件下表達外源基因；所述含外源基因的重組衛(wèi)星RNA是指含有一種外源基因的衛(wèi)星RNA序列，其外源基因的長度為30bp～1800bp，或含有以串聯(lián)方式連接的兩種或兩種以上外源基因的衛(wèi)星RNA序列，其外源基因的總長度為60bp～1800bp。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄載體是指用常用方法構(gòu)建的細菌質(zhì)粒其原理是在常用質(zhì)粒上，如PUC18、PUC19等，組裝CaMV(花椰菜花葉病毒)的35S啟動子和終止子序列，使得35S啟動子和終止子之間具有裝載外源DNA片段的酶切位點。這類載體如PCASS1、PCASS2、PD-35ST及其構(gòu)建方法為本領(lǐng)域內(nèi)常見(參考文獻如SHIBu-Jun等1997 J.Gen.Virology1181-1185)。
本發(fā)明所述的逆轉(zhuǎn)錄、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、用DNA合成儀人工全合成DNA的方法均為分子生物學中的常用方法，其參考文獻如下1、逆轉(zhuǎn)錄、PCR方法Avila-Rincon MJ，Collmer CW & JM Kaper 1986，Virology 152446-434.
錢世鈞、于穎、田開榮等1994，生物工程學報104734-382、PCR方法Rosenberg SM 1987，Meth.Enzymol3、cDNA合成方法Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F & Maniatis T 1989，Molecular cloningAlaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory.
4、體外轉(zhuǎn)錄方法Boyer J C and Haenni A L 1994，Virology 415-4265、轉(zhuǎn)錄載體構(gòu)建Ding S W，Rathjen J P，Li W X等于1995，J G Virology 76459-464基因參考文獻1.α-胸腺素基因Eschenfeldt W H，Manrow R E & Krug M S等，1989，J Biol Chem.264(13)7546-7555。
2.PF4基因(血小板因子IV)Poncz M，S Surrey，& P LaRocco等，1987，Blood 69219-223。
3.氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶Sakai R K，Gelfand，D H Stoffel等，1988，Science 2301350-1354。
4.熒光素酶deWet J R 1987，Mol.Cell Biol.7725。
5.胰島素原類似物Wetzel R等1981，Gene 1663-71。
實施例1分離CMV中的衛(wèi)星RNA，以衛(wèi)星RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR方法克隆衛(wèi)星RNA的全長cDNA，在cDNA的96-183位堿基之間插入α-胸腺素基因(87bp，29個氨基酸)，獲得全長367bp的重組衛(wèi)星DNA，其兩端包含Stul和EcoRl兩個酶切位點再將重組衛(wèi)星DNA組裝到PCASS2質(zhì)粒的35S啟動子的下游從而獲得含重組衛(wèi)星DNA的PCASS2質(zhì)粒，將含重組衛(wèi)星DNA的PCASS2質(zhì)粒和不含衛(wèi)星RNA的CMV共同接種煙草，在CMV的存在下轉(zhuǎn)錄獲得具有含α-胸腺素基因的重組衛(wèi)星RNA，用具有含α-胸腺素基因的重組衛(wèi)星RNA的CMV擴大接種感染煙草，根據(jù)植株癥狀表現(xiàn)判斷，陽性株率95％以上，7～20天后收集煙草葉片，提取、純化α-胸腺素，α-胸腺素的產(chǎn)率為5～23mg/100g新鮮煙葉。
實施例2以衛(wèi)星RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR方法克隆衛(wèi)星RNA的全長cDNA，在cDNA的96-183位堿基之間以替換方式插入串聯(lián)的α-胸腺素基因和PF4基因(血小板因子IV，219bp，71個氨基酸)，獲得全長為536bp的重組衛(wèi)星DNA，再將重組衛(wèi)星DNA組裝到PCASS2質(zhì)粒的35S啟動子的下游從而獲得含重組衛(wèi)星DNA的PCASS2質(zhì)粒，含重組衛(wèi)星DNA的PCASS2質(zhì)粒和CMV共同接種煙草，在CMV的存在下轉(zhuǎn)錄獲得具有含α-胸腺素基因和PF4基因的重組衛(wèi)星RNA，用具有含α-胸腺素基因和PF4基因的重組衛(wèi)星RNA的CMV擴大接種煙草，根據(jù)植株癥狀表現(xiàn)判斷，陽性株率95％以上7～20天后收集煙草葉片，提取、純化α-胸腺素和血小板因子IV，目的蛋白質(zhì)的總產(chǎn)率為2～10mg/100g新鮮煙葉。
實施例3根據(jù)CMV衛(wèi)星RNA的兩端序列和PF4基因的兩端序列設(shè)計并用DNA合成儀合成PCR引物PCR引物中包括酶切位點、衛(wèi)星RNA的cDNA的兩端序列和PF4基因的兩端序列，用PCR方法進行PCR擴增并將PCR產(chǎn)物組裝到PCASS2轉(zhuǎn)錄載體的35S啟動子和35S終止子之間，構(gòu)成含重組衛(wèi)星DNA的PCASS2質(zhì)粒，再與不含衛(wèi)星RNA的CMV共同接種煙草，在CMV的存在下轉(zhuǎn)錄獲得具有含PF4基因的重組衛(wèi)星RNA，用具有含PF4基因的重組衛(wèi)星RNA的CMV通過磨擦接種番茄幼苗，10～20天后用CMV、PF4雙抗檢測接種番茄株，陽性株率60～85％。
實施例4根據(jù)CMV中的衛(wèi)星RNA的cDNA的5’端96個堿基、α-胸腺素基因的序列和3’端184個堿基的序列，用DNA合成儀人工全合成一個367個堿基的DNA序列并在其兩端分別加上Stul和EcoRl兩個酶切位點的序列，從而獲得重組衛(wèi)星DNA；再將重組衛(wèi)星DNA組裝到PCASS2質(zhì)粒的35S啟動子的下游從而獲得含重組衛(wèi)星DNA的PCASS2質(zhì)粒，含重組衛(wèi)星DNA的PCASS2質(zhì)粒和CMV共同接種煙草，在CMV的存在下轉(zhuǎn)錄獲得具有含α-胸腺素基因的重組衛(wèi)星RNA，用具有含α-胸腺素基因的重組衛(wèi)星RNA的CMV通過磨擦接種接種感染煙草，根據(jù)植株癥狀表現(xiàn)判斷，陽性株率95％以上，7～20天后收集煙草葉片，提取、純化α-胸腺素，α-胸腺素的產(chǎn)率為5～23mg/100g新鮮煙葉。
實施例5根據(jù)CMV中的衛(wèi)星RNA的cDNA的5’端96個堿基、α-胸腺素基因的序列和3’端184個堿基的序列，用DNA合成儀人工全合成一個367個堿基DNA序列并組裝到RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒中外源DNA載體的T7啟動子的下游，通過用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄，獲得重組衛(wèi)星RNA，再與CMV共同接種無病毒半夏幼苗，獲得被具有含α-胸腺素基因的重組衛(wèi)星RNA的CMV侵染的半夏，用組織培養(yǎng)方法大量無性繁殖半夏植株，α-胸腺素基因在半夏植株中的表達量為0.01～0.29mg/100g鮮半夏。
實施例6用實施例3的方法獲得PCR產(chǎn)物并組裝到RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒中外源DNA載體的T7啟動子的下游，通過用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄獲得具有含PF4基因的重組衛(wèi)星RNA，再與CMV共同接種大白菜的原生質(zhì)體，獲得被具有含PF4基因的重組衛(wèi)星RNA的CMV侵染的愈傷組織，檢測愈傷組織中CMV外殼蛋白和PF4，陽性率25～40％，以帶有以上兩種蛋白質(zhì)的組織繼續(xù)擴大培養(yǎng)，在細胞培養(yǎng)水平上獲得PF4因子的高效表達。
實施例7利用實施例1的方法獲得含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(656bp)的重組衛(wèi)星DNA，并組裝到RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒中外源DNA載體的SP6啟動子的下游，通過用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄獲得含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的重組衛(wèi)星RNA，后者與CMV共同接種煙草幼苗，獲得具有含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的重組衛(wèi)星RNA的CMV侵染的煙草，用顯癥煙草的葉汁液再接種3～7葉期的煙草幼苗，2-4天后在所有接種植株上均檢測到氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。
實施例8以衛(wèi)星RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR方法克隆衛(wèi)星RNA的全長cDNA，在cDNA的96-183位堿基之間用替換方式插入熒光素酶基因(1649bp)獲得全長為1912bp的重組衛(wèi)星DNA，再將重組衛(wèi)星DNA組裝到PCASS2質(zhì)粒的35S啟動子的下游從而獲得含重組衛(wèi)星DNA的PCASS2質(zhì)粒，以含重組衛(wèi)星DNA的PCASS2質(zhì)粒和不含衛(wèi)星RNA的CMV共同接種煙草，在CMV的存在下轉(zhuǎn)錄獲得具有含熒光素酶基因的重組衛(wèi)星RNA，用具有含熒光素酶基因的重組衛(wèi)星RNA的CMV擴大接種感染煙草，根據(jù)植株中熒光素活性判斷，陽性株率55％以上。
實施例9根據(jù)CMV中的衛(wèi)星RNA的cDNA的5’端116個堿基、胰島素原類似物基因(其DNA長度為30bp、氨基酸序列為Arg-Arg-Gly-Ser-Arg-Lys)的序列和3’端218個堿基的序列，用DNA合成儀人工全合成一個364個堿基的重組衛(wèi)星DNA；并組裝到RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒中外源DNA載體的SP6啟動子的下游，通過用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄獲得含胰島素原類似物基因的重組衛(wèi)星RNA，后者與不含衛(wèi)星RNA的CMV共同接種無病毒馬鈴薯幼苗，并在80％以上的馬鈴薯薯塊中檢測到胰島素原類似物。
權(quán)利要求
1.一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法，其特征在于它以黃瓜花葉病毒(CMV，下同)的衛(wèi)星RNA作為表達載體，通過構(gòu)建含外源基因的重組衛(wèi)星RNA，然后將含外源基因的重組衛(wèi)星RNA與CMV共同接種植物并表達外源基因，或共同接種植物細胞培養(yǎng)物，并在組織培養(yǎng)條件下表達外源基因；所述含外源基因的重組衛(wèi)星RNA是指含有一種外源基因的衛(wèi)星RNA序列，其外源基因的長度為30bp～1800bp，或含有以串聯(lián)方式連接的兩種或兩種以上外源基因的衛(wèi)星RNA序列，其外源基因的總長度為60bp～1800bp。
2.如權(quán)利要求1所述的一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法，其特征在于所述的含外源基因的重組衛(wèi)星RNA的構(gòu)建。是指以衛(wèi)星RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR獲得其cDNA，在cDNA上以替換或插入的方式組裝外源基因，獲得重組衛(wèi)星DNA，并將重組衛(wèi)星DNA組裝到轉(zhuǎn)錄載體上然后在CMV的存在下轉(zhuǎn)錄，或?qū)⒅亟M衛(wèi)星DNA進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得具有含外源基因的重組衛(wèi)星RNA。
3.如權(quán)利要求1所述的一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法，其特征在于所述的含外源基因的重組衛(wèi)星RNA的構(gòu)建是指通過根據(jù)衛(wèi)星RNA的序列，用DNA合成儀人工合成包含衛(wèi)星RNA兩端序列的PCR引物，然后用PCR方法克隆外源基因獲得重組衛(wèi)星DNA，并將其組裝到轉(zhuǎn)錄載體上然后在CMV的存在下轉(zhuǎn)錄，或?qū)⒅亟M衛(wèi)星DNA進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得具有含外源基因的重組衛(wèi)星RNA。
4.如權(quán)利要求1所述的一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法，其特征在于所述的含外源基因的重組衛(wèi)星RNA的構(gòu)建是指通過根據(jù)衛(wèi)星RNA兩端序列和外源基因的序列，用DNA合成儀人工全合成重組衛(wèi)星DNA，并將重組衛(wèi)星DNA組裝到轉(zhuǎn)錄載體上然后在CMV的存在下轉(zhuǎn)錄，或?qū)⒅亟M衛(wèi)星DNA進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得具有含外源基因的重組衛(wèi)星RNA。
5.如權(quán)利要求1所述的一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法，其特征在于所述的外源基因的長度的優(yōu)選范圍為30bp～300bp。
6.如權(quán)利要求1所述的一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法，其特征在于所述的外源基因的長度的最優(yōu)范圍為50bp～150bp。
7.如權(quán)利要求1所述的一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法，所述的CMV可以含有衛(wèi)星RNA或不含衛(wèi)星RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以植物為生物反應(yīng)器表達外源基因的方法,它以黃瓜花葉病毒(CMV)的衛(wèi)星RNA作為表達載體,通過構(gòu)建含外源基因的重組衛(wèi)星RNA,接種植物并表達外源基因,或接種植物細胞培養(yǎng)物并在組織培養(yǎng)條件下表達外源基因。本發(fā)明不會破壞CMV復(fù)制體系的完整性,通過在衛(wèi)星RNA上裝載不同的目的基因并接種侵染不同植物,可持續(xù)高效表達不同的基因工程蛋白質(zhì),其表達量大大高于已有表達系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/83GK1247231SQ9811892
公開日2000年3月15日 申請日期1998年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月8日
發(fā)明者陳集雙, 張耀洲, 馮明光, 柴立紅 申請人:陳集雙