專(zhuān)利名稱(chēng)：克隆、表達(dá)及測(cè)序一體化載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)，更具體地涉及一種新的克隆、表達(dá)及測(cè)序一體化的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及該新型表達(dá)載體的構(gòu)建方法和用途。
目前，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核基因仍然是大量獲得真核基因產(chǎn)物的主要方法。作為最早和最廣泛使用的表達(dá)系統(tǒng)之一，原核表達(dá)系統(tǒng)中的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)到目前為止仍然是表達(dá)蛋白質(zhì)的基本系統(tǒng)。盡管經(jīng)過(guò)了近四十年的研究，并在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究和基因工程生產(chǎn)等方面都取得了令人矚目的成就，但是目前尚無(wú)一個(gè)完善的系統(tǒng)能保證所有外源基因的高表達(dá)。另一方面，由于表達(dá)載體的特殊要求，因此不具備克隆載體的通用性，目前也無(wú)一載體能利用商品化的序列測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。這些都是目前所用表達(dá)系統(tǒng)的主要缺陷。
為了在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)外源基因，一般必然涉及克隆、測(cè)序和表達(dá)等步驟。其中克隆外源基因已廣泛采用PCR技術(shù)，因而較為方便。但是克隆和表達(dá)一個(gè)已知外源基因仍很麻煩，至少需要兩次克隆(1)要用克隆載體來(lái)克隆PCR擴(kuò)增出的基因片段，并在克隆載體中鑒定基因序列；(2)再將基因片段克隆至表達(dá)載體中，以便進(jìn)行表達(dá)。這一過(guò)程不僅導(dǎo)致基因在多次克隆中出現(xiàn)錯(cuò)誤的幾率上升，而且在A(yíng)UG前必須有一個(gè)酶切位點(diǎn)以便于插入表達(dá)基因，并且使得Shine-Dalgarno(SD)序列與AUG之間的序列被固定，從而不利于各種基因的表達(dá)。
因此，本領(lǐng)域中一直需要一種能在同一載體上進(jìn)行克隆、測(cè)序和表達(dá)的載體。
本發(fā)明的目的之一就是提供一種克隆、表達(dá)、測(cè)序一體化的載體，從而減少克隆次數(shù)并簡(jiǎn)化克隆操作過(guò)程。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的克隆、測(cè)序和表達(dá)外源基因的方法，從而減少克隆次數(shù)并簡(jiǎn)化克隆操作過(guò)程。
本發(fā)明的還涉及一體化載體的用途，它被用于克隆、測(cè)序和表達(dá)外源基因，從而可減少克隆次數(shù)并簡(jiǎn)化克隆操作過(guò)程。
本發(fā)明的一體化載體依次含有以下元件(1)控制外源基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，(2)反向測(cè)序引物序列，(3)核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列(RBS序列)和SD序列，(4)緊跟于SD序列下游的多克隆位點(diǎn)，(5)正向測(cè)序引物序列，其中元件(3)和(5)的位置可互換，(6)控制外源基因終止的終止子，其中，多克隆位點(diǎn)含有平末端類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，而且SD-AUG間隔為5-8個(gè)核苷酸。
使用本發(fā)明的克隆、表達(dá)、測(cè)序一體化的載體，可使外源基因表達(dá)的全過(guò)程在一個(gè)載體上即能完成。在一個(gè)較佳例子中，本發(fā)明的一體化表達(dá)載體還可靈活改變從SD到AUG間的序列，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)翻譯起始序列的自由設(shè)計(jì)。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一體化載體應(yīng)含有啟動(dòng)子，尤其是強(qiáng)啟動(dòng)子如pL啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子等。為了便于分離產(chǎn)物，較佳地可以選用熱敏型的啟動(dòng)子。這類(lèi)熱敏型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，它們通常在常溫(30℃左右，如32℃)時(shí)是不起作用的，但是當(dāng)溫度升高(如約40℃)時(shí)就發(fā)揮啟動(dòng)子的作用。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中選用了熱敏型的強(qiáng)啟動(dòng)子pL啟動(dòng)子(參見(jiàn)Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989))。為了配合該pL啟動(dòng)子的使用，同時(shí)使用了其抑制基因CI857-2H(參見(jiàn)《分子克隆》；以及陳南春，高輝，陳蘇民等。“cI857基因的體外定位同義突變”，生物化學(xué)雜志，1994，10509-512)。
當(dāng)然，也可以使用化學(xué)誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。當(dāng)培養(yǎng)基中加入有關(guān)的誘導(dǎo)物時(shí)，這類(lèi)啟動(dòng)子就發(fā)揮其誘導(dǎo)作用，如lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子等。
為了具有測(cè)序的功能，本發(fā)明的一體化載體還含有測(cè)序引物序列。許多測(cè)序載體中的測(cè)序引物序列都可選擇用于本發(fā)明。在一體化載體中，測(cè)序引物序列的位置是在多克隆位點(diǎn)的上游或下游附近，而且較佳地可在載體中同時(shí)含有正向和反向的測(cè)序引物序列。
一些已知的通用測(cè)序引物序列也可以用于本發(fā)明，其中包括例如pUC/M13引物序列、SP6/T7T3引物序列、pBR322引物序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，使用的是M13mp18的通用測(cè)序引物序列。更佳地，在多克隆位點(diǎn)上游具有M13mp18的反向測(cè)序引物序列(#1201)，在多克隆位點(diǎn)下游具有M13mp18的通用正向測(cè)序引物序列(#1211)。
此外，正向測(cè)序引物序列和反向測(cè)序引物序列的位置也可互換。較佳地，反向測(cè)序引物序列宜在多克隆位點(diǎn)的上游。
在本發(fā)明中，在多克隆位點(diǎn)上游和測(cè)序引物序列之間有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)序列，一般核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列含有SD序列(AAGGAG)。許多已知的核糖體結(jié)合位點(diǎn)都可用于本發(fā)明，較佳地該核糖體結(jié)合位點(diǎn)衍生自噬菌體。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，選用的是T7噬菌體基因10的RBS序列。研究表明，T7噬菌體基因10的RBS序列具有翻譯增強(qiáng)活性(Olins PO，Devine CS，Rangwala SH，etal.The T7 phage gene 10 leader RNA，a ribosome-binding site thatdramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli.Gene 1988；73227-235；Olins PO和Rangwala SH.A novel sequence element derived frombacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene inEscherichia coli.J Biol Chem 1989；26416973-16976；Olins PO和Rangwala SH.Vector for enhanced translation of foreign genes in Escherichia coli.Methods Enzymol1990；185115-119)，人們稱(chēng)之原核翻譯增強(qiáng)子Epsilon(enhancer of proteinsynthesis initiation)，該RBS序列包含了AAGGAG(SD序列)。使用該RBS序列時(shí)，可進(jìn)一步提高翻譯表達(dá)量。
緊跟著RBS序列下游的是多克隆位點(diǎn)。換言之，在SD序列下游是多克隆位點(diǎn)。雖然已有技術(shù)中已有許多種類(lèi)的多克隆位點(diǎn)，但是為了構(gòu)建出一體化的載體，需要對(duì)多克隆位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和位置進(jìn)行優(yōu)化。即該多克隆位點(diǎn)宜含有平末端類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，而且SD-AUG間隔為5-8個(gè)核苷酸。
如上所述，常規(guī)的利用PCR技術(shù)克隆和表達(dá)外源基因的過(guò)程存在兩個(gè)主要問(wèn)題第一是要進(jìn)行再次克隆，從而無(wú)法保證第二次克隆完全正確；第二是在A(yíng)UG前必須有一個(gè)酶切位點(diǎn)以便于插入表達(dá)基因，這導(dǎo)致問(wèn)題是AUG前的序列很難控制，而使得SD與ATG之間的序列被固定，因而不利于基因的表達(dá)。
研究表明，SD-AUG間隔以及AUG上下游序列對(duì)基因表達(dá)的水平有極大的影響，其差別可達(dá)2000倍(Gold L.＂Postranscriptional regulatory mechanisms inEscherichia coli.＂Ann Rev Bilchem.198857199-233)。當(dāng)SD序列固定時(shí)，SD-AUG間隔一般為5-13bp，Ringquist等人(Ringquist S，Shinedling S和Barrick D.等人.＂Translation initiation in Escherichia colisequences within the ribosome-binding site＂.Mol Microbiol 1992；61219-1229)和Min KT等人(Min KT，Kim MH和Lee DS.“Search for the optimal sequence of the ribosome binding site by randomoligonucleotide-directed mutagenesis”.Nucleic Acids Res 1988；165075-5088)的實(shí)驗(yàn)表明，SD-AUG間隔以5bp為最佳。關(guān)于SD-AUG間隔區(qū)組成的一些研究結(jié)果還可有de Boer HA和Hui AS.＂Sequences within ribosome binding site affectingmessenger RNA translatability and method to direct ribosomes to single messengerRNA species＂，Methods Enzymol 1990；185103-114。
其次，AUG前的三個(gè)核苷酸以UAU、CUU組合為最佳，一定要避免AGG、UUC、UCA(Min KT，Kim MH和Lee DS.“Search for the optimalsequence of the ribosome binding site by random oligonucleotide-directedmutagenesis”.Nucleic Acids Res 1988；165075-5088)?？紤]最佳組合序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，AUG前根本就沒(méi)有一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列能滿(mǎn)足要求。常用的EcoRI位點(diǎn)正是應(yīng)當(dāng)避免的序列，因?yàn)樗贏(yíng)UG前的三個(gè)核苷酸正好是UUC。
為了提高表達(dá)效率，在多克隆位點(diǎn)中宜含有平末端類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，如SspI、Bst1107I、HpaI、DraI和EcoRV位點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)較佳例子中，在SD序列后緊跟著的是EcoRV位點(diǎn)。這使人們可以方便地利用該酶的平末端特性，從而在設(shè)計(jì)表達(dá)外源基因時(shí)AUG前的序列具有極大的靈活性。
在另一優(yōu)選例子中，采用5-8個(gè)核苷酸的SD-AUG間隔，并且AUG前的三個(gè)核苷酸均由A和U組成，從而進(jìn)一步提高表達(dá)效率。
本發(fā)明的一體化載體還含有終止序列。在本領(lǐng)域中已知眾多終止序列元件幾乎都可用于本發(fā)明。較佳地是原核生物的終止序列。在本發(fā)明的一個(gè)例子中選用了rrnBT1T2片段，該片段是強(qiáng)終止序列，而且還有穩(wěn)定作用。
至于復(fù)制起點(diǎn)ori和抗性基因等元件，沒(méi)有任何特別限制。比如，抗性篩選基因可選用四環(huán)素抗性基因、新霉素抗性基因、或氨芐青霉素抗性基因。


圖1是載體pJL6的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本發(fā)明的一種一體化載體pLCM182的構(gòu)建示意圖。
圖3是本發(fā)明一種一體化載體pLCM182中克隆-表達(dá)-測(cè)序元件的局部序列圖。
圖4是用本發(fā)明的一體化載體pLCM182表達(dá)表達(dá)hIL-4、hIL-17和hIL-1RA的電泳圖。其中從左至右依次為泳道1，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2，hIL-1RA；泳道3，hIL-4；泳道4，hIL-17；泳道5，pLCM182空白載體對(duì)照。
圖5是pJT6的序列表圖。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)地闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些具體實(shí)施例用于說(shuō)明目的而并非用于限制本發(fā)明范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作的條件進(jìn)行，如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或者按照制造廠(chǎng)商所建議的條件進(jìn)行。
實(shí)施例1克隆、表達(dá)、測(cè)序一體化載體的構(gòu)建A.材料主要菌株與載體大腸桿菌DH5α購(gòu)自Gibco；去除了兩個(gè)HindIII位點(diǎn)的cI857基因(cI857-2H)(陳南春，高輝，陳蘇民等?！癱I857基因的體外定位同義突變”，生物化學(xué)雜志，1994，10509-512)和pJL6(結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1，詳細(xì)序列可參見(jiàn)圖5)從第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室獲得；pKK233-2和pUC18購(gòu)自Pharmacia公司。
主要實(shí)驗(yàn)試劑及材料各種工具酶購(gòu)自Promega公司。T7 DNA測(cè)序試劑盒購(gòu)自Pharmacia公司。全自動(dòng)熒光測(cè)序試劑盒Big Dye購(gòu)自PE公司。
人工合成DNA片段由Cybersyn公司合成，包括如下片段T7噬菌體基因10的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site，RBS)序列(OlinsPO，Devine CS，Rangwala SH，等人，“The T7 phage gene 10 leader RNA，aribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes inEscherichia coli.”Gene 1988；73227-235)上鏈5’-AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATCG-3′；下鏈5’-GATCCGATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAA-3′；兩片段經(jīng)退火后形成雙鏈，5’為EcoRI粘端，3’為BamHI粘端，中間含EcoRV位點(diǎn)。
載體構(gòu)建及序列測(cè)定請(qǐng)參見(jiàn)圖2的構(gòu)建步驟流程。基本步驟如下首先將合成的DNA片段退火后插入pUC18載體的EcoRI、BamHI位點(diǎn)之間，然后以M13mp18的正反測(cè)序引物(來(lái)自T7 DNA測(cè)序試劑盒，Pharmacia)擴(kuò)增出該段序列以備后用。同時(shí)，將pKK233-2的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列rrnBT1T2(SspI-HindIII)插入pUC18的SspI-HindIII之間，取代LacZ序列；其次，將pJL6的pL啟動(dòng)子序列(EcoRI-BamHI)插入前一載體的EcoRI-BamHI之間；再將cI857-2H(BglII-KpnI)插入前一載體的EcoRI-PvuII之間；最后，將正反測(cè)序引物擴(kuò)增出的片段(含T7噬菌體基因10的核糖體結(jié)合序列[RBS]、多克隆位點(diǎn)及兩端的測(cè)序引物)插入前一載體的BstXI-HindIII之間。構(gòu)建全過(guò)程步驟均經(jīng)酶切鑒定以確定無(wú)誤。將構(gòu)建的載體命名為pLCM182。利用ABI 377全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定pLCM182的序列，以M13mp18的正反向測(cè)序引物雙向測(cè)序。
所構(gòu)建的載體pLCM182如圖2所示，序列測(cè)定與預(yù)期結(jié)果一致。其中克隆、表達(dá)、測(cè)序元件的局部序列如圖3所示。
10 20 3040 50 60 70AGGAAACAGC TATGACCATG ATTACGAATT TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATCGGATC CTCTAGAGTC80 90 100110GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGGCACTGGC CGTCGTTTTA CAGCTT在這種一體化載體的克隆、表達(dá)、測(cè)序元件局部序列中，第5-20堿基為M13mp18的反向測(cè)序引物(#1201)；第27-50堿基為T(mén)7噬菌體基因10的RBS序列，其中AAGGAG是SD序列；第50-91堿基為多克隆位點(diǎn)，其中包含EcoRV(該位點(diǎn)緊接SD序列)、BamHI、XbaI、SalI、PstI、SphI、HindIII；第95-111堿基為M13mp18的通用測(cè)序引物(#1211)。
構(gòu)建出的載體pLCM182中，以強(qiáng)啟動(dòng)子pL及終止子rrnBT1T2控制外源基因轉(zhuǎn)錄及終止。在SD序列上游含M13mp18的反向測(cè)序引物(#1201)序列；SD序列下游緊跟多克隆位點(diǎn)及M13mp18的通用測(cè)序引物(#1211)序列。外源基因插入該載體后，可直接誘導(dǎo)表達(dá)，有表達(dá)還可直接利用通用測(cè)序引物測(cè)序，所測(cè)定的序列直接反應(yīng)了表達(dá)載體上的實(shí)際序列，避免了從克隆載體到表達(dá)載體的克隆過(guò)程中所產(chǎn)生的錯(cuò)誤，從而極大限度地保證了表達(dá)基因的正確性。此外，對(duì)多克隆位點(diǎn)進(jìn)行的改造，可以適應(yīng)多種形式的表達(dá)需要。
實(shí)施例2用一體化載體進(jìn)行基因的克隆、測(cè)序和表達(dá)由Cybersyn公司合成以下人工DNA片段，作為引物人IL-4 PCR引物序列為上游5’-ATAATGCACAAGTGCGATATCACCTTA-3′；下游5’-TTGGATCCTCAGCTCGAACACTTTGAATA-3′；人IL-17 PCR引物序列為上游5’-AATATGATAGTGAAGGCAGGAATCAC-3′；下游5’-AAGGATCCTTAGGCCACATGGTGGACAA-3′；人IL-1RA PCR引物序列為上游5’-TATATGCGACCCTCTGGGAGAAAATC-3′；下游5’-AAGGATCCTTACTCGTCCTCCTGGAAGT-3′。
將用PHA刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，作為人白細(xì)胞介素-4(hIL-4)和人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(hIL-1RA)基因的來(lái)源。將原代培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，作為人白細(xì)胞介素-17基因(hIL-17)的來(lái)源。
利用PCR技術(shù)從相應(yīng)模板中擴(kuò)增出hIL-4、hIL-17和hIL-1RA基因，將上述三種基因分別插入pLCM182的EcoRV-BamHI位點(diǎn)之間。此外，在克隆后的載體中，SD-AUG之間的間距分別為5、6、8個(gè)核苷酸。鑒定所得的陽(yáng)性克隆直接作熱誘導(dǎo)表達(dá)。
其中熱誘導(dǎo)表達(dá)方法如下將振搖過(guò)夜的大腸桿菌以1％接種至培養(yǎng)基中，在32℃振搖，約2-3小時(shí)后，待其恰巧進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期時(shí)，立即轉(zhuǎn)入42℃繼續(xù)培養(yǎng)，在4-5小時(shí)后收獲細(xì)菌，測(cè)定其中的表達(dá)產(chǎn)物。
表達(dá)結(jié)果如圖4所示，從左至右分別為1，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，hIL-1RA；3，hIL-4；4，hIL-17；5，pLCM182空白載體對(duì)照。其中hIL-4、hIL-17以及IL-1RA的表達(dá)量經(jīng)條帶灰度掃描分析均高于25％。
高表達(dá)的基因表達(dá)克隆可利用測(cè)序引物直接進(jìn)行測(cè)序。上述基因直接在表達(dá)載體上利用通用測(cè)序引物測(cè)序，序列結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
如上所述，本發(fā)明一體化載體的優(yōu)點(diǎn)是，所有被克隆的基因均由PCR得到，并在同一載體上進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果均正確；而且各基因克隆的表達(dá)量均高于報(bào)道水平。因此該載體的構(gòu)建在實(shí)際工作中極大地方便了基因的克隆、測(cè)序及表達(dá)。
盡管本發(fā)明是根據(jù)最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，但是應(yīng)理解本領(lǐng)域一般技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明的講授內(nèi)容后，可以進(jìn)行各種變動(dòng)和修飾，這些都落于本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種載體，其特征在于，它包括以下元件(1)控制外源基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，(2)反向測(cè)序引物序列，(3)RBS序列和SD序列，(4)緊跟于SD序列下游的多克隆位點(diǎn)，(5)正向測(cè)序引物序列，其中元件(3)和(5)的位置可互換，(6)控制外源基因終止的終止子，其中，多克隆位點(diǎn)含有平末端類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，而且SD-AUG間隔為5-8個(gè)核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，其中啟動(dòng)子是pL啟動(dòng)子，而且該載體還含有CI857-2H基因。
3.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，反向測(cè)序引物序列是M13mp18的反向測(cè)序引物序列#1201，而正向測(cè)序引物是M13mp18的正向測(cè)序引物序列#1211。
4.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，RBS序列是T7噬菌體基因10的RBS序列；而且，該終止子是rrnBT1T2片段、
5.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，該多克隆位點(diǎn)含有EcoRV位點(diǎn)，SD-AUG間隔為5個(gè)核苷酸，并且AUG前的三個(gè)核苷酸均由A和U組成。
6.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，啟動(dòng)子是pL啟動(dòng)子，而且該載體還含有CI857-2H基因；反向測(cè)序引物序列是M13mp18的反向測(cè)序引物序列#1201，而正向測(cè)序引物是M13mp18的正向測(cè)序引物序列#1211；RBS序列是T7噬菌體基因10的RBS序列；終止子是rrnBT1T2片段；該多克隆位點(diǎn)含有EcoRV位點(diǎn)，SD-AUG間隔為5個(gè)核苷酸，并且AUG前的三個(gè)核苷酸均由A和U組成。
7.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，該載體是pLCM182。
8.一種克隆、測(cè)序和表達(dá)外源基因的方法，其特征在于，它使用權(quán)利要求1所述的載體。
9.如權(quán)利要求1所述載體的用途，其特征在于，它被用于克隆、測(cè)序和/或表達(dá)外源基因。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，該載體是pLCM182。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種一體化載體,它含有元件:(1)控制外源基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子,(2)反向測(cè)序引物序列,(3)RBS序列和SD序列,(4)緊跟于SD序列下游的多克隆位點(diǎn),(5)正向測(cè)序引物序列,(6)控制外源基因終止的終止子,其中,多克隆位點(diǎn)含有平末端類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn),而且SD－AUG間隔為5—8個(gè)核苷酸。可在同一載體上進(jìn)行外源基因的克隆、測(cè)序和表達(dá),從而大大方便了基因克隆、測(cè)序及表達(dá)工作。本發(fā)明還涉及該新載體的用途。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1242427SQ9811633
公開(kāi)日2000年1月26日 申請(qǐng)日期1998年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月17日
發(fā)明者曹雪濤, 趙忠良, 黃欣 申請(qǐng)人:上海華晨生物技術(shù)研究所