專利名稱：水合乙醛酸/氨甲基膦酸二烷基酯混合物的制備方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在氨甲基膦酸二烷基酯以及催化劑—甘醇酸酯氧化酶((S)-2-羥基酸氧化酶，EC 1.1.3.15)和過氧化氫酶(EC1.11.1.6)的存在下，在水溶液中，用羥基乙酸和氧起反應制備水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯混合物的方法。用該方法得到的水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯混合物是可用于制備N-(膦?；谆?甘氨酸的中間產(chǎn)物，而N-(膦酰基甲基)甘氨酸是一種廣譜的出苗后(post-emergent)的植物毒劑和除莠劑，可用于控制大量植物的生長。
相關(guān)技術(shù)的說明甘醇酸酯氧化酶廣泛存在于綠葉植物和哺乳動物細胞中，催化羥基乙酸氧化為水合乙醛酸的反應，同時產(chǎn)生過氧化氫
N.E.Tolbert等在J.Biol.Chem.，Vol.181，905-914(1949)中首次報道了從煙葉中提取的一種酶，該酶可催化羥基乙酸的氧化，經(jīng)形成水合乙醛酸中間物，最后生成甲酸和CO2.加入某些化合物例如1，2-乙二胺，可以限制中間產(chǎn)物水合乙醛酸被進一步氧化。氧化在pH約為8的條件下進行，所用羥基乙酸的濃度通常為約3-40mM(毫摩爾濃度)。甘醇酸酯氧化酶的最適pH據(jù)報道為8.9。據(jù)報道，草酸(100mM)能抑制甘醇酸酯氧化酶的催化作用.類似的，K.E.Richardson和N.E.Tolbert在J.Biol.Chem.，Vol.236，1280-1284(1961)中表明，在甘醇酸酯氧化酶催化的羥基乙酸的氧化過程中，含三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)的緩沖液可抑制草酸的形成。C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris在J.Biol.Chem.，Vol.178，977-987(1949)中，報道了甘醇酸酯氧化酶催化的羥基乙酸和氧的氧化反應的最適pH為約7.8-8.6，最適溫度為35-40℃。
I.Zelitch和S.Ochoa在J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)中以及J.C.Robinson等在J.Biol.Chem.，Vol.237，2001-2009(1962)中都報道了在波菜甘醇酸酯氧化酶催化的羥基乙酸的氧化反應中，甲酸和CO2的形成來自于H2O2與水合乙醛酸的非酶促反應。他們還觀察到，向反應體系中加入能催化H2O2分解的過氧化氫酶時，可以通過抑制甲酸和CO2的形成而大大地提高水合乙醛酸的產(chǎn)率。同時還發(fā)現(xiàn)向酶溶液中加入FMN(黃素單核苷酸)時，可以大大地增加甘醇酸酯氧化酶的穩(wěn)定性。
N.A.Frigerio和H.A.Harbury在J.Biol.Chem.，Vol.231，135-157(1958)中，報道了從波菜中分離甘醇酸氧化酶的制備方法及其性質(zhì)，純化的該酶在溶液中極不穩(wěn)定，這是由于黃素單核苷酸(FMN)在酶的活性位點的結(jié)合比較弱，并由于酶從有活性的四聚體和/或八聚體形式解離為無活性的單體和二聚體，并發(fā)生不可逆地凝聚和沉淀。向酶溶液中加入FMN(黃素單核苷酸)便能使酶的穩(wěn)定性大大增加，且高蛋白質(zhì)濃度或高離子強度也可使酶保持為八聚體或四聚體。
在美國5,135,860號專利中，描述了制備水合乙醛酸和氨甲基膦酸(AMPA)混合物的方法，即在AMPA及兩個酶催化劑—甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的存在下，在水合溶液中，使羥基乙酸與氧起反應。在該方法中，還描述了通過使用過氧化氫酶(破壞產(chǎn)生甲酸的過氧化氫副產(chǎn)物)和AMPA作為能與甘醇酸酯形成抗氧化的N-取代半胺和/或亞胺絡合物(限制其進一步氧化)的胺添加劑時，所表現(xiàn)出的協(xié)同效應。水合乙醛酸的產(chǎn)率據(jù)報道可高達92％，且得到的水合乙醛酸和A MPA混合物可用于制備出苗后的植物毒劑和除莠劑N-(膦?；谆?甘氨酸。
本發(fā)明的簡要說明本發(fā)明涉及在氨甲基膦酸二烷基酯及兩種酶催化劑—甘醇酸酯氧化酶((S)-2-羥基酸氧化酶，EC 1.1.3.15)和過氧化氫酶(EC1.11.1.6)的存在下，在水溶液中，通過用氧氧化羥基乙酸制備水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯混合物的方法。以前使用的氨甲基膦酸(AMPA)在反應中會抑制過氧化氫酶活性，用氨甲基膦酸二烷基酯代替AMPA，可使水合乙醛酸的產(chǎn)量得到意外地提高。水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯的混合物可用來制備出苗后的植物毒劑和除莠劑N-(膦?；谆?甘氨酸。
美國5,135,860號專利中，描述了用可溶性的波菜甘醇酸酯氧化酶和可溶性的過氧化氫酶(例如從黑曲霉(Aspergillusniger)中提取的可溶性過氧化氫酶)作催化劑，制備水合乙醛酸和氨基甲基膦酸(AMPA)混合物的方法。美國的5,180,846號專利中，描述了這些混合物氫化產(chǎn)生N-(膦?；谆?甘氨酸的方法。在相關(guān)的U.S.S.N.07/951,497號專利申請中，描述了用能表達波菜甘醇酸酯氧化酶和內(nèi)源性過氧化氫酶兩種酶的遺傳工程微生物轉(zhuǎn)化細胞作為催化劑，制備水合乙醛酸/AMPA混合物的方法。還觀察到AMPA可道地對多型漢遜酵母(Hansenula polymorpha)或巴斯德畢赤氏酵母(PichiaPastoris)的轉(zhuǎn)化細胞中內(nèi)源性過氧化氫酶的抑制作用，使過氧化氫不能分解為水和氧，結(jié)果導致大量甲酸(過氧化氫氧化水合乙醛酸的產(chǎn)物)的生成。當用多型漢遜氏酵母或巴斯德畢赤氏酵母的轉(zhuǎn)化細胞作為催化劑時，向反應體系的混合物中加入另一種來源的過氧化氫酶(例如來源于黑曲霉的可溶性過氧化氫酶)可得到高產(chǎn)率的水合乙醛酸。
分別用來自黑曲霉、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多型漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母和牛肝的過氧化氫酶作催化劑，進行分解在甘醇酸酯/AMPA混合物的氧化過程中產(chǎn)生的過氧化氫的檢驗，發(fā)現(xiàn)AMPA對來源于多型漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母和牛肝中的過氧化氫酶有可逆抑制作用，這是以前未曾報道的。該抑制作用與是否使用可溶性的過氧化氫酶、固定化的過氧化氫酶或含過氧化氫酶的全細胞催化劑無關(guān)。除向用一種AMPA抑制來源的過氧化氫酶(例如多型漢遜酵母或巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化細胞)作為催化劑的甘醇酸酯/AMPA反應體系中加入另一來源的抗抑制的過氧化氫酶之外，也可在相同的反應體系中，用氨甲基膦酸二烷基酯代替AMPA，獲得消除或顯著降低對某些過氧化氫酶的抑制作用的意外效果，以致用AMPA作為胺添加物時也能正常發(fā)生。
在用可溶性甘醇酸酯氧化酶和可溶性黑曲霉過氧化氫酶(不被AMPA抑制)或可溶性多型漢遜酵母過氧化氫酶(被AMPA抑制)作為催化劑的羥基乙酸氧化反應體系中，比較AMPA和氨甲基膦酸二乙基酯(DEAMPA)作為胺添加物，在產(chǎn)生水合乙醛酸的最適反應條件(按實施例中描述)下，水合乙醛酸和甲酸的產(chǎn)量列于下表。當用黑曲霉或多型漢遜酵母的可溶性過氧化氫酶作催化劑時，用DEAMPA比用AMPA可得到更高的水合乙醛酸產(chǎn)量。在黑曲霉過氧化氫酶濃度低時，水合乙醛酸產(chǎn)率的提高可能是由于DEAMPA的質(zhì)子化胺比AMPA有更低的pKa(DEAMPA的pKa為6.4，AMPA的pKa為10.8)，而DEAMPA的較低的pKa有助于非質(zhì)子化的DEAMPA與羥基乙酸在反應進行的pH(pH8.3-8.5)時形成抗氧化的半胺或亞胺絡合物。
過氧化氫酶 [過氧化氫 水合乙甲酸酶] 醛酸胺 的來源(IU/mL)(％)(％)AMPA 黑曲霉 1,400 70 20AMPA 黑曲霉 14,000 92 2DEAMPA黑曲霉 1,400 95 4DEAMPA黑曲霉 14,000 97 1AMPA 多型漢遜酵母 5,600 43 45AMPA 多型漢遜酵母 14,000 64 24AMPA 多型漢遜酵母 56,000 68 6DEAMPA 多型漢遜酵母 1,400 84 12DEAMPA 多型漢遜酵母 14,000 98 1
在使用DEAMPA或AMPA以及多型漢遜酵母的可溶性過氧化氫酶的反應體系中，比較水合乙醛酸產(chǎn)率和甲酸產(chǎn)量(見上表)可以看出，用DEAMPA作為胺添加物時，水合乙醛酸產(chǎn)率顯著增加，而甲酸的產(chǎn)量明顯降低。使用低濃度的多型漢遜酵母的可溶性過氧化氫酶時，用DEAMPA可顯著提高水合乙醛酸產(chǎn)率，當用AMPA時，增加同一種酶的濃度，并不能得到用DEAMPA時相應的水合乙醛酸產(chǎn)率。同樣地，當用多型漢遜酵母或巴斯德畢赤氏酵母的轉(zhuǎn)化細胞作為催化劑，并用DEAMPA代替AMPA時，也能提高水合乙醛酸的產(chǎn)率，同時降低甲酸的產(chǎn)量(見所附實施例)。
優(yōu)選實施方案的說明羥基乙酸的催化氧化常在能催化羥基乙酸和O2反應生成水合乙醛酸的酶催化劑存在下，通過羥基乙酸和氧分子源的接觸很方便地進行。這樣的一種催化劑是甘醇酸酯氧化酶(EC 1.1.3.15)，也叫羥基乙酸氧化酶。甘醇酸酯氧化酶可以從本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的很多來源中分離得到(見上述)。反應體系中所用的甘醇酸酯氧化酶必須達到有效的濃度，通常是約0.01-約1000IU/mL的濃度，優(yōu)選約0.1-約10IU/mL。1 IU(國際單位)的定義為每分鐘催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)換所需的酶量。該酶可以按I.Zelitch和S.Ochoa在J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)中描述的方法測定。該方法也可用于測量回收的或再循環(huán)的甘醇酸酯氧化酶的活性。
用甘醇酸酯氧化酶作為催化劑氧化羥基乙酸轉(zhuǎn)換為水合乙醛酸時，向反應體系中加入促進過氧化氫分解的催化劑可以得到最佳的結(jié)果。能與甘醇酸酯氧化酶有效結(jié)合的這樣一種過氧化物破壞酶是過氧化氫酶(E.C.1.11.1.6)。過氧化氫酶催化過氧化氫分解為水和氧，并且可以確信，在本方法中，可以在甘醇酸酯氧化酶催化的羥基乙酸和O2的反應體系中，通過加速作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的過氧化氫的分解而提高水合乙醛酸的產(chǎn)率。過氧化氫酶的濃度必須達到50-50,000IU/mL，優(yōu)選2,000-15,000IU/mL。過氧化氫酶和甘醇酸酯氧化酶的濃度最好在上述范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，以使過氧化氫酶與甘醇酸酯氧化酶的比值(測量每種酶的IU)至少為約250∶1。
除用可溶性酶作為催化劑外，還制備了能表達甘醇酸酯氧化酶活性和內(nèi)源性過氧化氫酶活性的微生物轉(zhuǎn)化細胞，并在本發(fā)明中描述了它們作為微生物催化劑的用法。本發(fā)明中所用的微生物細胞催化劑為多型漢遜酵母(一種甲基營養(yǎng)型酵母)的轉(zhuǎn)化細胞。通過向受甲酸脫氫酶(FMD)啟動基因控制的表達載體中插入甘醇酸酯氧化酶的DNA，制備了幾個具有足夠高甘醇酸酯氧化酶活性的多型漢遜酵母的轉(zhuǎn)化細胞系。多型漢遜酵母與這種質(zhì)粒一起被轉(zhuǎn)化，并挑選出一個表達高水平甘醇酸酯氧化酶的菌株，標記為多型漢遜酵母GO1。
制備多型漢遜酵母細胞催化劑的經(jīng)典方法，首先是多型漢遜酵母轉(zhuǎn)化細胞的接種物在500mL，pH4.4的YPD(Difco)中生長，然后將培養(yǎng)物接種到pH為5.0的10L含無氨基酸的酵母氮堿(YBN)(14g)、硫酸銨(50g)和甲醇(100g)的發(fā)酵罐中，在37℃操作42.5小時，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，恒定pH在5.0，40％溶解的氧(控制)和14psig的空氣。發(fā)酵結(jié)束后，加入1.0千克的甘油，離心收集細胞，液氮冷凍后，貯藏于-80℃。
本發(fā)明所用到的第二種微生物細胞催化劑是巴斯德畢赤氏酵母(一種甲基營養(yǎng)型酵母)的轉(zhuǎn)化細胞，它能表達來源于波菜的甘醇酸酯氧化酶和內(nèi)源性的過氧化氫酶。通過向例如受甲醇誘導的乙醇氧化酶I啟動基因控制的巴斯德畢赤氏酵母表達載體(pHIL-D4)中，插入包含來源于波菜的甘醇酸酯氧化酶基因的DNA片段，得到pMPl質(zhì)粒，制備了幾個具有足夠高甘醇酸酯氧化酶活性的多型漢遜酵母的轉(zhuǎn)化細胞系。巴斯德畢赤氏酵母GTS115(NRRL Y-15851)經(jīng)pMPl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，挑選出整合線性pMPl質(zhì)粒到染色體中乙醇氧化酶I的位點，并用甘醇酸酯氧化酶基因取代乙醇氧化酶基因。這種轉(zhuǎn)化細胞庫用于進一步挑選最大數(shù)量的整合表達框的拷貝數(shù)。分離出高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化細胞，標記為GS115-MSP10，并保藏在NRRL中(Peoria，Illinois，1992年9月24日，NRRL編號為Y-21001)。
制備巴斯德畢赤氏酵母細胞的經(jīng)典方法是，將巴斯德畢赤氏酵母細胞的接種物在30℃、100mL含1％甘油的YNB中生長，48小時后，細胞轉(zhuǎn)移到含10L由無氨基酸酵母氮堿(YNB)(134g)、甘油(100g)和生物素(20mg)組成的培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。發(fā)酵的pH為5.0(用NH4OH控制)，溫度為30℃，攪拌速度200rpm，5slpm通氣，5psig的空氣，溶解的氧至少達到不低于50％飽和度。當甘油消耗殆盡時，將細胞在相同的培養(yǎng)基(用甲醇(50克)代替甘油)中誘導表達甘醇酸酯氧化酶。測量誘導甘醇酸酯氧化酶的過程的酶活性，然后進行酶分析。24小時后，用甘油(1kg)處理，收集細胞，液氮冷凍后，貯藏于-80℃。
多型漢遜酵母和巴斯德畢赤氏酵母細胞的轉(zhuǎn)化細胞，在用作羥基乙酸氧化為水合乙醛酸的反應的催化劑前，需要進行透性化處理。很多公知的透性化的方法都可用來制備具有足夠高活性甘醇酸酯氧化酶的細胞(見Felix，H.Anal.Biochemistry，Vo1.120，211-234，(1982))。慣用的方法是，將10％濕細胞的含0.1％(v/v)Triton X-100/20mM的磷酸的緩沖液(pH7.0)的懸浮液混合15分鐘，然后凍于液氮中，凍融，并用0.1mM FMN/20mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌。第二種透性化處理的方法是，將10％濕細胞的含0.2％(w/v)氯芐烷銨/20mM的磷酸緩沖液(pH7.0)的懸浮液混合，60分鐘后，用0.1mM FMN/20mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌。透性化處理后，選擇加入反應混合體系中的全細胞催化劑的量，以使甘醇酸酯氧化酶的濃度和過氧化氫酶的活性達到上面描述的相應可溶性酶濃度所需的濃度。甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶活性的回收大于其初始值的100％，這可能是由于在反應進行的過程中增加了全細胞催化劑的透性。
測量微生物細胞轉(zhuǎn)化細胞的甘醇酸酯氧化酶活性時，準確稱取約5-10mg的濕細胞(用濾紙吸去多余的水份)，加入到3-mL的石英比色杯中，杯中放有磁子攪拌棒和2.0mL0.12mM 2，6-二氯靛酚(DCIP)及80mM TRIS的緩沖液(pH8.3)。比色杯上蓋一層橡皮隔膜，向溶液中通入氮氣鼓泡5分鐘去氧，然后，攪拌下加入40μL 1.0M的羥基乙酸/1.0MTRIS(pH8.3)，一邊攪拌混合物，一邊在605nm(ε＝22,000)波長下測量隨時間的變化的吸收值。
測量過氧化氫酶活性時，準確稱取約2-5mg的濕細胞(用濾紙吸去多余的水份)，加入到3-mL的石英比色杯中，杯中放有磁子攪拌棒和2.0mL蒸鎦水。然后，加入1.0mL含59mM過氧化氫的50m M磷酸緩沖液(pH7.0)。在240nm(ε＝39.4)波長下測量隨時間變化的吸收值。不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的多型漢遜酵母或巴斯德畢赤氏酵母濕細胞(透性化)，其甘醇酸氧化酶的活性在20-120DCIPIU/克濕細胞的范圍，內(nèi)源性過氧化氫酶的活性在30,000-200,000IU/克濕細胞的范圍。
在反應混合物中可選擇適當?shù)挠幸娼M分，最常用的是黃素單核甘酸(FMN)，其所用濃度通?？筛叩郊s2.0mM，優(yōu)選約0.01到約0.2mM的濃度。FMN確信可以增加甘醇酸酯氧化酶的生產(chǎn)率，這意味著每單位的酶可以促使更多的羥基乙酸轉(zhuǎn)換為水合乙醛酸。應該理解的是，加入的FMN的濃度應該除去酶中已存在的任何FMN，因為在制備酶的過程中通常也向酶中加入FMN。FMN的結(jié)構(gòu)及其檢測方法可以參見K.Yagai，Methods Of BiochemicalAnalysis，Vol.X，Interscience Publishers，New York，1962，P.319-355，在此引用作為參考文獻。
羥基乙酸很容易并優(yōu)選在水性介質(zhì)中轉(zhuǎn)換為水合乙醛酸。羥基乙酸(2-羥基乙酸)可購得，在本發(fā)明中其反應起始濃度在0.10M到2.0M的范圍，優(yōu)選在0.25M和1.0M間的濃度，可用其原有形式或其相容的鹽形式，即水溶性且其陽離子不干擾羥基乙酸向水合乙醛酸的轉(zhuǎn)換，或下一步水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯產(chǎn)生N-(膦?；谆?甘氨酸的反應的鹽。合適的且相容的成鹽陽離子應該是很容易被檢測，這樣的鹽有堿金屬、堿土金屬、銨、取代銨、及取代的鏻鹽。
本發(fā)明的氨甲基膦酸二烷基酯的分子式為 其中，X和Y各自是烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基等，這樣形成的氨甲基膦酸二烷基酯在水性反應混合物中可部分或完全溶解。加入氨甲基膦酸二烷基酯的量為，按氨甲基膦酸二烷基酯和羥基乙酸(起始量)摩爾比，從0.01到3.0的范圍，優(yōu)選從0.25到1.05的范圍。在氨甲基膦酸二烷基酯和羥基乙酸在水溶液中化合后，調(diào)節(jié)最終混合物的pH在6和10之間，優(yōu)選在7.0-9.0之間.在這一pH范圍內(nèi)，可以通過加入相容的無干擾的堿精確調(diào)整pH到所需的pH值，這些堿包括堿金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和磷酸鹽。在反應過程中，反應混合物的pH會發(fā)生輕微地下降，故通常有用地在最大酶活性PH范圍的高限開始反應，即約在9.0-8.5，這樣可以允許在反應過程中pH有所下降。由于酶活性會隨pH發(fā)生改變，因此可以任選通過另外加入無干擾的無機或有機緩沖液保持pH穩(wěn)定。
羥基乙酸和水合乙醛酸在水中有很高的離解度，當pH在7和10之間時，不難理解，即便不是全部也是絕大多數(shù)的羥基乙酸和水合乙醛酸以離子形式存在。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可認識到水合乙醛酸(及其共軛堿水合乙醛酸陰離子)也可以以例如(HO)2CHCOOH的水合物和/或HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH的半縮醛形式存在，這樣的組成及其陰離子配對物等當量于水合乙醛酸及其陰離子，成為形成N-(膦酰基甲基)甘氨酸的適合反應物。同樣的，氨甲基膦酸二烷基酯可以部分或完全以質(zhì)子化的胺陽離子形式存在，其反離子可以是一個或多個存在于反應混合物中的陰離子。
作為羥基乙酸轉(zhuǎn)換為水合乙醛酸的氧化劑的氧氣(O2)，可以通過在氣-液界面攪動液體，或通過透過氧氣的膜，向反應體系中加入氣體氧。在多數(shù)條件下，反應速度至少部分取決于氧溶進水介質(zhì)的速度。因此，雖然氧可以以空氣加入到反應體系中，但最好是用較純的氧，甚至高壓氧。盡管不知道氧壓力的上限，但可用至多50個大氣壓的氧，優(yōu)選15個大氣壓的上限。攪動對保證氧氣的高溶解速度(以及反應)是很重要的。只要方便，可以使用任何形式的攪動例如攪拌。另一方面，從事酶領(lǐng)域研究的技術(shù)人員都知道，劇烈地剪切攪拌或產(chǎn)生氣泡的攪拌會使可溶性酶的活性下降，因此，使用可溶性的酶作催化劑時應該避免這類攪拌。
反應溫度是一個重要的變量，它影響著反應速度和酶的穩(wěn)定性。反應可用0℃到40℃的溫度，優(yōu)選從5℃到15℃的溫度范圍。在優(yōu)選的溫度范圍內(nèi)操作，可以保證在反應最后得到最大的回收酶活性。溫度不能低到水溶液開始結(jié)冰的程度。溫度能用普通的方法例如(但不僅限于此)通過用夾套反應器并讓適當溫度的液體流過夾套控制?？捎萌魏尾馁|(zhì)制造反應容器，只要該材質(zhì)對反應成分是惰性就行。
反應完成后，可溶性的酶可以通過過濾或離心除去并重復使用。它們也可以通過在例如70℃加熱5分鐘后沉淀變性，和/或只要在后面的混合物轉(zhuǎn)換為N-(膦酰基甲基)甘氨酸及從反應混合物中回收N-(膦?；谆?甘氨酸的步驟中不起干擾任用，也可以繼續(xù)留在反應混合物中。微生物細胞的轉(zhuǎn)化細胞可以經(jīng)過濾或離心后回收并重復使用。反應溶液與O2的接觸的終止后，優(yōu)選在可溶性酶或全細胞催化劑除去之后，則可以通過與活性碳的接觸任選除去黃素單核苷酸(FMN)。
水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯的終產(chǎn)物混合物(與相應的半胺與亞胺平衡)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法處理以合成N-(膦?；谆?甘氨酸。催化加氫水合乙醛酸/氨甲基膦酸二烷基酯的混合物然后水解的催化氫化產(chǎn)物N-(二烷氧基氧膦基甲基)甘氨酸，是從水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯制備混合物N-(膦?；谆?甘氨酸的優(yōu)選方法。適用于這一目的的加氫催化劑包括(但不局限于此)多種鉑族金屬例如銥、鋨、銠、釕、鉑和鈀，還包括多種其他過渡金屬例如鈷、銅、鎳和鋅。催化劑可以無載體例如阮內(nèi)鎳或氧化鉑，或有載體如在碳上的鉑、在氧化鋁上的鈀或在硅藻土上的鎳。優(yōu)選在碳上的鉑、在硅藻土上的鎳或阮內(nèi)鎳。氫化反應的pH一般在4-11間，優(yōu)選5-10間。氫化反應的溫度和壓力可以有很寬的選擇。溫度一般在0℃-150℃的范圍，優(yōu)選20℃到90℃。而H2壓一般在從大氣壓到約100個大氣壓范圍，優(yōu)選從1到10個大氣壓。
氫化水合乙醛酸/氨甲基膦酸二烷基酯混合物產(chǎn)生的N-(二烷氧基氧膦基甲基)甘氨酸可經(jīng)向水性產(chǎn)物混合物中加入過量的鹽酸或氫溴酸，并加熱而水解得到N-(膦?；谆?甘氨酸。用作出苗后的除草劑的N-(膦?；谆?甘氨酸，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的回收方法從終混合物中回收。
在用于進一步說明本發(fā)明的下面的實施例中，水合乙醛酸、甲酸和草酸的產(chǎn)率，以及甘醇酸酯的回收產(chǎn)率，用占反應開始階段羥基乙酸總量的百分數(shù)表示。反應混合物通過Bio-Rad HPX-87H有機酸分析柱用高壓液相色譜(HPLC)進行分析。
實施例1向3盎司的費歇爾-玻特(Fischer-Porter)玻璃氣溶膠反應器中放入一磁子攪拌棒，加入10mL含羥基乙酸(0.25M)、氨甲基膦酸(AMPA，0.263M)、FMN(0.01mM)、丙酸(HPLC內(nèi)標物，0.125M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/mL)和可溶性黑曲霉過氧化氫酶(1,400IU/mL)的pH8.5的水溶液。密封反應器，并將反應混合物冷卻至15℃。攪拌下用氧氣加壓至70psig，并排氣到大氣5次，以此吹洗。然后將反應器加壓到70psig的氧氣，在15℃攪拌反應混合物。用注射器通過取樣口(不要減少反應器中的壓力)在以規(guī)定間隔取每等分樣品(0.10mL)進行HPLC分析監(jiān)測反應過程。5小時后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為70.4％、19.6％和2.2％，并剩余5.3％的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的27％和100％。
實施例2用含羥基乙酸(0.500M)、AMPA(0.500M)、FMN(0.01mM)、異丁酸(HPLC內(nèi)標物，0.100M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/m L)和可溶性黑曲霉過氧化氫酶(1,400IU/mL)的水溶液，在pH8.5和5℃的條件下，重復實施例1中描述的反應步驟。21小時后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為85.2％、1.5％和3.3％，并剩余5.5％的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的49％和93％。
實施例3用含羥基乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、FMN(0.01mM)、異丁酸(HPLC內(nèi)標物，0.100M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/mL)和1,400IU/mL的分別來源于黑曲酶、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、牛肝、或多型漢遜酵母的可溶性過氧化氫酶的水溶液，在pH8.5和5℃的條件下，重復實施例1中描述的反應步驟。反應時間、甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和羥基乙酸的產(chǎn)率分別列于下表可溶性 時間 過氧化 甘醇酸酯 水合 甲酸 草酸 羥基乙氫 乙醛 酸酸過氧化氫酶 (小時) 酶(％)氧化酶 (％) (％) (％) (％)(％)黑曲霉 19 8139 92.1 1.94.7 1.8啤酒酵母18 5937 94.2 2.6 03.0牛肝 18 3427 40.0 51.4 2.5 5.3多型漢遜酵 19 7546 64.3 23.7 4.0 2.7母實施例4分別用1,400IU/m L的黑曲酶或多型漢遜酵母的可溶性過氧化氫酶的水溶液，在15℃條件下重復實施例3的反應。反應時間、甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和羥基乙酸的產(chǎn)率分別列于下表可溶性 時間 過氧化氫 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羥基乙醛酸過氧化氫酶 (小時) 酶(％)氧化酶(％) (％) (％) 酸(％)(％)黑曲霉 20 8412 87.3 1.8 2.78.2多型漢遜酵20 6417 62.0 27.9 2.94.7母實施例5分別用5,600IU/mL或56,000的IU/mL的可溶性多型漢遜酵母過氧化氫酶重復實施例3的反應。對于三種濃度的過氧化氫酶，其反應時間、甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和乙醇酸的產(chǎn)率都列于下表多型漢遜 時間 過氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羥基乙酵 氫 醛酸母(小時) 酶(％) 氧化酶(％) (％) (％) 酸(％)(IU/mL) (％)5,600 22 48 25 42.9 44.501.614,00020 64 17 62.0 27.9 2.9 4.756,00022 12 14 68.4 6.34 2.4 6.5實施例6
用含羥基乙酸(0.500M)、氨甲基膦酸二乙基酯(DEAMPA，0.398M)、FMN(0.01mM)、異丁酸(HPLC內(nèi)標物，0.100M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/mL)和可溶性黑曲霉過氧化氫酶(14,000IU/mL)的水溶液，在pH8.3和5℃的條件下，重復實施例1中描述的步驟。20小時后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為97.4％、0.8％和1.8％，且沒有剩余的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的10％和95％。
實施例7用含羥基乙酸(0.50M)、DEAMPA(0.525M)、FMN(0.01mM)、異丁酸(HPLC內(nèi)標物，0.10M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/mL)和可溶性黑曲霉過氧化氫酶(1,400IU/mL)的水溶液，在pH8.3的條件下，重復實施例6中的反應。23小時后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為95.3％、3.9％和1.5％，且沒有剩余的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的12％和100％。
實施例8分別用1,400IU/mL或14,000IU/mL的可溶性多型漢遜酵母過氧化氫酶，重復實施例7與DEAMPA(0.525M)的反應。反應時間、甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和羥基乙酸的產(chǎn)率列于下表多型漢遜 時間 過氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羥基乙酵氫 醛酸母 (小時) 酶(％) 氧化酶(％) (％) (％) (％) 酸(％)(IU/mL)1,400 10 76 31 84.21 1.5 0.62.314,000 10 79 38 98.2 1.3 0.42.8實施例9在3盎司的費歇爾-玻特玻璃氣溶膠反應器中，放入一個磁子攪拌棒，加入10mL含羥基乙酸(0.500M)、氨甲基膦酸(0.375M)、異丁酸(0.100M，HPLC內(nèi)標物)、黃素單核苷酸(0.01mM)的水溶液，調(diào)pH(用50％的NaOH)到8.3，并冷卻至5℃。再向反應器中加入0.47克事先經(jīng)0.1％Triton X-100/1次凍溶處理后透性化的多型漢遜酵母轉(zhuǎn)化細胞G01(10IU的甘醇酸酯氧化酶和22,100IU的過氧化氫酶)，封閉反應器，并將反應混合物冷卻至5℃。攪拌下用氧加壓至70psig，并排氣到大氣5次，以此吹洗。然后將反應器加壓到70psig的氧氣，在5℃攪拌反應混合物。用注射器通過取樣口(不要減少反應器中的壓力)以規(guī)定間隔取每等分(0.10mL)樣作HPLC分析監(jiān)測反應過程。5小時后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為57.6％、32.5％和2.6％，并剩余8.9％的甘醇酸酯。剩余透性細胞中甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的活性分別為其初始值的60％和378％。
實施例10重復實施例9的反應，只是在反應混合物中再加入14,000IU/mL的可溶性黑曲霉過氧化氫酶.6小時后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為90.1％、1.3％和5.9％，并剩余3.0％的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的86％和136％。
實施例11重復實施例9的反應，只是用0.75克事先經(jīng)0.1％TritonX-100/1次凍溶處理后透性化的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化細胞MSP10(13.2IU的甘醇酸酯氧化酶和21,200IU的過氧化氫酶)代替多型漢遜酵母轉(zhuǎn)化細胞。16小時后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為30.5％、59.2％和10.7％，并剩余0.8％的甘醇酸酯。
實施例12在3盎司的費歇爾-玻特玻璃氣溶膠反應器中放入一個磁子攪拌棒，加入10mL含羥基乙酸(0.500M)、DEAMPA(0.525M)、異丁酸(0.100M，HPLC內(nèi)標物)和黃素單核苷酸(0.01mM)的水溶液，調(diào)pH(用50％的NaOH)到8.3，并冷卻至5℃。再向反應器中加入1.5克事先經(jīng)0.1％Triton X-100/一次凍溶處理后透性化的多型漢遜酵母轉(zhuǎn)化細胞G01(8.0IU的甘醇酸酯氧化酶和38,000IU的過氧化氫酶)，然后封閉反應器，并將反應混合物冷卻至5℃。攪拌下用氧氣加壓至70psig，并排氣到大氣5次，以此吹洗。然后將反應器加壓到70psig的氧氣，在5℃攪拌反應混合物。用注射器通過取樣口(不要減少反應器中的壓力)以規(guī)定間隔取每等分(0.10mL)樣作HPLC分析監(jiān)測反應過程。9小時后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為98.4％、0％和2.0％，并沒有剩余的甘醇酸酯。剩余透性細胞中甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的活性分別為其初始值的63％和250％。
實施例13用含羥基乙酸(0.500M)、AMPA(0.525M)、異丁酸(0.100M，HPLC內(nèi)標物)、黃素單核苷酸(0.01mM)和0.72克事先用0.2％氯芐烷銨(Lonza Barquat OJ-50)處理后透性化的多型漢遜酵母轉(zhuǎn)化細胞G01(43.0IU的甘醇酸酯氧化酶和39,880IU的過氧化氫酶)的混合物，在pH8.3(用50％的NAOH)和5℃條件下，重復實施例12的反應。1小時后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC產(chǎn)率分別為50.2％、47.4％和1.1％，并剩余2.2％的甘醇酸酯。剩余透性細胞中甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的活性分別為其初始值的95％和105％。
實施例14分別用AMPA(0.375M)或DEAMPA(0.375M)作為胺添加劑，重復實施例13的反應。反應時間、甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和乙醇酸的產(chǎn)率列于下表時間 過氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羥基乙氫 醛酸胺 (小時) 酶(％) 氧化酶 (％) (％) (％) 酸(％)(％)AMPA 5 99 54 42.7 47.3 10.7 4.7DEAMPA 1 122 108 83.5 15.5 5.60實施例15
用含羥基乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)或DEAMPA(0.375M)、異丁酸(0.100M，HPLC內(nèi)標物)、黃素單核苷酸(0.01mM)和0.23克事先用0.2％氯芐烷銨(LonzaBarquat OJ-50)處理后透性化的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化細胞GS115-MSP10(12.3IU的甘醇酸酯氧化酶和39,420IU的過氧化氫酶)的混合物，在pH8.3(用50％的NaOH)和5℃條件下，重復實施例12的反應。反應時間、回收甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和乙醇酸的產(chǎn)率列于下表時間 過氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羥基乙氫 醛酸胺 (小時) 酶(％)氧化酶 (％) (％) (％) 酸(％)(％)AMPA4130 214 59.7 36.2 4.31.5DEAMPA 1124 268 92.9 3.6 3.9 0實施例16分別用AMPA(0.525M)或DEAMPA(0.525M)作為胺添加劑，重復實施例15的反應。反應時間、甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和乙醇酸的產(chǎn)率列于下表時間 過氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羥基乙氫 醛酸胺 (小時) 酶(％) 氧化酶(％) (％) (％) 酸(％)(％)AMPA 4 130 246 58.2 34.6 3.6 1.9DEAMPA 1 118 276 95.1 1.63.30實施例17按實施例12中描述的方法，用微生物轉(zhuǎn)化細胞作催化劑，從羥基乙酸(0.50M)和DEAMPA(0.525M)的混合物制備的水合乙醛酸(0.49M)和DEAMPA(0.525M)的混合物，經(jīng)Amicon Centriprep 10號濃縮器(截留分子量10,000)過濾除去可溶性蛋白質(zhì)，然后與0.10克的活性碳混合除去FMN，過濾，濾液放入帶磁子攪拌棒的3盎司費歇爾-玻特瓶中。向瓶中加入0.100克10％的Pd/C，并封閉反應瓶，用氮氣吹洗，然后用氫氣加壓至50psig，在25℃攪拌，當氫壓下降時，補加氫氣使壓力保持在50psig。當氫氣壓力保持穩(wěn)定時，通過卸壓和用氮氣吹洗反應。向含N-(二乙氧基氧膦基甲基)甘氨酸的最終水溶液中，加入過量的濃鹽酸并加熱至沸騰，導致二烷基膦酸酯水解，濃縮所得混合物，用結(jié)晶法分離N-(膦?；谆?甘氨酸。
以上以某種程度的特殊性，對本發(fā)明進行說明和示例，但應理解的是后邊的權(quán)利要求并不限于此，而是為權(quán)利要求提供與權(quán)利要求的每一要求及相應內(nèi)容的措詞相適應的范圍。
權(quán)利要求
1.制備水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯混合物的方法，包括在氨甲基膦酸二烷基酯及甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的存在下，在水溶液中，用氧氧化甘醇酸酯。
2.制備用于合成N-(膦?；谆?甘氨酸的中間產(chǎn)物的方法，中間產(chǎn)物包括含有水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯的混合物，所述方法包括在氨甲基膦酸二烷基酯的存在下，酶催化甘醇酸酯轉(zhuǎn)化為水合乙醛酸酯。
3.制備N-(膦?；谆?甘氨酸的方法，包含下列步驟(A)在氨甲基膦酸二烷基酯及甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶的存在下，在水溶液中，用氧氧化甘醇酸酯合成水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯的混合物；(B)還原步驟(A)中所得的混合物，得到N-(二烷氧基氧膦基甲基)甘氨酸；和(C)水解步驟(B)中所得的N-(二烷基氧膦基甲基)甘氨酸，得到N-(膦?；谆?甘氨酸。
4.按權(quán)利要求1的方法，其中所述過氧化氫酶來自黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、啤酒酵母、多型漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母和牛肝中。
5.按權(quán)利要求2的方法，其中所述酶促轉(zhuǎn)化甘醇酸酯為水合乙醛酸酯的過程在甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶存在下進行，所述過氧化氫酶來自黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、啤酒酵母、多型漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母和牛肝。
6.按權(quán)利要求3的方法，其中所述過氧化氫酶來自黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、啤酒酵母、多型漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母和牛肝。
7.按權(quán)利要求1的方法，其中過氧化氫酶和甘醇酸酯氧化酶以微生物全細胞催化劑形式使用，微生物全細胞催化劑選自多型漢遜酵母和巴斯德畢赤氏酵母。
8.按權(quán)利要求2的方法，其中所述酶促轉(zhuǎn)化甘醇酸酯為水合乙醛酸酯的過程在甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶存在下進行，酶以選自多型漢遜酵母和巴斯德畢赤氏酵母的微生物全細胞催化劑形式使用。
9.按權(quán)利要求3的方法，其中所述過氧化氫酶和甘醇酸酯氧化酶以選自多型漢遜酵母和巴斯德畢赤氏酵母的微生物全細胞催化劑形式使用。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯混合物及其后續(xù)產(chǎn)物N-(膦?；谆?甘氨酸的方法，即在氨甲基膦酸二烷基酯及甘醇酸酯氧化酶和過氧化氫酶催化劑的存在下，在水溶液中，使羥基乙酸和氧在酶催化下反應，制備水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯(DEAMPA)混合物；所得混合物可被氫化并進一步水解，得到N-(膦?；谆?甘氨酸，可用作出苗后的植物毒劑和除莠劑。
文檔編號C12P13/04GK1124981SQ94192283
公開日1996年6月19日 申請日期1994年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月28日
發(fā)明者D·L·安敦, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司