專利名稱：測定酚氧化酶原活化酶活性的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定酚氧化酶原活化酶(以下稱為PPAE)活性的方法及一種利用所述測定方法測定β-1，3-葡聚糖和肽聚糖的方法。
昆蟲的體液中有一個涉及一系列酶的稱為酚氧化酶原活化系統(tǒng)(以下稱為proPO活化系統(tǒng))的級聯(lián)，該級聯(lián)與體液中的黑素形成過程有關(guān)。已知β-1，3-葡聚糖(一種真菌細(xì)胞壁組分)和肽聚糖(一種細(xì)菌細(xì)胞壁組分)能觸發(fā)所述級聯(lián)(Onishi，Annot.Zool.Jpn.，2733-39，1954;Ahida和Onishi，Arch.Biochem.Biophys.，122411-416，1967;Brunet，Insect Biochem.，10467-500，1980;Ashida和Yamazaki，Molting and Metamorphosis，239-265，Japan Sci.Soc.Press，1990)，這種作用被歸因于對β-1，3-葡聚糖具有特異親和性的β-1，3-葡聚糖識別蛋白(βGRP;分子量為62kD)和對肽聚糖具有特異親和性的肽聚糖識別蛋白(PGRP;分子量為19kD)，這兩種蛋白存在于所述proPO活化系統(tǒng)中。當(dāng)其中任一種蛋白識別β-1，3-葡聚糖或肽聚糖時，則開始一系列的級聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)過一些尚未闡明的反應(yīng)，包括一種需Ca2+酶的反應(yīng)，產(chǎn)生一種能將酚氧化酶原(酚氧化酶的前體，以下稱為proPO)轉(zhuǎn)化為酚氧化酶(以下稱為PO)的PPAE(Ashida和Dohke，Insect Biochem.，1037-47，1980)。
鑒于這一現(xiàn)象，已進(jìn)行了各種研究而試圖建立通過以所述級聯(lián)反應(yīng)為基礎(chǔ)測定β-1，3-葡聚糖和肽聚糖而檢測細(xì)菌感染和真菌感染的方法，以及對治療劑進(jìn)行安全檢驗(yàn)的方法。
目前，一直用鱟試驗(yàn)試劑作為檢測細(xì)菌感染和對治療劑等進(jìn)行安全檢驗(yàn)的試劑，該試劑使用了鱟的變形蟲狀細(xì)胞溶解液，而鱟(Limulus polyphemus、Tachypleus tridentatus)也具有與昆蟲類似的體內(nèi)級聯(lián)。然而，鱟體內(nèi)缺少能與肽聚糖反應(yīng)的系統(tǒng)，所以只可能檢測到β-1，3-葡聚糖的脂多糖，這樣便漏掉了不含脂多糖的革蘭氏陽性菌。此外，提供該試劑的鱟在日本的數(shù)量有限，總會由于其未來供應(yīng)量不穩(wěn)定而造成某種困難。
另一方面，如果采用昆蟲的級聯(lián)(proPO活化系統(tǒng))，則預(yù)計既可以有穩(wěn)定的試劑供應(yīng)，又可以對包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)菌(更不用說真菌)進(jìn)行檢測，因?yàn)樵摷壜?lián)包括對肽聚糖有反應(yīng)的系統(tǒng)。還可以從體液中分離出能與肽聚糖特異反應(yīng)的組分或能與β-1，3-葡聚糖特異反應(yīng)的組分，從而彼此獨(dú)立地特異檢測β-1，3-葡聚糖(真菌)和肽聚糖(細(xì)菌)(美國專利4，970，152)。
以昆蟲級聯(lián)為基礎(chǔ)的測定方法包括了一種常規(guī)方法，其中通過測定由于proPO被PPAE轉(zhuǎn)化為PO而產(chǎn)生的PO活性來檢測β-1，3-葡聚糖和肽聚糖。該方法遇到的問題是PO(一種不穩(wěn)定的酶)發(fā)生自身氧化以及檢測靈敏度達(dá)不到顯著增強(qiáng)。
為解決這些問題，Kenneth T.Soderhall提出了一種測定β-1，3-葡聚糖和內(nèi)毒素(脂多糖)的方法，該方法使用一種合成肽作底物來測定能活化PO的某些絲氨酸蛋白酶活性(EP-A-96689)。該方法所用的底物在構(gòu)建時并沒有考慮到催化proPO轉(zhuǎn)化為PO的PPAE的反應(yīng)特異性，而只是依據(jù)了PPAE屬于絲氨酸蛋白酶這樣一個事實(shí)。且不說β-1，3-葡聚糖和內(nèi)毒素(脂多糖)，就是PPAE活性是否能精確測定也尚有爭議。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種精確測定PPAE活性的方法，該方法是基于PPAE固有的底物特異性和高度的反應(yīng)特異性而實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用所述PPAE活性測定方法測定β-1，3-葡聚糖和肽聚糖的方法。
本發(fā)明人分析了PPAE的固有底物proPO的一級結(jié)構(gòu)，成功地闡明了PPAE所識別和切割的區(qū)域的氨基酸順序。
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明涉及一種測定PPAE活性的方法和一種測定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，前者使用包含proPO上PPAE識別一切割位點(diǎn)的肽鏈作為底物，后者則利用所述方法測得的PPAE活性作為指標(biāo)。


圖1是用于純化PPAE的硫酸銨分級分離步驟的示意圖。
圖2顯示了用合成肽作底物時，用液相色譜法測得的PPAE活性的分析結(jié)果，其中1是反應(yīng)產(chǎn)物峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-OH)，2是合成肽峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH)。
圖3是顯示PPAE濃度和PPAE活性相關(guān)性的曲線圖。
圖4是用合成肽作底物檢測CM-凝乳聚糖(CM-curdlan)的液相色譜圖，其中1是反應(yīng)產(chǎn)物峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-OH)，2是合成肽峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH)。
圖5是顯示CM-凝乳聚糖濃度和PPAE活性相關(guān)性的曲線圖。
圖6是用合成肽作底物檢測肽聚糖的液相色譜圖，其中1是反應(yīng)產(chǎn)物峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-OH)，2是合成肽峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH)。
本發(fā)明是一種測定PPAE活性的方法，該方法包括至少測定PPAE與式(Ⅰ)的肽鏈接觸時產(chǎn)生的X-Arg或YX-Arg-Y (Ⅰ)其中X為任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-氨基或N末端，條件是鄰接Arg的氨基酸殘基不為Gly或Ala;Y為能夠通過酰胺鍵或酯鍵與Arg的羧基結(jié)合的有機(jī)殘基，或者任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-羧基或C末端，所述肽鏈能夠被得自昆蟲的PPAE水解成X-Arg和Y[以下也稱作測定(1)];本發(fā)明特別是如下定義的方法其中所述X為下式的基團(tuán)X′-Asn其中X′為任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-氨基或N末端，條件是X′的氨基酸數(shù)目為X的氨基酸數(shù)目減1，或者X′為Asn的α-氨基的保護(hù)基;并且/或者Y為下式的基團(tuán)Phe-Gly-Z其中Z為任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-羧基或C末端，條件是Z的氨基酸數(shù)目為Y的氨基酸數(shù)目減2，或者Z為Gly的羧基的保護(hù)基。此外，本發(fā)明涉及測定PPAE活性的方法，該方法包括使用包括紫外或可見光吸收、發(fā)光、熒光、放射性或磁性在內(nèi)的測定方法。
本發(fā)明還是一種測定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，該方法包括用PPAE活性作為指標(biāo)，所述PPAE的測定方法是至少測定proPO活化系統(tǒng)和β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖與式(Ⅰ)的肽鏈接觸時產(chǎn)生的X-Arg或YX-Arg-Y (Ⅰ)其中X為任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-氨基或N末端，條件是鄰接Arg的氨基酸殘基不為Gly或Ala;Y為能夠通過酰胺鍵或酯鍵與Arg的羧基結(jié)合的有機(jī)殘基，或者任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-羧基或C末端，所述肽鏈能夠被得自昆蟲的PPAE水解成X-Arg和Y[以下也稱作測定(2)];本發(fā)明特別是如下定義的方法其中所述X為下式的基團(tuán)
X′-Asn其中X′為任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-氨基或N末端，條件是X′的氨基酸數(shù)目為X的氨基酸數(shù)目減1，或者X′為Asn的α-氨基的保護(hù)基;并且/或者Y為下式的基團(tuán)Phe-Gly-Z其中Z為任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-羧基或C末端，條件是Z的氨基酸數(shù)目為Y的氨基酸數(shù)目減2，或者Z為Gly的羧基的保護(hù)基。此外，本發(fā)明涉及測定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，該方法包括使用包括紫外或可見光吸收、發(fā)光、熒光、放射性或磁性在內(nèi)的測定方法。
此外，本發(fā)明涉及一種測定β-1，3-葡聚糖的方法和一種測定肽聚糖的方法，這兩種方法都包括測定(2)的步驟，但前一方法使用除去了與肽聚糖特異反應(yīng)的組分后得到的proPO活化系統(tǒng)[以下也稱作測定(3)]，后一方法使用除去了與β-1，3-葡聚糖特異反應(yīng)的組分后得到的proPO活化系統(tǒng)[以下也稱作測定(4)]。
本發(fā)明的測定PPAE活性的方法[測定(1)]包括測定PPAE與底物肽鏈X-Arg-Y接觸而得到的反應(yīng)產(chǎn)物X-Arg和Y中的至少一種。
底物X-Arg-Y是由兩個或更多個氨基酸殘基組成的肽鏈，它不受任何特殊限制，而只需要滿足下列要求A.可被得自昆蟲的PPAE分解成X-Arg和Y。
B.X-Arg和Y中至少有一個可根據(jù)其化學(xué)或物理性質(zhì)來測定。
C.Arg的α-氨基與Gly和Ala以外的氨基酸殘基結(jié)合。
這里所用的肽鏈包括肽和肽衍生物。肽衍生物是指在肽的N末端和/或C末端帶有保護(hù)基的衍生物、帶有標(biāo)記氨基酸殘基的衍生物等。
與Arg結(jié)合的X和Y不受任何限制，而只需要滿足上述A-C的要求。
X的例子包括除Gly和Ala以外的氨基酸殘基，以及C末端氨基酸殘基不為Gly或Ala的肽殘基。可以對這些氨基酸殘基和肽殘基進(jìn)行標(biāo)記，并可對其α-氨基或N末端進(jìn)行保護(hù)。
X優(yōu)選為式X′-Asn的基團(tuán)，其中X′為任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-氨基或N末端，條件是X′的氨基酸數(shù)目為X的氨基酸數(shù)目減1，或者X′為Asn的α-氨基的保護(hù)基。
更為優(yōu)選的是，X為帶有家蠶(Bombyx mori)proPO氨基酸順序C末端的至少2個氨基酸的基團(tuán)，如下所示X＝Phe-Gln-Leu-Thr-Glu-Gln-Phe-Leu-Thr-Glu-Asp-Tyr-Ala-Asn-Asn-Gly-Ile-Glu-Leu-Asn-Asn或X＝Tyr-Gln-Arg-Val-Ser-Asn-Ala-Ile-Gly-Asn氨基酸殘基的數(shù)目優(yōu)選為2-20。
這里所用的肽殘基或氨基酸殘基的N-末端或α-氨基的保護(hù)基，以及Asn的α-氨基的保護(hù)基，可以是能夠保護(hù)氨基酸殘基的α-氨基的任何基團(tuán)，其實(shí)例有含2-18個碳原子的芐氧羰基、琥珀?；蛲檠豸驶?br> X-Arg-Y中的Y是能夠通過酰胺鍵或酯鍵與Arg的羧基結(jié)合的有機(jī)殘基，或者是氨基酸殘基或肽殘基?？梢詫@些氨基酸殘基和肽殘基進(jìn)行標(biāo)記，并可對其α-氨基或C末端進(jìn)行保護(hù)。
有機(jī)殘基是指通過酰胺鍵或酯鍵與Arg的羧基結(jié)合，并由于PPAE的作用而從X-Arg上釋放出來的殘基。有機(jī)殘基不受任何特殊限制，只要求它能夠用物理或化學(xué)方法檢測，或只要求它從X-Arg-Y上釋放出來而產(chǎn)生X-Arg和Y(有機(jī)殘基)時使反應(yīng)體系的性質(zhì)發(fā)生改變從而可以用物理或化學(xué)方法測定。
其實(shí)例包括(但不限于)生色基團(tuán)，如對硝基苯胺基和2-氯-4-硝基苯胺基;發(fā)光基團(tuán)，如2-吡啶氨基、3-吡啶氨基、β-萘氨基、7-氨基-4-甲基香豆素和7-羥基-4-甲基香豆素;用同位素如125I、14C和3H標(biāo)記的有機(jī)殘基;以及磁性基團(tuán)。
關(guān)于Y，肽殘基優(yōu)選為Phe-Gly-Z，其中Z為任選標(biāo)記的氨基酸殘基或肽殘基，該殘基帶有任選保護(hù)的α-羧基或C末端，條件是Z的氨基酸數(shù)目為Y的氨基酸數(shù)目減2，或者Z為Gly的羧基的保護(hù)基。
更優(yōu)選的是，Y為帶有家蠶proPO氨基酸順序N末端的至少2個氨基酸殘基的基團(tuán)，如下所示Y＝Phe-Gly-Asp-Asp-Ala-Ser-Glu-Lys-Ile-Pro-Leu-Lys-Asn-Leu-Ser-Lys-Leu-Pro-Glu-Phe-Lys-Ile或Y＝Phe-Gly-Ser-Asp-Ala-Gly-Arg-Met-Ile-Pro氨基酸殘基的數(shù)目優(yōu)選為2-20。
氨基酸殘基不受特殊限制，但優(yōu)選為Phe。
這里所用的肽殘基或氨基酸殘基的C末端或羧基的保護(hù)基，以及Gly的羧基的保護(hù)基，可以是能夠保護(hù)氨基酸殘基的α-羧基的任何基團(tuán)，其典型實(shí)例為芳烷氧基，例如芐氧基或苯乙氧基。
在本發(fā)明中，標(biāo)記物不受特殊限制，只要求它能修飾或取代肽殘基或氨基酸殘基的一部分，其結(jié)果是能夠?qū)鲭臍埢虬被釟埢幕衔镞M(jìn)行測定。
標(biāo)記物的例子包括(但不限于)酶免疫測定中所用的酶，如堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、過氧化物酶、微過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶和熒光素酶;放射免疫測定中所用的放射性同位素，如99mTc、131I、125I、14C和3H;熒光物質(zhì)，如2-氨基吡啶、3-氨基吡啶，以及用于熒光免疫測定的熒光素、丹酰、熒光胺、香豆素、萘胺及其衍生物;發(fā)光物質(zhì)，如熒光素、異魯米諾、魯米諾和草酸二(2，4，6-三氟苯基)酯;在紫外范圍內(nèi)有吸收的物質(zhì)，如苯酚、萘酚、蒽及其衍生物;具有自旋標(biāo)記性質(zhì)的物質(zhì)，例如帶有烴氧基(如4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基、3-氨基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧基、2，2-二叔丁基-α-(3，5-二叔丁基-4-氧-2，5-環(huán)已二烯-1-亞基)對甲苯氧基)的化合物。
作為PPAE來源的昆蟲(昆蟲綱)不受任何特殊限制，但優(yōu)選那些有成熟飼養(yǎng)方法的昆蟲，其實(shí)例包括鱗翅目，如蠶蛾科(Bombycidae)、煙草天蛾(Manduca sexta);雙翅目，如家蠅(Muscadomestica、Boettcherisca Peregrina;直翅目，如蝗蟲(Locustamigratoria)和Emmafield蟋蟀;甲蟲(鞘翅目)，如Acalolepta luxuriosa。
不管什么發(fā)育階段的昆蟲都可使用，可以使用幼蟲或成蟲。鱗翅目、雙翅目和鞘翅目的昆蟲優(yōu)選幼蟲。
在本發(fā)明的測定PPAE活性的方法中，與X-Arg-Y接觸的PPAE不受任何限制，只要求它是得自昆蟲的PPAE本身或含有這種PPAE。含PPAE物質(zhì)的優(yōu)選實(shí)例是昆蟲的體液。這種體液從易得性考慮一般是得自昆蟲體腔的血淋巴。
制取血淋巴的方法有很多。優(yōu)選方法包括將昆蟲置于冰上使其不活動，在其體腔內(nèi)注射生理鹽水，將昆蟲放置一會兒后從體腔內(nèi)采集血淋巴。所注射的生理鹽水中含有含蔗糖因子雜質(zhì)(甘蔗中所含的高分子物質(zhì)，由葡萄糖、氨基酸等組成)的蔗糖或蔗糖因子本身。以這種方式制取的血淋巴可以進(jìn)行離心而除去血細(xì)胞，再進(jìn)行透析而得到血漿備用。
本發(fā)明的測定PPAE活性的方法包括測定昆蟲體液中所含的PPAE與上述肽鏈X-Arg-Y接觸時產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物。
反應(yīng)產(chǎn)物的檢測可以用以X-Arg和Y中至少一種反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)或物理性質(zhì)為基礎(chǔ)的任何方法來進(jìn)行。
這種方法的實(shí)例包括光吸收測定法、比色法、熒光法(見“圖說熒光抗體”，軟科學(xué)公司)、發(fā)光法(見“酵素免疫測定法、蛋白質(zhì)核酸酵素”別冊Vol.31，pp251-263，共立出版(株))、核磁共振譜(見“酵素免疫測定法、蛋白質(zhì)核酸酵素”別冊vol.31，pp264-271，共立出版(株))。
具體列舉下列方法。
如果Y是生色基團(tuán)如對硝基苯胺基，則可用常規(guī)方法測定反應(yīng)前后系統(tǒng)光吸收的變化(吸收曲線);如果Y是熒光基團(tuán)如β-萘氨基，則可用常規(guī)方法測定反應(yīng)前后系統(tǒng)熒光強(qiáng)度的變化。如果Y是用同位素如14C或3H標(biāo)記的有機(jī)殘基，則可先根據(jù)X-Arg和Y的不同性質(zhì)如分子量、疏水性和親水性進(jìn)行液相色譜或電泳分離，然后再根據(jù)所用同位素的種類用某種檢測方法測定Y的存在。如果Y是有磁性的有機(jī)殘基，則可通過磁粉的作用將X-Arg-Y固定在固相載體上，根據(jù)X-Arg從X-Arg-Y中釋放的量來進(jìn)行測定。
即使Y不具有檢測特異性如熒光，也可先根據(jù)諸如分子量、疏水性等不同性質(zhì)用液相色譜法或電泳法分離X-Arg和Y，然后通過測定光吸收來進(jìn)行檢測。如果X-Arg在顯色、熒光、發(fā)光、放射性等方面具有特異性質(zhì)，也可以用根據(jù)它所具有的性質(zhì)而適當(dāng)選擇的檢測方法測定X-Arg的生成量或X-Arg-Y的殘留量。
如果X是用酶標(biāo)記的，則可測定由于X-Arg或X-Arg-Y與能夠起標(biāo)記酶的底物作用的物質(zhì)接觸而引起的底物變化，從而測定PPAE活性。例如，如果X是用過氧化物酶標(biāo)記的，則使用5-氨基水楊酸或鄰苯二胺作底物時優(yōu)選測定光吸收的變化(比色法);使用3-(對羥基苯基)丙酸時優(yōu)選熒光法;使用魯米諾時優(yōu)選發(fā)光法。另外，如果X是用堿性磷酸酶標(biāo)記的，則使用對硝基苯基磷酸作底物時優(yōu)選比色法;使用4-甲基-7-羥基香豆素基磷酸時優(yōu)選熒光法;使用4-甲氧基-4-(3-磷酸苯基)螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-金剛烷]二鈉鹽(AMPPD)時優(yōu)選發(fā)光法。
本發(fā)明的測定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法[測定(2)]包括使用用如下方法測定的PPAE活性作指標(biāo)至少測定proPO活化系統(tǒng)和β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖與上述式(Ⅰ)的肽鏈接觸時產(chǎn)生的X-Arg或Y。
也就是說，測定(2)利用了上述測定(1)來檢測用作指標(biāo)的PPAE活性，其中用PPAE活性作指標(biāo)來測定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖，該P(yáng)PAE活性是由于β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的存在使proPO活化系統(tǒng)活化而誘導(dǎo)出來的。
proPO活化系統(tǒng)含有能特異識別β-1，3-葡聚糖的組分和/或能特異識別肽聚糖的組分。在proPO活化系統(tǒng)中，反應(yīng)鏈由于β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的存在而受到觸發(fā)，由于一系列酶的作用而最終活化至少三個前體，即proBAEE酶(具有水解苯甲酰精氨酸乙酯活性的酶的前體)、proPPAE(活化proPO的絲氨酸蛋白酶的前體)、以及proPO，該系統(tǒng)是一個級聯(lián)。
本發(fā)明的測定(2)所用的proPO活化系統(tǒng)可以是proPO活化系統(tǒng)本身，也可以含有proPO活化系統(tǒng)。含proPO活化系統(tǒng)的物質(zhì)的優(yōu)選實(shí)例是昆蟲的體液。
昆蟲體液的例子是上述的得自昆蟲體腔的血淋巴。制取血淋巴的方法和所用昆蟲的種類如前所述。
作為本發(fā)明測定對象的β-1，3-葡聚糖的例子包括(但不限于)帶有β-1，3-鍵的葡萄糖聚合物或其衍生物，例如酵母聚糖、凝乳聚糖、茯苓聚糖、鞏膜聚糖(sclerotan)、蘑菇多糖、裂裥菌素、choriolan、昆布聚糖、地衣聚糖及其衍生物。
同樣是本發(fā)明測定對象的肽聚糖不受具體限制，其實(shí)例是構(gòu)成各種細(xì)菌細(xì)胞壁的組分，例如屬于微球菌屬、鏈球菌屬、金色桿菌屬、芽孢桿菌屬和土壤桿菌屬的細(xì)菌。
本發(fā)明的測定(2)旨在特異性地檢測和定量測定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖。根據(jù)這一方法，有可能鑒定含有β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的樣品，或定量測定樣品中的β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖。
測定(2)旨在測定反應(yīng)混合物中的PPAE活性，其測定方法是按照上述測定(1)，測定由可能含有β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的樣品組成的溶液、含有式(Ⅰ)肽鏈的溶液及含有proPO活化系統(tǒng)(優(yōu)選昆蟲體液)的溶液中，經(jīng)過一定的反應(yīng)時間后產(chǎn)生的X-Arg或Y。
所用的肽鏈只需具有可檢測的濃度，并根據(jù)測定系統(tǒng)而適當(dāng)制備。proPO活化系統(tǒng)的量只需是能使proPO級聯(lián)產(chǎn)生作用的量，這一量根據(jù)測定方法來適當(dāng)調(diào)節(jié)。
反應(yīng)pH一般為4-11，優(yōu)選6-9?？梢杂镁彌_液來維持所述pH，該緩沖液的種類和濃度不受任何特殊限制，只要求它對反應(yīng)沒有不利影響，其實(shí)例包括磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和Good緩沖液。
反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間也不受任何限制，只要求能使反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)溫度一般為0-50℃，優(yōu)選4-30℃。反應(yīng)時間一般為1秒至20小時，優(yōu)選10秒至2小時。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的測定系統(tǒng)中應(yīng)含有0.001-1000mM，優(yōu)選5-100mM二價金屬離子，如Ca2+或Mg2+。
如果在要用測定(2)測定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的樣品中含有β-1，3-葡聚糖和肽聚糖，則所得到的PPAE活性以β-1，3-葡聚糖和肽聚糖的總和表示。
本發(fā)明的測定(3)特異檢測和定量測定β-1，3-葡聚糖，本發(fā)明的測定(4)特異檢測和定量測定肽聚糖。
測定β-1，3-葡聚糖的測定(3)就是上述的測定(2)，但其中使用的proPO活化系統(tǒng)已去除了與肽聚糖特異反應(yīng)的組分。與肽聚糖特異反應(yīng)的組分的例子有肽聚糖識別蛋白。
測定肽聚糖的測定(4)就是上述的測定(2)，但其中使用的proPO活化系統(tǒng)已去除了與β-1，3-葡聚糖特異反應(yīng)的組分。與β-1，3-葡聚糖特異反應(yīng)的組分的例子有β-1，3-葡聚糖識別蛋白。
從proPO活化系統(tǒng)中去除與肽聚糖或β-1，3-葡聚糖特異反應(yīng)的組分的方法，包括生化領(lǐng)域常用的分離和純化方法，例如凝膠過濾、電泳、親和色譜、離子交換色譜和離心。作為除去與肽聚糖特異反應(yīng)的組分的方法，可以舉出使用結(jié)合有肽聚糖的載體的親和色譜法(美國專利4，970，152)，作為除去與β-1，3-葡聚糖特異反應(yīng)的組分的方法，可以舉出使用結(jié)合有β-1，3-葡聚糖的載體的親和色譜法(美國專利4，970，152)。
根據(jù)本發(fā)明，可以精確地定量測定PPAE活性，并可提供一種高度精確的測定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，其中用所述PPAE活性作指標(biāo)。
此外，借助本發(fā)明可以不經(jīng)培養(yǎng)增殖而對真菌和細(xì)菌進(jìn)行檢測，這樣便有可能對微生物感染進(jìn)行早期診斷。本發(fā)明可以應(yīng)用于廣泛的用途，例如水和食品的微生物污染檢驗(yàn)、治療劑如抗生素和注射制劑的安全檢驗(yàn)等。
本發(fā)明用下列示例性實(shí)施例和參考例更詳細(xì)地說明，但這些實(shí)施例和參考例決不限制本發(fā)明。
參考例1養(yǎng)殖家蠶proPO的PPAE識別一切割位點(diǎn)的氨基酸順序的鑒定(1)從養(yǎng)殖家蠶幼蟲中純化proPO在約200ml得自五齡養(yǎng)殖家蠶幼蟲的血淋巴中，加入飽和硫酸銨(pH6.5)，得到70%硫酸銨溶液，將該溶液于4℃下放置過夜。向其中加入0.2M磷酸鉀緩沖液(pH6.5)，得到40%硫酸銨溶液。將該溶液小心攪拌2小時并放置，然后于8000rpm下離心20分鐘(日立RPR9-2轉(zhuǎn)子，下同)，得到上清液。然后在上清液中加入飽和硫酸銨(pH6.5)，得到50%硫酸銨溶液，將該溶液放置過夜。將該溶液于8000rpm下離心20分鐘使其發(fā)生沉淀。將沉淀物溶解于0.1M磷酸鉀緩沖液(pH6.5)-20%硫酸銨溶液(pH6.5)中，再向其中加入飽和硫酸銨(pH6.5)，得到38%硫酸銨溶液。將混合物攪拌1小時，放置2.5小時，并以10000rpm離心20分鐘，得到上清液。向其中加入飽和硫酸銨(pH6.5)，得到48%硫酸銨溶液。將混合物攪拌30分鐘，放置過夜，并于8000rpm離心20分鐘使其沉淀。將沉淀物溶解于0.01M磷酸鉀緩沖液中，并用相同緩沖液透析。
將經(jīng)過透析的樣品以12000rpm離心20鐘，所得上清液在65℃水浴中攪拌溫?zé)嶂?4.5℃，然后在55℃水浴中再溫?zé)?分鐘。用冰迅速冷卻后，將樣品以18000rpm離心20分鐘，得到上清液。
對上清液進(jìn)行DEAE纖維素柱色譜(日本和光純藥工業(yè)株式會社制造，φ1.5×19cm)，用KCl梯度進(jìn)行洗脫以進(jìn)行分級分離。檢查每個部分用粗制PPAE活化后產(chǎn)生的可能的PO活性，借此來收集proPO部分。將所得的proPO部分用0.04MKCl-0.01M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)透析。
對樣品進(jìn)行羥磷灰石柱色譜(日本和光純藥工業(yè)株式會社制造，φ1.5×9.3cm)，并用50mM、75mM或95mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)洗脫。用上述方法測定所得各部分中的PO活性。結(jié)果證實(shí)在50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中洗脫出了proPO，并回收了其各部分。
將各部分在Sartrius公司的Collodion Bag(SM13200)中濃縮，并用0.01M Tris-HCl緩沖液(pH7.75)透析，得到純化的proPO溶液。
(2)PPAE的純化將五齡養(yǎng)殖家蠶幼蟲的表皮勻漿液用硫酸銨進(jìn)行分級分離，并回收0.2-0.4%硫酸銨部分。將各部分用0.01M Tris-HCl-0.01M CaCl2緩沖液(pH8.5)透析，然后用0.01M Tris-HCl緩沖液(pH8.5)透析。將經(jīng)過透析的溶液倒在DEAE纖維素柱上，并用0.01M Tris-HCl緩沖液(pH8.5)洗脫。回收顯示PPAE活性的部分并加到羥磷灰石柱上。所得各部分用0.01M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)洗滌，再用0.01M-0.5M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)線性梯度洗脫。收集顯示PPAE活性的各部分并作為純化的PPAE溶液使用。
(3)用PPAE切割proPO而得到的肽片段的氨基酸順序分析將上述純化的proPO與純化的PPAE一起保溫。將反應(yīng)混合物加到Sephadex G-50柱上，用0.01M磷酸鉀緩沖液(pH8.0)洗脫，并回收從proPO上切割并釋放出的肽鏈。用ODS柱將這些肽鏈分成三個片段(fⅠ、fⅡ、fⅢ)。用Lys-內(nèi)肽酶處理這些片段使其斷裂，并用埃德曼降解法檢查其氨基酸順序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，fⅠ和fⅡ具有相同的順序(順序表中的2號順序)，但略有不同，fⅢ具有不同的順序(順序表中的1號順序)。
(4)用PPAE切割上述來自proPO的肽而產(chǎn)生的PO的N末端氨基酸順序分析將0.01M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中的proPO、硫脲和75mM磷酸鉀(pH7.5)中的PPAE于0℃下保溫3小時，將所有proPO轉(zhuǎn)化為PO。用ODS柱將反應(yīng)混合物分成兩個主要部分，用埃德曼降解法鑒定每個N末端的氨基酸順序(順序表中的3號和4號順序)。
參考例2家蠶proPO上的PPAE識別一切割位點(diǎn)的DNA堿基順序的鑒定(1)養(yǎng)殖家蠶cDNA文庫的構(gòu)建由500只五齡養(yǎng)殖家蠶幼蟲制取體液(25ml)并離心(40G，15分，4℃)分離血細(xì)胞。利用RNA提取試劑盒ISOGEN(日本和光純藥工業(yè)株式會社制造)從血細(xì)胞中制得約800μg總RNA。
利用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)由總RNA制得mRNA，利用cDNA合成試劑盒(Pharmacia)合成cDNA。將合成的cDNA克隆到λZAPⅡ噬菌體載體的EcoRI位點(diǎn)中，并利用Gigapack Gold包裝提取物(Stratagene)進(jìn)行體外包裝。結(jié)果得到4.2×105噬斑形成單位(PFU)的噬菌體文庫。
(2)proPO克隆的篩選利用PicoBlueTM免疫篩選試劑盒(Stratagene)進(jìn)行篩選。
將養(yǎng)殖家蠶cDNA噬菌體文庫(1.5×104PFU)與200μ1大腸桿菌XL-1 Blue(OD600約為0.5)混合，將該混合物于37℃下保溫15分鐘，然后接種在NZY平皿中(1.5%瓊脂、1%NZ胺、0.2%MgSO4·7H2O、0.5%細(xì)菌酵母提取物、0.5%NaCl、12.5μg/ml四環(huán)素，pH7.5)，于42℃下培養(yǎng)約3.5小時。出現(xiàn)噬斑后，在其上放一塊浸漬有10mM IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)的硝酸纖維素濾膜(Amersham)，再于37℃下培養(yǎng)3.5小時。然后用鑷子小心取下硝酸纖維素濾膜，用TBST[20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%(V/V)吐溫20]洗滌15分鐘，共洗滌3-5次。
為了每個平皿制備兩塊待篩選影印濾膜，取下第一塊濾膜后在平皿上放上另一塊浸漬有10mM IPTG的硝酸纖維素濾膜，于37℃下保溫4小時。第二塊濾膜按與第一塊濾膜相同的方式進(jìn)行洗滌。
對20個平皿進(jìn)行同樣的操作，制得總共帶有3.0×105個噬斑的影印濾膜。
將這些濾膜置于封閉液[1%BSA、20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl]中小心振蕩1小時，轉(zhuǎn)移到用封閉液適當(dāng)稀釋的抗proPO兔抗體溶液中，并在室溫下小心振蕩1小時。將經(jīng)過了初級反應(yīng)的影印濾膜用TBST洗滌3-5次，每次洗5分鐘，再置于用封閉液適當(dāng)稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔IgG羊抗體溶液中，于室溫下小心振蕩1小時以進(jìn)行次級反應(yīng)。反應(yīng)后，將混合物用TBST洗滌3-5次，每次洗5分鐘，再用TBS[20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1%BSA]洗滌5分鐘。用濾紙吸去影印濾膜上的水滴，并將影印濾膜置于顯色液
中顯色。
從平皿上挑下相應(yīng)于硝酸纖維素濾膜上藍(lán)色位置的噬斑，進(jìn)行次級篩選和三級篩選，從而進(jìn)行純化，最終得到8個克隆。
(3)亞克隆利用輔助噬菌體的作用從λZAPⅡ中自動切下克隆到其中的DNA片段，并重新環(huán)化。因此進(jìn)行下列操作以亞克隆到pBluescript SK(-)噬粒載體中。
將λZAPⅡ重組噬菌體(100μl，＞1×105PFU)、大腸桿菌XL-1 Blue(200μl，OD600約為1.0)和ExAssist輔助噬菌體(1μl，＞1×106PFU)混合，并于37℃下保溫15分鐘。向其中加入3ml2×YT培養(yǎng)基(1%NaCl、1%酵母提取物、1.6%細(xì)菌胰胨)，將該混合物振蕩培養(yǎng)2.5小時，然后于70℃下保溫20分鐘。將該混合物離心(4000×g，15分鐘，室溫)得到上清液。從上清液中取一份試樣(1μl)與200μl大腸桿菌SOLRTM(OD600約為1.0)混合，將該混合物于37℃下保溫15分鐘，并鋪在LB/Amp平板上(1.5%瓊脂、1%NaCl、1.6%細(xì)菌胰胨、0.5%酵母提取物、50μg/ml氨芐青霉素)。選出單個克隆(pPO2、pPO3、pPO4、pPO5、pPO6、pPO8、pPO17、pPO20)。
(4)proPO克隆堿基順序的鑒定對亞克隆后的克隆畫出限制酶切割圖譜。鑒于pPO2、pPO3、pPO4、pPO8、pPO17和pPO20有相似的限制酶位點(diǎn)，認(rèn)為它們克隆的是同一蛋白，選擇pPO17作為代表。此外，認(rèn)為pPO5和pPO6克隆了不同的蛋白，而pPO6是pPO2等的部分克隆。因此選擇pPO5作為另一個候選物。
為了找出proPO上可能的PPAE切割位點(diǎn)，鑒定了pPO5和pPO17的推定含有切割位點(diǎn)的cDNA插入片段5′端的堿基順序。利用Taq DyeDeoxyTM終止循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems Corp.)和Ampli TaqRDNA聚合酶，以重組質(zhì)粒DNA作模板鑒定堿基順序，然后用ABI 373A DNA測序儀進(jìn)行分析。對照參考例1的氨基酸順序檢查所獲得的順序(順序表中的5號和6號順序)。決定將參考例1中得到的肽進(jìn)行組合，鑒定出proPO上被PPAE識別和切割的區(qū)域的氨基酸順序。所述氨基酸順序及其相應(yīng)密碼子如下面順序表中的5號和6號順序所示。
由這些順序明顯可見，pPO5和pPO17這兩個克隆具有不同的順序，表明被PPAE識別和切割的proPO蛋白有兩種。
實(shí)施例1PPAE活性的測定(1)肽的合成利用Fmoc-Gly-Alko樹脂(由Watanabe Kagaku Kogyo制造)，用肽合成儀(PSSM-8型，Shimadzu公司制造)合成具有下列順序的肽2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH
其中2-Pyr為2-吡啶基。
用以下方法進(jìn)行肽合成用30%哌啶的DMF溶液處理Fmoc-Gly-Alko樹脂的Fmoc基團(tuán)(9-芴基甲氧羰基)，從而釋放出末端氨基，再在BOP試劑存在下依次縮合Fmoc-Phe、Fmoc-Arg、Fmoc-Asn、Fmoc-Asn、Fmoc-Leu和供引入2-吡啶氨基的2-Pyr-Ala。
用甲醇洗滌結(jié)合有所得肽鏈的樹脂，然后干燥。然后將樹脂浸入三氟乙酸(950μl)和苯硫基甲烷(50μl)的溶液中1小時，從而釋放出肽。將肽用三氟乙酸洗滌，回收濾液。在濾液中加入無水乙醚，將所得白色沉淀物離心(2000rpm，6分鐘，4℃)并減壓干燥。為進(jìn)行進(jìn)一步純化，將白色沉淀溶解于30%乙酸中，并加到5C18反相色譜柱上(日本和光純藥工業(yè)株式會社制造)，將得到的主要部分冷凍干燥。臨用前，將該部分溶解于0.01M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中作為合成肽溶液使用。
(2)PPAE的純化制取約500只五齡養(yǎng)殖家蠶幼蟲的表皮(約100g)，用冷蒸餾水洗滌，然后勻漿。對所得勻漿液按圖1的反應(yīng)方案進(jìn)行硫酸銨分級分離。
通過觀察由于PPAE對proPO底物的作用而產(chǎn)生的PO活性，檢查每個硫酸銨部分中的可能PPAE活性。為了證實(shí)該P(yáng)O活性來源于所加的proPO，還檢查了不含proPO的同一部分的PO活性。測定這些PO活性的方法是用DOPA作底物，測定由于所產(chǎn)生的多巴色素顯色所致的490nm處的光吸收。
結(jié)果，在上清液1、沉淀物2、上清液3和沉淀物4(見圖1)中測得PPAE活性(產(chǎn)生PO活性)，而在上清液1和沉淀物2中測得很大程度的原有PO活性，在上清液3中測得某種程度的原有PO活性。因此認(rèn)為，沉淀物4是PPAE部分。將該部分用0.01M Tris-HCl緩沖液(pH8.5)透析，并作為PPAE溶液使用。
(3)用液相色譜法測定PPAE活性將合成肽以適當(dāng)濃度溶于0.01M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中的溶液(50μl)，與濃度為0.36mg/ml的PPAE溶于0.01MTris-HCl緩沖液(pH8.5)中的溶液(50μl)混合，將該混合物于30℃下加熱10分鐘。從中取一份試樣(10μl)進(jìn)行液相色譜分析[柱Wakosil-5C18(4.6內(nèi)徑×250mm，日本和光純藥工業(yè)株式會社制造);柱溫40℃;流動相A緩沖液(50mM AcONH4(pH6.0)-10%乙腈);B緩沖液(50mM AcONH4(pH6.0)-50%乙腈);梯度B緩沖液0→50%(0→15分鐘);流速1.5ml/分;檢測Ex305nm，Em376nm](圖2-A)。作為對照，取上述合成肽溶液(50μl)和0.01M Tris-HCl緩沖液(50μl，pH8.5)的混合物(圖2-B)，以及0.01M磷酸鉀緩沖液(50μl，pH7.0)和上述PPAE溶液(50μl)的混合物(圖2-C)，以同樣方式進(jìn)行處理并進(jìn)行液相色譜。結(jié)果證實(shí)了切割后的合成肽部分。也就是說，在圖2-A的液相色譜分析中，在7.225分的保留時間處出現(xiàn)了一個代表切割后的合成肽部分的峰，并可測出PPAE活性。
(4)PPAE濃度與活性的相關(guān)將合成肽以適當(dāng)濃度溶于0.01M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中溶液(50μl)，與濃度為0、0.18、0.36或0.72mg/ml的PPAE溶于0.01M Tris-HCl緩沖液(pH8.5)中的溶液(50μl)混合，將該混合物于30℃下加熱5分鐘。從中取一份試樣(10μl)進(jìn)行液相色譜分析。取切割后的合成肽部分的峰面積作為PPAE活性值，考察該活性與PPAE濃度之間的相關(guān)性。結(jié)果證實(shí)了明顯的相關(guān)性(圖3)，這樣便能夠利用該肽來定量測定PPAE活性。
參考例3SLP溶液的制備將養(yǎng)殖家蠶幼蟲(五齡)置于冰上10分鐘使其停止運(yùn)動，在第五和第六個腹節(jié)之間注射20mM從甘蔗中純化出的蔗糖的溶液，注射量為幼蟲體重的一半。用縫合線在幼蟲的第五個腹節(jié)前結(jié)扎，使注射液保持在幼蟲體內(nèi)，在室溫下放置20分鐘。然后切下第三腹節(jié)處的附肢，從中回收血淋巴。
將回收的血淋巴在低溫下以1500G離心5分鐘以除去血細(xì)胞。所得上清液(約100ml)用含有0.1mM MOPS[3-(N-嗎啉代)丙磺酸]、0.1M KCl和1%木糖醇的溶液(3升)在低溫下透析2天，得到SLP溶液。
實(shí)施例2β-1，-3葡聚糖的測定(1)利用養(yǎng)殖家蠶幼蟲的血淋巴(SLP)測定β-1，3-葡聚糖使用羧甲基凝乳聚糖(CM-凝乳聚糖)作為典型的β-1，3-葡聚糖。將實(shí)施例1(1)中得到的合成肽以適當(dāng)濃度溶于0.01M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中的溶液(10μl)、SLP溶于0.1M MOPS[3-(N-嗎啉代)丙磺酸]、0.1M KCl和1%木糖醇中的溶液(5μl)、10mM苯硫脲(10μl)、80mM CaCl2(15μl)、1mg/ml CM-凝乳聚糖(5μl)、0.01M Tris-HCl緩沖液(100μl，pH8.5)和蒸餾水(55μl)混合在一起，將該混合物于25℃下加熱25分鐘。從中取一份試樣(10μl)進(jìn)行液相色譜分析[柱Wakosil-5C18(4.6×250mm)，日本和光純藥工業(yè)株式會社制造);柱溫40℃;流動相A緩沖液(50mM AcONH4(pH6.0)-10%乙腈);B緩沖液(50mM AcONH4(pH6.0)-50%乙腈);梯度B緩沖液0→50%(0→15分鐘);流速1.5ml/分;檢測Ex 305nm，Em376nm](圖4-A)。作為對照，取具有上述組成但額外加入5μl蒸餾水代替1mg/ml CM-凝乳聚糖的混合物(圖4-B)，以相同方式進(jìn)行處理并進(jìn)行液相色譜。結(jié)果在6.279分的保留時間處出現(xiàn)一個代表切割后的合成肽部分的峰，并檢測到β-1，3-葡聚糖。所用的SLP溶液是用參考例3所述的方法制備的。
(2)β-1，3-葡聚糖濃度和活性的相關(guān)使用CM-凝乳聚糖作為典型的β-1，3-葡聚糖。
在合成肽以適當(dāng)濃度溶于0.01M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中的溶液(10μl)、SLP溶于0.1M MOPS、0.1M KCl和1%木糖醇中的溶液(5μl)、10mM苯硫脲(10μl)、80mM CaCl2(15μl)、0.01M Tris-HCl緩沖液(100μl，pH8.5)和蒸餾水(55μl)的混合物中，以0、0.1、0.25、0.5或1.0mg/ml的濃度加入CM-凝乳聚糖(5μl)，將該混合物于25℃下加熱25分鐘。從中取一份試樣(10μl)進(jìn)行液相色譜分析。取切割后的合成肽部分的峰面積作為PPAE活性值，并考察該活性與CM-凝乳聚糖濃度之間的相關(guān)性。結(jié)果證實(shí)了明顯的相關(guān)性(圖5)，這樣便能夠利用所述肽定量測定β-1，3-葡聚糖。
實(shí)施例3利用養(yǎng)殖家蠶幼蟲的體液(SLP)測定肽聚糖在下列測試中，使用通過超聲破碎Micrococcus lysodeikticus(IFO3333)而制得的肽聚糖作為典型的肽聚糖。
將SLP溶于0.1M MOPS、0.1M KCl和1%木糖醇中的溶液(80μl)、80mM CaCl2(7.5μl)、0.3mg/ml肽聚糖溶液(10μl)和蒸餾水(2.5μl)混合，將該混合物于30℃下加熱10分鐘。向其中依次加入并混合0.5M EDTA(5μl)、1M Tris-HCl緩沖液(5μl，pH8.5)和實(shí)施例1(1)中制備的合成肽溶液(10μl)，并調(diào)至適當(dāng)?shù)臐舛?。將該混合物?0℃下加熱30分鐘。反應(yīng)后，從混合物中取50μl進(jìn)行液相色譜分析(分析條件與實(shí)施例2中分析β-1，3-葡聚糖的條件相同)(圖6-A)。作為對照，取具有上述組成但額外加入10μl蒸餾水代替0.3mg/ml肽聚糖溶液的混合物(圖6-B)，以相同的方式進(jìn)行處理并進(jìn)行液相色譜。結(jié)果，只在加入肽聚糖時才在4.36分的保留時間處出現(xiàn)一個代表切割后的合成肽部分的峰(圖6-A)，這樣便能夠利用合成肽來測定肽聚糖。所用的SLP溶液是用參考例3所述的方法制備的。
參考例4PPAE的底物特異性合成出四種肽鏈并將其溶于蒸餾水中使其濃度達(dá)到0.5mg/ml。這四種肽鏈為Ala-Leu-Asn-＊-Arg-Phe-Gly，其中＊為Asn、Asp、Ser或Gly，并在N末端引入了2-吡啶基。向所得溶液(各125μl)中加入10μg/ml PPAE(25μl)、1M Tris-HCl緩沖液(25μl，pH8.5)、5M NaCl(25μl)和蒸餾水(50μl)，使該混合物在25℃下反應(yīng)0、15或30分鐘。在每個反應(yīng)中取出80μl反應(yīng)混合物，向其中加入50%乙酸(20μl)終止反應(yīng)。向其中加入蒸餾水(100μl)并混合。從中取一份試樣(100μl)進(jìn)行液相色譜分析。計算該分析測得的代表合成肽Ala-Leu-Asn-＊-Arg-Phe-Gly的峰面積每15分鐘減少的百分率，并以該百分率作為底物減少百分率。比較四種肽的所得減少百分率。結(jié)果示于表1。
表1底物Ala-Leu-Asn-＊-Arg-Phe-Gly*代表的氨基酸 底物減少(%)(15分鐘反應(yīng)) 表觀反應(yīng)速度(納摩爾/μg PPAE/分)Asn 27.7 2.05Asp 26.6 1.96Ser 10.3 0.77Gly 2.3 0.18由表1明顯可見，當(dāng)＊代表的氨基酸為Gly時，底物減少百分率較小，PPAE反應(yīng)速度降低。
結(jié)果是，當(dāng)＊代表的氨基酸為Gly時，該肽不適于作為PPAE活性測定的底物使用。
順序表順序號1順序長度22順序類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性順序種類肽順序 順序號2順序長度11順序類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性順序種類肽順序Tyr Gln Arg Val Ser Asn Ala Ile Gly Asn Arg1 5 10順序號3順序長度22順序類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性順序種類肽順序
順序號4順序長度10順序類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性順序種類肽順序Phe Gly Ser Asp Ala Gly Arg Met Ile Pro1 5 10順序號5順序長度132順序類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性順序種類cDNA來源生物體家蠶順序特征顯示特征的符號CDS位置未知測定特征的方法E顯示特征的符號peptide位置未知測定特征的方法E順序
順序號6順序長度63順序類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性順序種類cDNA來源生物體家蠶順序特征顯示特征的符號CDS位置未知測定特征的方法E顯示特征的符號peptide位置未知測定特征的方法E順序

權(quán)利要求
1.一種測定酚氧化酶原活化酶活性的方法，該方法包括(1)使酚氧化酶原活化酶與式(Ⅰ)所示的肽鏈反應(yīng)其中X為帶有任選保護(hù)的α-氨基的任選標(biāo)記的氨基酸殘基，或者帶有任選保護(hù)的N末端的任選標(biāo)記的肽殘基，條件是鄰接Arg的氨基酸殘基不是Gly或Ala；Y為能夠通過酰胺鍵或酯鍵與Arg的羧基結(jié)合的有機(jī)殘基，或者帶有任選保護(hù)的α-羧基的任選標(biāo)記的氨基酸殘基，或者帶有任選保護(hù)的C末端的任選標(biāo)記的肽殘基；該肽鏈能夠被得自昆蟲的酚氧化酶原活化酶水解X-Arg和Y；(2)測定由式(Ⅰ)所示的肽鏈和酚氧化酶原活化酶之間的反應(yīng)產(chǎn)生的X-Arg和Y中至少一種的量；(3)根據(jù)(2)中測得的量確定酚氧化酶原活化酶的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中X為下式所示的基團(tuán)X′-Asn其中X′為帶有任選保護(hù)的α-氨基的任選標(biāo)記的氨基酸殘基，或者帶有任選保護(hù)的N末端的任選標(biāo)記的肽殘基，條件是X′的氨基酸數(shù)目為X的氨基酸數(shù)目減1，或者X′為Asn的α-氨基的保護(hù)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中Y為下式所示的基團(tuán)Phe-Gly-Z其中Z為帶有任選保護(hù)的α-羧基的任選標(biāo)記的氨基酸殘基，或帶有任選保護(hù)的C末端的任選標(biāo)記的肽殘基，條件是Z的氨基酸數(shù)目為Y的氨基酸數(shù)目減2，或者Z為Gly的羧基的保護(hù)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中根據(jù)X-Arg或Y的性質(zhì)，用以紫外或可見光吸收、發(fā)光、熒光、放射性或磁性為基礎(chǔ)的方法，測定X-Arg和Y中至少一種的量。
5.一種測定β-1，3-葡聚糖、肽聚糖或其混合物的方法，該方法包括(1)使酚氧化酶原活化系統(tǒng)與β-1，3-葡聚糖、肽聚糖或其混合物及式(Ⅰ)所示的肽鏈接觸其中X為帶有任選保護(hù)的α-氨基的任選標(biāo)記的氨基酸殘基，或者帶有任選保護(hù)的N末端的任選標(biāo)記的肽殘基，條件是鄰接Arg的氨基酸殘基不是Gly或Ala;Y為能夠通過酰胺鍵或酯鍵與Arg的羧基結(jié)合的有機(jī)殘基，或者帶有任選保護(hù)的α-羧基的任選標(biāo)記的氨基酸殘基，或者帶有任選保護(hù)的C末端的任選標(biāo)記的肽殘基;該肽鏈能夠被得自昆蟲的酚氧化酶原活化酶水解成X-Arg和Y;(2)測定由式(Ⅰ)所示的肽鏈與酚氧化酶原活化系統(tǒng)和β-1，3-葡聚糖、肽聚糖或其混合物接觸而產(chǎn)生的X-Arg和Y中至少一種的量;(3)根據(jù)(2)中測得的量確定酚氧化酶原活化酶的活性;(4)用(3)中確定的酚氧化酶原活化酶活性作為指標(biāo)，確定β-1，3-葡聚糖、肽聚糖或其混合物的量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中X為下式所示的基團(tuán)X′-Asn其中X′為帶有任選保護(hù)的α-氨基的任選標(biāo)記的氨基酸殘基，或者帶有任選保護(hù)的N末端的任選標(biāo)記的肽殘基，條件是X′的氨基酸數(shù)目為X的氨基酸數(shù)目減1，或者X′為Asn的α-氨基的保護(hù)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中Y為下式所示的基團(tuán)Phe-Gly-Z其中Z為帶有任選保護(hù)的α-羧基的任選標(biāo)記的氨基酸殘基，或帶有任選保護(hù)的C末端的任選標(biāo)記的肽殘基，條件是Z的氨基酸數(shù)目為Y的氨基酸數(shù)目減2，或者Z為Gly的羧基的保護(hù)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中根據(jù)X-Arg或Y的性質(zhì)，用以紫外或可見光吸收、發(fā)光、熒光、放射性或磁性為基礎(chǔ)的方法，測定X-Arg和Y中至少一種的量。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項的方法，其中酚氧化酶原活化系統(tǒng)不含與肽聚糖特異反應(yīng)的組分。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項的方法，其中酚氧化酶原活化系統(tǒng)不含與β-1，3-葡聚糖特異反應(yīng)的組分。
全文摘要
一種測定酚氧化酶原活化酶(PPAE)活性的方法，該方法包括至少測定PPAE與式X-Arg-Y的肽鏈接觸而產(chǎn)生的A-Arg或Y，其中X和Y如說明書中所限定。根據(jù)本發(fā)明，可以精確地定量測定PPAE活性，并可提供一種高度精確的測定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，其中用所述PPAE活性作指標(biāo)。此外，本發(fā)明可以不經(jīng)培養(yǎng)增殖而對真菌和細(xì)菌進(jìn)行檢測，這樣便有可能對微生物感染進(jìn)行早期診斷。本發(fā)明可應(yīng)用于廣泛的用途，例如水和食品的微生物感染檢驗(yàn)、治療劑如抗生素和注射制劑的安全檢驗(yàn)等。
文檔編號C12Q1/37GK1108696SQ9411604
公開日1995年9月20日 申請日期1994年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月18日
發(fā)明者蘆田正明, 川端智久, 平安一成, 土谷正和 申請人:和光純藥工業(yè)株式會社