專利名稱：用于測(cè)量磷酸修飾酶活性的測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)催化磷酸修飾的酶的生物檢測(cè)。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化通常被細(xì)胞用作應(yīng)對(duì)外來刺激的常用信號(hào)傳 導(dǎo)機(jī)制。進(jìn)行這些磷酸修飾的蛋白質(zhì)是被稱為激酶(磷酸化)和磷酸酶(脫磷 酸化)的酶。根據(jù)被磷酸化(或脫磷酸化)的氨基酸殘基，激酶和磷酸酶被分
為兩個(gè)家族酪氨酸激酶(磷酸酶)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(磷酸酶)。其他在 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的酶包括產(chǎn)生環(huán)核苷酸(例如環(huán)AMP (cAMP)和 環(huán)GMP (cGMP))的環(huán)化酶和水解環(huán)核苷酸形成相應(yīng)非環(huán)單磷酸核苷酸(即 AMP和GMP)的磷酸二酯酶，所述環(huán)核苷酸環(huán)AMP(cAMP)和環(huán)GMP (cGMP)是重要的第二信使。因?yàn)樗鼈冊(cè)谡{(diào)節(jié)細(xì)胞功能中的重要作用，所有 這些酶是探索和開發(fā)新的藥物療法的重要靶分子。
傳統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的方法依賴于放射性"P-正磷酸的摻 入。3力-磷酸化的蛋白質(zhì)在凝膠上分離，然后用磷光顯像儀觀察?；蛘撸?磷酸化酪氨酸殘基可以通過結(jié)合放射性標(biāo)記抗-磷酸酪氨酸抗體，利用免疫 測(cè)定法例如免疫沉淀或者印跡進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)檫@些方法需要檢測(cè)放射性同 位素，它們是耗時(shí)的，而且由于處理放射性物質(zhì)時(shí)涉及安全問題，它們不 適合進(jìn)行超高通量篩選(uHTS)。
在最近的方法中，放射性免疫測(cè)定法被ELISA (酶聯(lián)免疫測(cè)定法)取代。
反應(yīng)后，通過抗-磷酸酪氨酸抗體與例如磷酸化的固定底物的結(jié)合來定量磷 酸化程度，所述抗體偶聯(lián)有增強(qiáng)酶例如過氧化物酶。
Epps等人(美國(guó)專利號(hào)6，203，994)描述了針對(duì)蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶的
熒光HTS測(cè)定法，利用了熒光標(biāo)記的磷酸化報(bào)告分子和特異結(jié)合磷酸化報(bào) 告分子的抗體。利用熒光偏振法，熒光猝滅法或者熒光關(guān)聯(lián)鐠法(FCS)檢 測(cè)結(jié)合。這種方法具有內(nèi)在缺陷，只有優(yōu)良類別的抗體(例如克隆PT66、 PY20, Sigma)才能用作磷酸酪氨酸底物。只有少量合適的抗-磷酸絲氨酸 或者抗-磷酸蘇氨酸抗體的實(shí)例被報(bào)道(例如Bader B.等人，Journal of
Biomolecular Screening, 6， 255 (2001), Panvera kit no. P2886).但是這些 抗體的特性是不僅識(shí)別磷酸絲氨酸而且識(shí)別相鄰氛基酸為抗原表位。但是
已知激酶作用對(duì)底物是非常特異的，底物序列可能差別很大。因此，抗-砩酸絲氨酸抗體不能用作類別試劑。
Perkin Elmer (Wallac)提供了測(cè)定酪氨酸激酶的方法，它基于時(shí)間分 辨熒光和從銪螯合物到別藻藍(lán)蛋白的能量轉(zhuǎn)移(參見EP 929 810)。由于使 用了抗體，此處該方法也僅限于酪氨酸激酶。
最近，Molecular Device (美國(guó)專利號(hào)7，070,921)提供表面帶有鎵陽離 子的納米顆粒作為類別結(jié)合試劑，所述結(jié)合試劑適于檢測(cè)激酶和磷酸酶活 性的磷酸化反應(yīng)，以及檢測(cè)環(huán)化酶和磷酸二酯酶活性的核苷酸環(huán)化和解環(huán) 反應(yīng)。
發(fā)明概述
本發(fā)明描述基于金屬離子銦(III)和鋯(IV)特異結(jié)合磷酸化分子的能力 來檢測(cè)催化其底物磷酸修飾的酶活性的測(cè)定法。該測(cè)定法可用于酶例如磷 酸化或者脫磷酸化多肽分子的激酶和磷酸酶，和用于酶例如環(huán)化或者解環(huán) 核苷酸分子的環(huán)化酶和磷酸二酯酶。
因此，本發(fā)明提供用于測(cè)定能夠催化底物磷酸修飾以生成產(chǎn)物的酶活 性的方法，所述方法包括在銦(III)離子或者鋯(IV)離子存在的條件下將底
物與酶接觸的步驟，其中銦(ni)離子或者鋯av)離子可以結(jié)合底物或者產(chǎn)
物但不能與兩者都結(jié)合；檢測(cè)銦(in)離子或者鋯(iv)離子和底物或者產(chǎn)物 之間的結(jié)合程度；將結(jié)合程度和酶活性對(duì)應(yīng)；其中酶選自激酶、磷酸酶、 環(huán)化酶和磷酸二酯酶組成的組。
本發(fā)明還提供篩選調(diào)節(jié)酶活性的物質(zhì)的方法，所述酶催化底物進(jìn)行磷 酸修飾生成產(chǎn)物，所述方法包括在存在或不存在所述物質(zhì)，以及存在銦(III)
離子或者鋯(IV)離子的條件下，將底物與酶接觸的步驟，其中銦(III)離子
或者鋯(iv)離子可以結(jié)合底物或者產(chǎn)物但不與兩者都結(jié)合；檢測(cè)銦(ni)離
子或者鋯(IV)離子和底物或者產(chǎn)物之間的結(jié)合程度；測(cè)定該物質(zhì)調(diào)節(jié)結(jié)合 程度的能力，所述結(jié)合程度與酶活性有關(guān)；其中酶選自激酶、磷酸酶、環(huán) 化酶和磷酸二酯酶組成的組。
通過考慮下面的發(fā)明詳述并結(jié)合示范性說明實(shí)施方案的附屬實(shí)例，將 更容易理解本發(fā)明的上述和其他優(yōu)點(diǎn)和特征以及完成相同內(nèi)容的方式。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示利用熒光偏振法作為檢測(cè)方法的磷酸二酯酶測(cè)定結(jié)果。(A) 利用不同濃度的鱗酸二酯酶或者(B)不同金屬離子(mP-毫極化單位 (millipolarisation))進(jìn)行測(cè)定。
圖2顯示利用熒光偏振法作為檢測(cè)方法的激酶測(cè)定法，其使用了未磷 酸化底物和磷酸化產(chǎn)物的滴定。
發(fā)明詳述 定義
術(shù)語"磷酸修飾"是指向或者從有機(jī)分子例如多肽引入(磷酸化)或者 除去(脫磷酸化)磷酸基團(tuán)，或者形成(環(huán)化)或者分解(解環(huán))核苷酸中連接磷 酸基團(tuán)和核苷的環(huán)。常見的環(huán)化分別是從ATP和GTP形成cAMP和 cGMP,通過從核苦三磷酸除去2個(gè)磷酸基團(tuán)，將殘留磷酸基團(tuán)的游離末 端與殘留單磷酸核苷中的糖結(jié)合。常見的解環(huán)反應(yīng)是分解環(huán)，分別從cAMP 和cGMP形成非環(huán)ATP和非環(huán)GTP。
術(shù)語"底物"是指催化磷酸修飾的酶的作用分子。術(shù)語"產(chǎn)物"是指 來自酶-催化的砩酸修飾的產(chǎn)物。
術(shù)語"激酶"是指能夠使底物磷酸化的酶。術(shù)語"磷酸酶"是指能夠
使底物脫磷酸化的酶。術(shù)語"磷酸二酯酶"是指催化環(huán)化核苷酸(例如cAMP 和cGMP)的3，-酯鍵水解形成非環(huán)單磷酸核苷的酶。術(shù)語"環(huán)化酶，，是指 催化從核苷三磷酸形成環(huán)化核苷酸(例如cAMP和cGMP)的酶。
術(shù)語"銦(HI)"可與"In(III)"和"In+3，，互換，是指具有未配對(duì)電子 和+3 (正3)電荷的銦離子。銦(III)離子可以在錮鹽例如氯化銦(InCl3)的水性 混合物中形成。術(shù)語"鋯(IV)"可與"Zr(IV)"和"Zr+4，，互換，是指具有 未配對(duì)電子和+4 (正4)電荷的鋯離子。鋯(IV)離子可以在鋯鹽例如氯化鋯 (ZrCU)的水性混合物中形成。
術(shù)語"熒光的"或者"熒光"是指電磁輻射的發(fā)射，通常是可見光， 其由物質(zhì)內(nèi)原子或者分子電磁輻射的光或者其他形式的激發(fā)引起。術(shù)語"熒 光響應(yīng)"是指表征熒光物質(zhì)的熒光的一個(gè)或者多個(gè)參數(shù)。
術(shù)語"熒光強(qiáng)度"是指熒光物質(zhì)發(fā)射的光的數(shù)量或者強(qiáng)度。術(shù)語"時(shí) 間分辨熒光強(qiáng)度"是指閃光激發(fā)后樣品的熒光強(qiáng)度監(jiān)控為時(shí)間函數(shù)。
術(shù)語"焚光猝滅"是指降低給定物質(zhì)熒光強(qiáng)度的任意方法。很多方法 可以導(dǎo)致猝滅，例如激發(fā)態(tài)反應(yīng)，能量轉(zhuǎn)移，復(fù)合物形成和碰撞幹滅。
術(shù)語"熒光共振能量轉(zhuǎn)移"描述了兩個(gè)熒光分子間的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制。 熒光供體在其特定熒光激發(fā)波長(zhǎng)被激發(fā)。通過遠(yuǎn)程偶極-偶極偶聯(lián)機(jī)制，這 個(gè)激發(fā)態(tài)然后被無放射的轉(zhuǎn)移到第二個(gè)分子，受體。該供體回到電子基態(tài)。 術(shù)語"時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移"是包括了時(shí)間函數(shù)的熒光共振能量轉(zhuǎn) 移的擴(kuò)展。
術(shù)語"熒光偏振"是指來自溶液或者顯樹:樣品的熒光偏振的測(cè)量；用 于提供關(guān)于分子大小、形狀，和構(gòu)象，分子各向異性，電子能量轉(zhuǎn)移，分 子作用，包括染料和輔酶結(jié)合，和抗原/抗體反應(yīng)的信息。
本發(fā)明提供檢測(cè)催化磷酸修飾的酶的活性的方法。這種酶包括分別磷 酸化和脫磷酸化多肽分子的激酶和磷酸酶，和分別環(huán)化和解環(huán)化核苷酸分 子的環(huán)化酶和磷酸二酯酶。本發(fā)明提供的檢測(cè)法適合于廣泛用途，包括， 不限于，生命科學(xué)研究，檢測(cè)開發(fā)，藥物開發(fā)和高通量篩選。
本發(fā)明的方法基于金屬離子，銦(III) (In,或者鋯(IV) (Zr")與磷酸化 多肽的磷酸基團(tuán)或者非環(huán)核苷酸的特異結(jié)合。結(jié)合是特異的，因?yàn)殂?III)離子和鋯(IV)離子不結(jié)合未磷酸化的多肽或者環(huán)化核苷酸。這些金屬離子的區(qū)別性質(zhì)使它們可用于測(cè)定催化磷酸修飾的酶活性的方法中，因?yàn)檫@些 金屬離子只能結(jié)合底物或者酶反應(yīng)的產(chǎn)物，而不能和兩者都結(jié)合。對(duì)酶例如激酶和磷酸二酯酶來說，In"和Zr"離子將結(jié)合產(chǎn)物而不結(jié)合底物，而 對(duì)磷酸酶和環(huán)化酶來說，這些離子將結(jié)合底物而不結(jié)合產(chǎn)物。通過檢測(cè)金 屬離子和底物或者產(chǎn)物(依賴于何種酶)的結(jié)合程度，可以測(cè)定酶的活性。 這些檢測(cè)法還可進(jìn)一步用于篩選或者鑒定能夠調(diào)節(jié)激酶、磷酸酶、環(huán)化酶 和磷酸二酯酶活性的物質(zhì)。最后，這些檢測(cè)法可用于任意激酶、磷酸酶、 環(huán)化酶或者磷酸二酯酶，因?yàn)榻饘匐x子和磷g團(tuán)間結(jié)合的發(fā)生與多肽的 任何特異氨基酸序列或者核苷酸的任何特異堿基或者核苷無關(guān)。
本發(fā)明的檢測(cè)法包括下列步驟。這些步驟包括(1)在銦(III)離子或者鋯 (IV)離子存在的條件下將底物與酶接觸，(2)檢測(cè)顯示銦(IH)離子或者鋯(IV) 離子和底物或者產(chǎn)物之間結(jié)合程度的響應(yīng)；和(3)將該響應(yīng)與影響磷酸修飾 的酶活性對(duì)應(yīng)。該檢測(cè)法還包括在銦(III)離子或者鋯(IV)離子存在條件下 在底物與酶接觸的步驟前和/或期間，將底物和酶與候選物質(zhì)例如預(yù)測(cè)的調(diào)節(jié)劑接觸，通過其對(duì)銦(III)離子或者鋯(IV)離子和底物或者產(chǎn)物結(jié)合程度 的影響，測(cè)定候選物質(zhì)促進(jìn)或者抑制酶活性的能力。
將檢測(cè)組分例如酶、酶調(diào)節(jié)劑、底物、產(chǎn)物和銦(III)離子或者鋯(IV)定組合引入有功能的接觸和/或反應(yīng)性的接觸的方法。優(yōu)選的方法是在溶液 中混合和/或形成原料溶液，然而也可以使用其他方法，例如將一種或多種 組分例如銦(III)離子或者鋯(IV)離子結(jié)合到珠子或者表面，只要在這種結(jié) 合后組分保持至少部分功能、特異性、和/或結(jié)合親和力。
檢測(cè)組分和/或樣品可以在任何能夠提供支持的材料上進(jìn)行接觸。合適 的基質(zhì)可以包括孩腺、PCR板、生物芯片、和雜交室，其中，其特征例如 孩沐的孔和微點(diǎn)陣(即生物芯片)位點(diǎn)的特點(diǎn)是可以包含檢測(cè)位點(diǎn)。合適的 1描述于下列美國(guó)專利申請(qǐng)，在此引入作為參考1997年4月14號(hào)提
交的序列號(hào)08/840,553;和2000年1月5號(hào)提交的序列號(hào)09/478,819。這 些徵板可以包括96、 384、 1536個(gè)孔，或者其他數(shù)量的孔。這些擲妖還可 以包括具有小體積(<50 nL)、升高的底、和/或能夠匹配傳感體積(sensed volume)的截頭圓錐體形狀的孔。
檢測(cè)顯示結(jié)合程度的響應(yīng)的步驟通常包括任何完成這種檢測(cè)的方法， 包括檢測(cè)和/或定量相應(yīng)參數(shù)和/或信號(hào)的變化或者發(fā)生。該方法尤其可能 包括熒光和/或非熒光方法，和異相和/或均相方法。
熒光檢測(cè)法涉及檢測(cè)熒光化合物(或者焚光團(tuán))發(fā)射的光，利用所述光 的性質(zhì)了解化合物及其環(huán)境的性質(zhì)。典型的熒光檢測(cè)法可能涉及(l)將樣品 置于能夠誘導(dǎo)樣品發(fā)出熒光的條件下，和(2)測(cè)定可檢測(cè)的顯示金屬離子和 底物或者產(chǎn)物結(jié)合程度的熒光響應(yīng)。大部分熒光檢測(cè)法基于對(duì)合適激發(fā)光 吸收應(yīng)答所發(fā)射的光。合適的熒光檢測(cè)法尤其包括，(l)熒光強(qiáng)度，這涉及 熒光強(qiáng)度的測(cè)定，(2)熒光偏振，這涉及對(duì)偏振光激發(fā)應(yīng)答所發(fā)射的光偏振 的檢測(cè)，和(3)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，這涉及熒光供體和合適受體間的能量轉(zhuǎn) 移的檢測(cè)。非熒光檢測(cè)法尤其涉及使用除了樣品發(fā)射光以外的可檢測(cè)響應(yīng)， 例如吸收、散射、和/或放射性活化。這些和其他焚光和非熒光檢測(cè)法描述 于下列材料，在此引入作為參考2001年l月19日提交的美國(guó)專利申請(qǐng) 序歹'J號(hào)09/765,869; 和Joseph R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy(第二版，1999)。
可檢測(cè)的熒光響應(yīng)通常包括熒光信號(hào)的變化或者發(fā)生，這可以被肉眼 觀察和/或合適的裝置檢測(cè)。通?？蓹z測(cè)的響應(yīng)是熒光特性的變化，例如強(qiáng) 度、偏振、能量轉(zhuǎn)移、壽命的變化，和/或熒光激發(fā)或者發(fā)射波長(zhǎng)分布的變 化。熒光響應(yīng)可以只是簡(jiǎn)單測(cè)定，或者可以被定量。只是簡(jiǎn)單測(cè)定的響應(yīng) 通常包括只是確認(rèn)其存在的響應(yīng)，而被定量的響應(yīng)通常包括具有可定量的 (例如，可數(shù)值報(bào)告的)值例如強(qiáng)度、偏振和/或其他性質(zhì)的響應(yīng)。在熒光檢 測(cè)法中，利用與實(shí)際參與結(jié)合底物的檢測(cè)組分結(jié)合的熒光團(tuán)可以直接的產(chǎn) 生可檢測(cè)的響應(yīng)，或者利用與其他(例如，報(bào)告物或者指示物)組分結(jié)合的 熒光基團(tuán)可以間接的產(chǎn)生可檢測(cè)的響應(yīng)。熒光標(biāo)記檢測(cè)組分的合適方法和
熒光團(tuán)描述于下列材料，在此引入作為參考Richard P. Haugland， Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (第六版，1996); 2001年3月19日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/813,107;和2001年3月 23曰提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)09/815,932。
異相和均相方法可以通過它們?cè)跈z測(cè)前是否涉及樣品分離來區(qū)分。異 相方法通常需要將結(jié)合和未結(jié)合的種類進(jìn)行分離。這種分離可以例如通過 洗滌除去任何未結(jié)合種類然后在固相上捕獲結(jié)合種類來實(shí)現(xiàn)，所述固相是 例如以金屬離子或者其他合適組分標(biāo)記的珠子或者微板表面。然后通過檢 測(cè)捕獲的結(jié)合種類的量直接的測(cè)定結(jié)合程度，和/或通過檢測(cè)未捕獲的未結(jié) 合種類的量(如果總量已知)間接的測(cè)定結(jié)合程度。與此相反，均相方法通 常不需要大量分離但要求可檢測(cè)的響應(yīng)例如熒光響應(yīng)，在沒有分離結(jié)合和 未結(jié)合種類的情況下，所述熒光響應(yīng)在一定程度上受結(jié)合和未結(jié)合種類的 結(jié)合或未結(jié)合的影響。
意方法。通常通過與另一種響應(yīng)比較響應(yīng)的存在和/或強(qiáng)度(例如，來自相 同樣品在不同時(shí)間和/或另 一樣品在任意時(shí)間的類似檢測(cè))和/或校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) (例如，來自校準(zhǔn)曲線，預(yù)期響應(yīng)的計(jì)算，和/或發(fā)光參考材料)進(jìn)行相關(guān)分 析。因此，例如，在環(huán)化核苷酸濃度的偏振分析中，通過將從未知樣品測(cè)
未知樣品中的環(huán)化核苷酸濃度，所述校準(zhǔn)曲線在類似條件下通過測(cè)定偏振 值作為環(huán)化核苷酸濃度的函數(shù)產(chǎn)生。
實(shí)施例
明。它們不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍，只是為了解釋和說明。 實(shí)施例1
利用熒光偏振的磷酸二酯酶檢測(cè)
磷酸二酯酶(PDE)反應(yīng)混合物包含PDE (不同濃度)和50 nM TAMRA-cGMP (TAMRA-6-羧基四甲基羅丹明)，溶于20 jil包含0.1% BSA的10 mMTris (pH=7.2)。在室溫孵育1小時(shí)后，向PDE反應(yīng)混合物 中加入60 jil溶于100 mM NaAc/HAc緩沖液(pH-5，2)的10mM ZrCl4， InCl3或者GaCl3，其中緩沖液中還含有10 mM ZnS04。孵育1小時(shí)后， 用Analyst讀數(shù)儀(Molecular Devices)測(cè)定熒光偏振。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于圖 1A中。圖1B顯示相似的PDE檢測(cè)，其中使用不同的金屬離子鹽。只有 ZrCl4， InCl3和GaCl3能夠顯示熒光信號(hào)，提示結(jié)合了PDE產(chǎn)物。 實(shí)施例2
利用熒光偏振的激酶檢測(cè)的實(shí)例
不同比例的TAMRA-KNSDLLTSPDVGLLK(底物)(Seq. Id. No.l)和 TAMRA誦KNSDLLTS (P03) PDVGLLK(產(chǎn)物)(Seq.Id.No.2)的混合物被用 于模擬激酶反應(yīng)混合物。100 mM ZrCl4、 InCl3或者GaCb用100 mM包 含10 mM ZnS04的NaAc/HAc緩沖液(pH-5.2)稀釋。ZrCU和InCl3的稀 釋因子是1:600，而GaCl3的稀釋因子是l:10。將60 jil這些鹽溶液添加到 肽混合物中。孵育1小時(shí)后，利用Analyst讀數(shù)儀測(cè)定熒光偏振。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果顯示于圖2。
實(shí)施例3
異相測(cè)定法
當(dāng)磷酸化(或者脫磷酸化)發(fā)生時(shí)，In (III)或者Zr (IV)可用于替代在金 屬包被板(Pierce)或者珠子上的Ni(II)，從非磷酸化的分子分離磷酸化的分 子。利用熒光標(biāo)記的肽或者蛋白質(zhì)底物，可以進(jìn)行激酶或者磷酸酶檢測(cè)。 被捕獲到包被有In (III)或者Zr (IV)的顆粒、微板或者微流裝置內(nèi)表面上 的磷酸化肽或蛋白質(zhì)，可以在洗滌后進(jìn)行檢測(cè)。如果使用可以在單個(gè)分子 或者單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)的讀數(shù)儀，可以省略洗滌或者分離步驟。如果 用熒光團(tuán)標(biāo)記的cAMP或者cGMP作為底物，可以檢測(cè)磷酸二酯酶活性。
實(shí)施例4
時(shí)間分辨熒光能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)
為測(cè)定激酶、磷酸酶、環(huán)化酶或者PDE的活性，可以使用標(biāo)記有熒光
底物的受體(即Cy5或者熒光素)。當(dāng)酶反應(yīng)終止時(shí)，可以將標(biāo)記P(V肽(或 者其他P03-標(biāo)記分子)的供體(即銪復(fù)合物或者鋱復(fù)合物)與In (III)或者Zr (IV)鹽溶液一起添加到反應(yīng)混合物中。當(dāng)形成P03-金屬?gòu)?fù)合物時(shí)，供體和 受體對(duì)可以被In (III)或者Zr (IV)引導(dǎo)至非常接近，這引起熒光能量轉(zhuǎn)移。 相似的，可以^吏用猝滅劑-綴合的P03-肽(或者其他POr標(biāo)記的分子) 取代供體綴合物。這里熒光信號(hào)變化反映磷酸修飾酶反應(yīng)中未反應(yīng)底物的 數(shù)量。
序列表
<110>弗 哈夫曼-拉羅切有限公司
<120>用于測(cè)量磷酸修飾酶活性的測(cè)定法
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〈150〉 US 60/875268
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<170〉 Patentln version 3.4
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<212> PRT <213>人工
〈220〉
<223>激酶底物 〈400> 1
Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro Asp Val Gly Leu Leu Lys 15 10 15
〈210> 2
〈211〉 15
〈212> PRT
<213> 人工
〈220〉
<223>激酶產(chǎn)物 <220〉
<221> MOD—RES
<222> (8).. (8) <223>磷酸化
〈400〉 2
Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro Asp Val Gly Leu Leu Lys 15 10 1權(quán)利要求
1、用于測(cè)定能夠催化底物磷酸修飾以生成產(chǎn)物的酶的活性的方法，所述方法包括以下步驟i)在銦(III)離子或者鋯(IV)離子存在的條件下將底物與酶接觸，其中銦(III)離子或者鋯(IV)離子能夠結(jié)合底物或者產(chǎn)物，但不與兩者都結(jié)合；ii)檢測(cè)銦(III)離子或者鋯(IV)離子和底物或者產(chǎn)物之間的結(jié)合程度；和iii)將步驟ii)中的結(jié)合程度和酶活性相對(duì)應(yīng)；其中該酶選自激酶、磷酸酶、環(huán)化酶和磷酸二酯酶組成的組。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中底物用熒光部分標(biāo)記，并且其中步驟ii)包括測(cè)量可檢測(cè)的熒光響應(yīng)，所述熒光響應(yīng)表示銦(III)離子或者鋯(IV) 離子和底物或者產(chǎn)物之間的結(jié)合程度。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中可檢測(cè)的熒光響應(yīng)選自熒光強(qiáng)度、 熒光猝滅、時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移和熒光偏振組成的組。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中可檢測(cè)的熒光響應(yīng)是熒光偏振。
5、 篩選調(diào)節(jié)酶活性的物質(zhì)的方法，所述酶能夠催化底物磷酸修飾以生成產(chǎn)物，所述方法包括以下步驟i) 在存在或不存在所述物質(zhì)，以及存在銦(III)離子或者鋯(IV)離子的條件下，將底物與酶接觸，其中銦(III)離子或者鋯(IV)離子可以結(jié)合底物或 者產(chǎn)物，但不與兩者都結(jié)合；ii) 檢測(cè)銦(III)離子或者鋯(IV)離子和底物或者產(chǎn)物之間的結(jié)合程度；和iii) 確定該物質(zhì)調(diào)節(jié)步驟(ii)中的結(jié)合程度的能力，其與酶活性相對(duì)應(yīng)； 其中該酶選自激酶、磷酸酶、環(huán)化酶和磷酸二酯酶組成的組。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其中用熒光部分標(biāo)記底物，并且其中步驟ii)包括測(cè)量可檢測(cè)的熒光響應(yīng)，所述熒光響應(yīng)表示銦(III)離子或者鋯(IV) 離子和底物或者產(chǎn)物之間的結(jié)合程度。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其中可檢測(cè)的熒光響應(yīng)選自熒光強(qiáng)度、熒光猝滅、時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、時(shí)間分辨熒光共振能 量轉(zhuǎn)移和熒光偏振組成的組。
8、如權(quán)利要求7所述的方法，其中可檢測(cè)的熒光響應(yīng)是熒光偏振。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于測(cè)量磷酸修飾酶活性的測(cè)定法，所述酶例如激酶、磷酸酶、環(huán)化酶和磷酸二酯酶。該檢測(cè)法還可用于鑒定和篩選調(diào)節(jié)激酶、磷酸酶、環(huán)化酶和磷酸二酯酶活性的物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12Q1/42GK101205556SQ20071015967
公開日2008年6月25日 申請(qǐng)日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者甘清芬 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司