專利名稱：西姆瓦什坦叮的生化純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將Lovastatin生物合成轉(zhuǎn)化為7-[1′，2′，6′，7′，8′，8a′(R)-六氫-2′(S)，6′(R)-二甲基-8′(S)-羥基-1′(S)-萘基]-3(R)，5(R)-二羥基庚酸，即“三醇酸”，它是在由Lovastatin合成Simvastatin中通過微生物的水解得到的，這種方法便于將Simvastatin從未反應(yīng)的Lovastatin原料中分離和離析出來。該方法使用能夠水解Lovastatin的2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈的細(xì)菌或真菌，或使用由其中衍生而來的這類微生物的突變體或水解酶。
所說的三醇酸和它的內(nèi)酯形式是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的，并且是3-羥基-3-甲基谷氨酰基-輔酶A(HMG-CoA)還原酶(包含在膽固醇生物合成中的一種酶)的抑制劑。
Lovastatin鹽成為三醇鹽的選擇性轉(zhuǎn)化可用于在由Lovastatin生產(chǎn)Simvastatin的過程中分離未反應(yīng)的Lovastatin和Simvastatin。Lovastatin酸在8′位上具有2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈，并且將其與在8′位上具有2，2-二甲基丁酰氧基側(cè)鏈的新形成的Simvastatin酸分離是困難的。現(xiàn)申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，為了形成三醇鹽，使用來自微生物的水解酶，采用本發(fā)明的方法而進(jìn)行的由Lovastatin酸鹽的2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈的選擇性分裂結(jié)果形成了更容易分離的混合物和純度更高的Simvastatin產(chǎn)物。上述的衍生物包括真菌，例如Clonostachys compactiuscula(ATCC38009和ATCC74178)，Monascus ruber，Mortierella isabellina，Emericella unguis，Diheterospora chlamydosporia，Humicola fuscoatra，Dechotomomyces cejpii，Neocosmospora africana，Xylogone sphaerospora，Torulomyces ragena，Thielavia fimeti，Aspergillus unguis，卷枝毛微(Mucor circinelloides)，腐皮鐮孢(Fusarium solani)，產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)，棒曲霉(Aspergillus Clavatus)，Scopulariopsis communis，Gilmaniella humicola，Mucor bainieri，Tricharus spiralis和chaetomium cochliodes，或細(xì)菌，特別是放線菌類例如白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriscolus)，寡生孢鏈霉菌(Streptomyces paucisporogenes)，吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopius)，產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)，排孢游動(dòng)單孢菌(Planomonospora parontospora)和Kibdelosporangium aridum。
本發(fā)明涉及的是用作抗血膽甾醇過多制劑的HMG-CoA還原酶的抑制劑的領(lǐng)域，現(xiàn)在相當(dāng)確定的是，血膽甾醇過多是在心血管疾病特別是粥樣硬化的發(fā)展階段的重要危險(xiǎn)因素。能夠抑制HMG-CoA還原酶的化合物干擾和限制膽固醇的生物合成，并且以上述的方法起抗血膽甾醇過多制劑的作用。
正如上面已敘述的那樣，三醇酸和它的內(nèi)酯形式是已知化合物。以內(nèi)酯形式的三醇酸，例如描述在Endo，公開的日本專利申請(qǐng)86-13798(1986)中，其中它是通過Monascus ruber的發(fā)酵來生產(chǎn)的，并且也陳述了其具有還原血膽固醇含量的能力的論證。
Lovastatin和Simvastatin作為HMG-CoA還原酶抑制劑也是本技術(shù)領(lǐng)域已知的化合物。這兩種化合物的不同在于Lovastatin在8′位上具有2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈和Simvastatin具有2，2-二甲基丁酰氧基側(cè)鏈。
雖然Simvastatin已由Lovastatin合成出來，但由Simvastatin和Lovastatin的混合物中將其分離并純化一直是困難是。該兩種化合物(這兩種化合物的不同點(diǎn)只是一個(gè)甲基)之間在結(jié)構(gòu)上的相似性使得高壓液相色譜(HPLC)分離進(jìn)行困難，這是因?yàn)檫@兩種化合物具有如此相似的保留時(shí)間。為從Simvastatin和Lovastatin的混合物中分離出Simvastatin所使用的一種分離方法是使用堿性水解如用氫氧化鈉(NaOH)或氫氧化鉀(LiOH)將未反應(yīng)的Lovastatin轉(zhuǎn)化為三醇酸或二醇內(nèi)酯。然而，這種堿性水解僅水解一定百分率的Lovastatin，未反應(yīng)的Lovastatin作為最終Simvastatin產(chǎn)物的雜質(zhì)而留下。堿性水解的另外的問題是Simvastatin的部分水解，于是便減少了所需的Simvastatin產(chǎn)物的收率。本發(fā)明提供了以較高的純度和在沒有伴隨收率損失的情況下從Simvastatin和Lovastatin的混合物中分離Simvastatin的方法。
Komagata等人[J.Antibiotics，39，1574-77(1986)]描述了將Compactin(ML-236B)酶水解轉(zhuǎn)化成8-羥基類似物(ML-236A)，其中除去了正如在本發(fā)明中所述的相同側(cè)鏈。在經(jīng)試驗(yàn)的1600種真菌菌株中，發(fā)現(xiàn)有59種對(duì)催化該水解反應(yīng)是有效的，并且，Emericella unguis表現(xiàn)出最有效的活性。
Endo[公開的日本專利申請(qǐng)85-176595(1985)]描述了與上述的Komagata等人相同的轉(zhuǎn)化，但是，另外還包括轉(zhuǎn)化“monacolin K”(其為Lovastatin)成為“monacolin J)(其為本發(fā)明中所述的三醇酸)。認(rèn)為特別有用的霉菌是Mortierella isabellina，Emericella unguis，Diheterospora chlamydosporia，Humicola fuscoatra，Dichotomomyces cejpii，Neocosmospora africana，Xylogone Sphaerospora，Torulomyces ragena和Thielavia fimeti。
歐洲專利公開EOP486153認(rèn)為Clonostachys compactiuscula ATCC38009能夠轉(zhuǎn)化Lovastatin酸成為三醇酸。這種相同的菌株已用美國型培養(yǎng)收集(American Type Culture Collection)作為ATCC74178而再存儲(chǔ)。
通過天然的2(S)-甲基丁酰氧基側(cè)鏈的C-甲基化可將Lovastatin轉(zhuǎn)化成為更活潑的HMG-CoA還原酶抑制劑以便得到Simvastatin。通過適合于分子的官能度的任何已知方法可以完成C-甲基化。
一種用于將2(S)-甲基丁酰氧基側(cè)鏈直接進(jìn)行C-甲基化的方法描述于美國專利4，582，915中。這種方法詳述于圖解Ⅰ和隨之進(jìn)行的說明中。
圖解Ⅰ
圖解Ⅰ(續(xù))
其中M為堿金屬鹽，優(yōu)選鉀鹽;
X為鹵素，如氯、溴或碘，優(yōu)選溴或碘;
M+1為來自鋰、鈉或鉀的陽離子，優(yōu)選鋰;及R1和R2為下述基團(tuán)1)獨(dú)自地為C1-3烷基，或2)R1和R2與它們連接的氮原子一起形成5元或6元雜環(huán)如吡咯烷或哌啶，優(yōu)選為吡咯烷。
在通過將Lovastatin直接進(jìn)行甲基化而形成Simvastatin的方法中，該Lovastatin內(nèi)酯化合物首先被轉(zhuǎn)化成二羥基羧酸的堿金屬鹽，優(yōu)選為鉀鹽。雖然用于制備干鹽的任何方法會(huì)足以滿足需要，但合適的是，將基本上為化學(xué)計(jì)算量的氫氧化鉀水溶液加入到在含有少量的C1-3鏈烷醇(優(yōu)選異丙醇、乙醇或甲醇)的烴類溶劑(如苯、甲苯或環(huán)己烷)的內(nèi)酯原料的溶液中，或者，在含有或不含有加入鏈烷醇的四氫呋喃(THF)中，攪拌幾分鐘至約1小時(shí)，最后在真空中濃縮至干。該剩余物經(jīng)嚴(yán)格干燥，例如通過與環(huán)己烷、甲苯或干燥的四氫呋喃[優(yōu)選是非常干燥(少于0.08mg H2O/ml)的四氫呋喃]的共沸蒸餾而進(jìn)行的干燥。
將干燥的堿金屬鹽溶于醚溶劑(如四氫呋喃、乙醚、1，2-二甲氧基乙烷)中，冷卻到-80℃至-25℃，并用過量的強(qiáng)堿性如堿金屬酰胺處理，其中，所說的堿金屬為鋰、鈉或鉀(優(yōu)選鋰)，且所說的酰胺為處于干燥的惰性環(huán)境下的醚溶劑中的二乙基酰胺、吡咯烷、二甲基酰胺或二異丙基酰胺。在-80°到-25℃優(yōu)選-35°至-30℃下，約2至8小時(shí)優(yōu)選約2小時(shí)之后，將鹵代甲烷如溴代甲烷、氯代甲烷或碘代甲烷，優(yōu)選溴代甲烷或碘代甲烷加入到該混合物中，同時(shí)保持低溫。如果仍然剩下明顯多的原料量，那么可重復(fù)進(jìn)行所述的用強(qiáng)堿和鹵代甲烷處理的步驟。0.5至約3小時(shí)后，隨之最后加入鹵代甲烷，通過向其中加入過量的水將該反應(yīng)混合物驟冷。
接著進(jìn)行上述的直接甲基化，為了達(dá)到最終產(chǎn)物提純的目的使用NaOH或LiOH試圖將未反應(yīng)的Lovastatin轉(zhuǎn)化成為三醇酸或二醇內(nèi)酯。然而，這種堿性水解僅使很少百分含量的Lovastatin進(jìn)行水解。因此，未反應(yīng)的Lovastatin仍作為最終Simvastatin產(chǎn)物的雜質(zhì)而存在。此外，堿性水解也使Simvastatin進(jìn)行了水解，于是減少了所需的Simvastatin產(chǎn)物的收率。當(dāng)接著進(jìn)行水解時(shí)，這時(shí)使Simvastatin或其鹽形式的開環(huán)的酸形式通過加熱或酸催化內(nèi)酯化作用而轉(zhuǎn)化成內(nèi)酯，并通過結(jié)晶法進(jìn)行分離和提純。
本發(fā)明涉及使用真菌或細(xì)菌以高純度和高收率地從Simvastatin和Lovastatin的混合物中純化和分離Simvastatin的方法，上述的真菌和細(xì)菌能夠選擇性水解Lovastatin的2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈成為6(R)-[2-8(S)-羥基-2(S)，6(R)-二甲基-1′，2′，6′，7′，8′，8a′(R)-六氫萘基)乙基]-4(R)-羥基-3，4，5，6-四氫-2H-吡喃-2-酮，即三醇酸或相應(yīng)的二醇內(nèi)酯。該三醇酸或二醇內(nèi)酯通過常規(guī)方法如結(jié)晶法、高壓液相色譜法或其他色譜方法很容易從Simvastatin(或Lovastatin酸)中分離出來。本發(fā)明特別是用于在由Lovastatin合成Simvastatin中從Simvastatin中除去未反應(yīng)的Lovastatin。
本發(fā)明的方法可以以它們的內(nèi)酯形式或其酸形式來分離Simvastatin和Lovastatin的混合物。因?yàn)長ovastatin和Simvastatin的酸形式比其內(nèi)酯形式更能溶于含水系統(tǒng)中，因此使用酸形式是優(yōu)選的。
一般來說，Lovastatin和Simvastatin將以鹽形式使用。當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明的該原料、中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物時(shí)，除非另有說明，所說的術(shù)語“酸”、“開環(huán)酸”和“酸形式”同樣也包括它的任何適合的鹽形式。使之有可能具有良好溶解性并且不干擾在進(jìn)行特定反應(yīng)中所經(jīng)受的其他條件的任何鹽都是容許的?？墒褂美纾瑝A金屬鹽如鋰、鈉和鉀鹽;堿土金屬鹽如鈣或鎂鹽;或其他金屬的鹽如鋁、鐵、鋅、銅、鎳或鈷鹽;由堿性氨基酸所形成的氨基酸鹽如精氨酸、賴氨酸、α，β-二氨基丁酸和烏氨酸鹽;胺鹽如叔辛基胺、二芐胺、乙二胺、嗎啉和三(羥甲基)氨基甲烷的鹽;或銨鹽。可使用且優(yōu)選的是Lovastatin酸的堿金屬鹽(Li、Na和K鹽)和銨鹽形式。特別優(yōu)選的是鉀和銨鹽的形式。
為方便起見，對(duì)于Lovastatin酸、三醇酸、它的內(nèi)酯形式和Simvastatin的結(jié)構(gòu)式分別以式1、2、3和4列出如下
1 Lovastatin酸 2 三醇酸
3 二醇內(nèi)酯 4 Simvastatin其中M3選自如下a)H，b)堿金屬鹽如Li、Na或K鹽，c)堿土金屬鹽如Ca或Mg鹽，d)其他金屬鹽如Al、Fe、Zn、Cu、Ni或Co鹽，e)由堿性氨基酸所形成的氨基酸鹽如精氨酸、賴氨酸、α，β-二氨基丁酸或?yàn)醢彼猁}，f)胺鹽如叔辛基胺、二芐胺、乙二胺、嗎啉或三(羥甲基)氨基甲烷的鹽，和g)銨鹽。
正如已敘述的那樣，由于溶解性的原因，已發(fā)現(xiàn)最好使用以其開環(huán)或酸形式的Lovastatin和Simvastatin的混合物，并且為了達(dá)到這一目的，優(yōu)選的是Lovastatin的銨、鉀、鈉和鋰鹽形式。
用于本發(fā)明方法中的真菌是在Simvastatin存在下可選擇性分裂Lovastatin的2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈的那些真菌。能夠水解Lovastatin側(cè)鏈的真菌種屬有Clonostachys，Emericella，Diheterospora，Humicola，Dichotomonyces，新赤殼屬(Neocosmospora)，帚霉屬(Scopulariopsis)，Xylogone，Torulomyces和Thievela。特別有用的真菌包括Clonostachys compactiuscula，Monascus ruber，Mortierella isabellina，Emericella unguis，Diheterospora chlamydosporia，Humicola fuscoatra，Dechotomomyces cejpii，Neocosmospora africana，Xylogone sphaerospora，Torulomyces ragena，Thielavia fimeti，Aspergillus unguis，卷枝毛微(Mucor circinelloides)，腐皮鐮孢(Fusarium solani)，產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)，棒曲霉(Aspergillus clavatus)，Scopulariopsis communis，Gilmaniella humicola，Mucor bainieri，Tricharus spiralis和chaetomium cochliodes。特別優(yōu)選的真菌為Clonostachys Compactiuscula，Humicola fuscoatra，Neocosmospora africana，Scopulariopsis communis和Xylogone sphaerospora。最優(yōu)選的菌株為Clonostachys compactiuscula(ATCC74178或ATCC38009)。
用于本發(fā)明方法中的細(xì)菌是在Simvastatin存在下可選擇性分裂Lovastatin的2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈的那些細(xì)菌。
能夠水解Lovastatin側(cè)鏈的放線菌類的種屬有鏈霉菌屬(Streptomyces)，游動(dòng)單孢菌屬(Planomonospora)和Kibdelosporangium。特別有用的細(xì)胞包括白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriscolus)，寡生孢鏈霉菌(StreptomycesPaucisporogenes)，吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopius)，產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces Viridochromogenes)，排孢游動(dòng)單孢菌(Planomonospora Parontospora)和Kibdelosporangium aridum。
用微生物本身，或其突變體，或由其中得到的無細(xì)胞提取液，或由無細(xì)胞提取液(或是真菌或細(xì)菌在其中生長的廢棄的無細(xì)胞液體培養(yǎng)基或培養(yǎng)基)提純的水解酶可處理Lovastatin和Simvastatin或其酸的混合物。
術(shù)語“突變體”指的是一種有機(jī)體，在該有機(jī)體中，在其基因組內(nèi)的某些基因(或它的DNA的調(diào)節(jié)部位)被修飾，剩下的該基因或多種基因具有擔(dān)負(fù)著該有機(jī)體將Lovastatin酸水解成為三醇酸的功能性的和遺傳性的能力。本發(fā)明范圍內(nèi)的突變體具有與親代菌株的那些突變體基本相同的特征，并且能夠水解Lovastatin2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈。
由微生物的培養(yǎng)基或其突變體產(chǎn)生的酶可以各種任何方法與Simvastatin和Lovastatin的混合物接觸，其中所有這些對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員都是顯而易見的。所有這些都是在如本發(fā)明定義的術(shù)語“處理”所定義的范圍內(nèi)。例如，可使用全部發(fā)酵的液體培養(yǎng)基，并且按照這種方法，可簡(jiǎn)單地將Simvastatin和Lovastatin的混合物加到所產(chǎn)生的微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并回收純的Simvastatin產(chǎn)物。
變化上述全部液體培養(yǎng)基的方法是其中如上所述的產(chǎn)生微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基的方法中的一種。但是為了誘導(dǎo)水解活性，加入小濃度(0.5至2.5g/L，優(yōu)選1.0至2.0g/L)的Lovastatin酸。然后，通過離心或過濾來采集細(xì)胞體，并且以小片或菌絲塊將其回收，它們可立即使用或被冷凍為以后使用。隨后，可將所說的小片或菌絲塊直接加入到通過甲基化由轉(zhuǎn)化Lovastatin成為Simvastatin的過程中而產(chǎn)生的Simvastatin和Lovastatin的混合物中。另一種方法是，可部分純化Lovastatin和Simvastatin的混合物，然后，使之與上述的微生物培養(yǎng)基的冷凍小片相接觸。
全部真菌的細(xì)胞都是活著的是不必要的，同樣可能的是使用死細(xì)胞，例如已被丙酮干燥的那些細(xì)胞。
可能的是，使用由那些全部細(xì)胞培養(yǎng)基得到的粗均漿作為全部細(xì)胞的替換物，從粗均漿分離水解酶本身和使用基本上純化的水解酶也是可能的。
當(dāng)微生物分泌水解酶而進(jìn)入發(fā)酵/培養(yǎng)基中時(shí)，使用分離的酶是可能的。
使水解酶與Simvastatin和Lovastatin原料的混合物相接觸的方法可分批進(jìn)行，或者可以連續(xù)的方法進(jìn)行?？梢愿鞣N方法改變這些反應(yīng)物本身相接觸的方式，以保持工藝技術(shù)的進(jìn)步性。因此，對(duì)于水解酶而言，可使用固相酶柱，使Simvastatin和Lovastatin的混合物通過該固相酶柱。這種工藝技術(shù)的另一實(shí)例是涉及膜式反應(yīng)器。反應(yīng)物相接觸的優(yōu)選方法是通過上述的固相酶柱的方法或使用純化的酶制劑。
下面進(jìn)一步陳述的操作實(shí)施例描述了通常所使用的方法，以便證明，在Simvastatin存在下，將污染的Lovastatin進(jìn)行酶水解成為三醇酸，以達(dá)到高純度的Simvastatin的程度。然而，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)來說，不必建議使用這些操作實(shí)施例中的一些方法。
本發(fā)明所使用的從Simvastatin和Lovastatin的混合物中分離和提純Simvastatin的方法示于圖解Ⅱ中。
將Simvastatin和Lovastatin內(nèi)酯的混合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的開環(huán)酸的混合物，其方法最好是用在含有少量的C1-3鏈烷醇(優(yōu)選異丙醇、乙醇或甲醇)的烴類溶劑(如苯、甲苯或環(huán)己烷)中的基本上為化學(xué)計(jì)算量的堿金屬氫氧化物(如氫氧化鉀或氫氧化鈉)的水溶液處理，同時(shí)攪拌幾分鐘至約1小時(shí)。然后，萃取該底物進(jìn)入含水介質(zhì)中，該含水介質(zhì)為例如如下緩沖劑TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)、甘氨酸、TES(N-三[羥甲基)甲基氨基]-2-羥基-丙磺酸)、磷酸鈉、MOPSO(3-[N-嗎啉代]-2-羥基丙磺酸)、BIS-TRIS PROPANE(1，3-二[三(羥甲基)甲氨基]丙烷)、BES(N，N-二[2-羥乙基]-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-[N-嗎啉代]丙磺酸)、HEPES(N-[2-羥乙基]-哌嗪-N′-[2-乙磺酸])、DIPSO(3-[N，N-二(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羥甲基)甲基氨基]-2-羥基丙磺酸)、HEPPSO(N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-羥基丙磺酸])、POPSO(哌嗪-N，N′-二[2-羥基丙磺酸])、EPPS(N-[2-羥乙基]-哌嗪-N′-[3-丙磺酸])、TEA(N-三[羥甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)、TRICINE(N-三[羥甲基]-甲基甘氨酸)、BICINE(N，N-二[2-羥乙基]甘氨酸)、TAPS(N-三[羥甲基]甲基-3-氨基丙磺酸)、AMPSO(3-[(1，1-二甲基-2-羥乙基)胺]-2-羥基丙磺酸)或CHES(2-[N-環(huán)己基氨基]-2-羥基丙磺酸)緩沖劑，PH7-10，25mM至1M，蒸餾水或上面補(bǔ)充列出的含有多達(dá)20%(Vol./Vol.)的水混溶的溶劑(如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或四氫呋喃)的一種含水介質(zhì)。優(yōu)選的是TRIS、甘氨酸、TES和磷酸鈉緩沖劑，PH7.5-9.5，25mM至75mM(含12%甲醇)。然后，溶解的或懸浮的底物用微生物或其突變體或從其中得到的無細(xì)胞提取液或由微生物得到的水解酶來處理，或者將該底物轉(zhuǎn)化成為銨鹽，并用微生物或其突變體或從其中得到的無細(xì)胞提取液或從其中得到的水解酶來處理。在加入選擇的微生物或其可接受的突變體或從其中得到的無細(xì)胞提取液或水解酶之前或與其同時(shí)加入含水體系。
采用酸催化或加熱催化方法進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，例如，采用在室溫下在含有7mM甲磺酸的乙酸異丙酯(IPAC)中攪拌2小時(shí)的方法進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)。生成的Simvastatin內(nèi)酯和二醇內(nèi)酯可用高壓液相色譜(HPLC)或結(jié)晶法分離，得到基本純的Simvastatin。
使用含有0.01-1.0%磷酸或三氟乙酸或其它合適酸的含水組分和包括乙腈、甲醇和乙醇的合適的有機(jī)組分的有機(jī)-含水混合物作為流動(dòng)相進(jìn)行反相HPLC。
Simvastatin也可從三醇酸/二醇內(nèi)酯中分離出來，并通過從乙酸乙酯、乙酸異丙酯和甲醇中結(jié)晶而提純。
圖解Ⅱ
圖解Ⅱ(續(xù))
也可將Lovastatin酸進(jìn)行酶催化水解成三醇酸的反應(yīng)用于通過直接甲基化Lovastatin來制備Simvastatin的方法中。這個(gè)全過程示于圖解Ⅲ中。
在通過直接甲基化Lovastatin以生成Simvastatin的方法中，先將Lovastatin內(nèi)酯化合物轉(zhuǎn)化成堿金屬鹽，優(yōu)選二羥基羧酸的鉀鹽。雖然制備干鹽的任何可能的方法都可以使用，但是方便的方法是，將基本化學(xué)計(jì)算量的氫氧化鈉水溶液加入到內(nèi)酯原料的烴溶劑如苯、甲苯或環(huán)己烷的溶液中，該溶液含有少量的C1-3鏈烷醇，優(yōu)選異丙醇、乙醇或甲醇，或另一種方法是使用含有或不含有加入的鏈烷醇的四氫呋喃(THF)，并攪拌幾分鐘至約1小時(shí)，最后真空濃縮至干。例如通過與環(huán)己烷、甲苯或干燥的四氫呋喃，優(yōu)選是極干的(少于0.08mg H2O/mL)四氫呋喃共沸蒸餾使剩余物嚴(yán)格除水。
將干堿金屬鹽溶于醚溶劑如四氫呋喃、乙醚、1，2-二甲氧基乙烷等中，冷卻至約-80℃至-25℃，優(yōu)選-35℃至-30℃，然后在干燥隋性環(huán)境中在醚溶劑中用過量的強(qiáng)堿如堿金屬酰胺處理，其中堿金屬是鋰、鈉或鉀，優(yōu)選鋰，酰胺是二乙基酰胺、吡咯烷、二甲基酰胺或二異丙基酰胺。在-80℃至-25℃，優(yōu)選-35℃至-30℃下約2至8小時(shí)，優(yōu)選約2小時(shí)后，將鹵代甲烷，例如溴代甲烷、氯代甲烷或碘代甲烷，優(yōu)選溴代甲烷或碘代甲烷加入到混合物中，同時(shí)保持低溫。如果剩下相當(dāng)大量的原料，可重復(fù)進(jìn)行所述的用強(qiáng)堿和鹵代甲烷處理的步驟。0.5至約3小時(shí)后接著最后加入鹵代甲烷，通過加入過量水使反應(yīng)混合物驟冷。
圖解Ⅲ
圖解Ⅲ(續(xù))
然后，優(yōu)選的是，用在乙酸乙酯中的氫氧化銨-甲醇將Lovastatin酸鹽和Simvastatin酸鹽的混合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的銨鹽，接著分離銨鹽(優(yōu)選用結(jié)晶法)并再懸浮于含水介質(zhì)中，用選擇的微生物，或其突變體或由其衍生的水解酶處理。
另一種方法是，將水解酶直接加入到Lovastatin鹽和Simvastatin鹽的混合物中，然后用蒸餾法除去殘留的有機(jī)物。
通過合適的方法，例如加熱催化或酸催化內(nèi)酯化可以將得到的Simvastatin酸和三醇酸的混合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酯的混合物。用HPLC或結(jié)晶法可將Simvastatin從得到的Simvastatin和二醇內(nèi)酯的混合物中分離出來。另外，可通過HPLC或結(jié)晶法將Simvastatin酸從三醇酸中分離出來，接著將純的Simvastatin酸轉(zhuǎn)化成Simvastatin內(nèi)酯。如果用結(jié)晶法將Simvastatin酸分離和提純，優(yōu)選的是在內(nèi)酯化之前將Simvastatin酸轉(zhuǎn)化成銨鹽。
本發(fā)明也涉及能夠?qū)ovastatin酸轉(zhuǎn)化成三醇酸的微生物培養(yǎng)基的特殊菌株的突變體Clonostachys Compactiuscula(ATCC38009和ATCC74178)，Monascus ruber(FERM-P.No.4822)，Mortierella isabellina(IFO7844，ATCC42613，ATCC36670，ATCC38063，或ATCC44853)，Emericella unguis(IFO8087，ATCC10073，ATCC12063，ATCC13431，或ATCC16812)，Diheterospora chlamydosporia(IFO9249，ATCC16449，ATCC18956，ATCC20537)，Humicola fuscoatra(IFO9530，ATCC12774，ATCC52073，ATCC62175)，Dechotomomyces cejpii(IFO9929，ATCC22149，ATCC42284)，Neocosmospora africana(IFO7590，ATCC24342)，Xylogone sphaerospora(IFO9516，ATCC42027)，Torulomyces ragena(IFO30008)，Thielavia fimeti(IFO30419)，Aspergillus unguis(MF1416)，卷枝毛霉(Mucor circinelloides)(ATCC1207a)，腐皮鐮孢(Fusarium solani)(ATCC12826)，產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)(ATCC10002)，棒曲霉(Aspergillus Clavatus)(ATCC1007)，Scopulariopsis communis(MF3769)，Gilmaniella humicola(ATCC16013)，Mucor bainieri(ATCC42642)，Tricharus spiralis(MF5295)，Chaetomium cochliodes(ATCC10195)，白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriscolus)(NRRL5748)，寡生孢鏈霉菌(Streptomyces Paucisporogenes)(ATCC25482)，吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopius)(ATCC21722)，產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces Viridochromogenes)(ATCC21724)，排孢游動(dòng)單孢菌(Planomonospora Parontospora)(ATCC23864)，和Kibdelosporangium aridum(NRRL12647)。在發(fā)酵技術(shù)中有一些公知的方法可提高用微生物的各種菌株產(chǎn)生的所需產(chǎn)物的產(chǎn)率。例如，將得到的產(chǎn)生的菌株進(jìn)行照射或曝露于已知的其他刺激源之下以大大地增加微生物的原生物的正在進(jìn)行的突變。然后通過使用一種敏感篩，可能的是，從僅這樣產(chǎn)生的許多突變體中選擇可增加所需產(chǎn)物產(chǎn)量的那些突變體。用這種方法，通常可能的是，通過其各種選擇的派生物不斷地改善產(chǎn)生的菌株的產(chǎn)量。突變體的生物純的培養(yǎng)物是基本上包括突變體的一種菌株的培養(yǎng)物。對(duì)于本發(fā)明，通過選擇真菌或放線菌類的突變體可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于Lovastatin酸水解酶的產(chǎn)量的類似改善。對(duì)此目的來說，令人滿意的篩是使用高效液相色譜(HPLC)，其可測(cè)定在非常低濃度下的酶催化分裂產(chǎn)物，這樣清楚地確定了Lovastatin通過上述任何特殊突變體已轉(zhuǎn)化成三醇酸。
培養(yǎng)基微生物的發(fā)酵是在水介質(zhì)例如用于制備其他發(fā)酵產(chǎn)物的那些水介質(zhì)中進(jìn)行，這種水介質(zhì)含有可被微生物吸收的碳、氮的來源和無機(jī)鹽。
通常，碳水化合物例如糖如乳糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、木糖、甘露糖醇等，和淀粉如酒糟象燕麥、黑麥、玉米淀粉、小米或玉米面等可以單獨(dú)或混合用作培養(yǎng)基中可吸收的碳的來源。培養(yǎng)基中所用的碳水化合物的來源或多種來源的準(zhǔn)確量部分取決于培養(yǎng)基中的其他組分，但是，通常，碳水化合物的量一般在培養(yǎng)基重量的約1%和6%之間變化。這些碳來源可以單獨(dú)地使用，或幾種這樣的碳來源在培養(yǎng)基中混合使用。通常許多蛋白質(zhì)物質(zhì)可用作發(fā)酵過程中的氮來源。合適的氮來源包括，例如酵母水解產(chǎn)物、原生酵母、大豆粉、棉子粉、酪蛋白的水解產(chǎn)物、玉米漿、酒糟或番茄糊等。氮來源可以單獨(dú)或以混合形式使用，其量范圍為水介質(zhì)重量的約0.2%至6%。
能產(chǎn)生鈉、鉀、銨、鈣、磷酸根、硫酸根、氯、碳酸根等離子的普通鹽是在可被加入到培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物的無機(jī)鹽之中，也包括痕量金屬如鈷、錳、鐵和鎂鹽。另外，如果需要，可加入消泡劑如聚乙二醇或聚硅氧烷，尤其是如果培養(yǎng)基過多地起泡時(shí)。
應(yīng)注意的是，實(shí)施例中所述的培養(yǎng)基僅是舉例說明可使用的各種各樣的培養(yǎng)基，而不是對(duì)于培養(yǎng)基的限定。具體地說，用于培養(yǎng)基中的碳來源包括葡萄糖、糊精、燕麥粉、燕麥面、糖漿、檸檬酸鹽、大豆油、甘油、麥芽膏、鱈魚肝油、淀粉、乙醇、天花果、抗壞血酸鈉和豬油。氮來源包括胨化牛奶、自溶酵母、酵母RNA、番茄糊、酪蛋白、原生酵母、花生面、酒糟、玉米漿、大豆粉、玉米粉、NZ胺、豆提取液、天冬酰胺、棉子粉和硫酸銨。主要的離子組分是CaCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和NaCl，也存在少量的CoCl2·6H2O和痕量的Fe、Mn、Mo、B、Co和Cu。
內(nèi)酯化作用根據(jù)本發(fā)明的方法，用可水解Lovastatin的2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈的微生物培養(yǎng)基、或其突變體、或由其得到的無細(xì)胞提取液、或由其得到的水解酶處理Simvastatin酸和Lovastatin酸的混合物，得到容易分離的Simvastatin酸和三醇酸的混合物。如果需要Simvastatin的內(nèi)酯形式，則可將產(chǎn)物混合物內(nèi)酯化并分離，然后二醇內(nèi)酯與Simvastatin內(nèi)酯分離。另一種方法是，Simvastatin酸可與三醇酸分離，接著將Simvastatin酸內(nèi)酯化成Simvastatin。三醇酸的內(nèi)酯反應(yīng)是用標(biāo)準(zhǔn)方法，即加熱或酸催化內(nèi)酯化方法來進(jìn)行。用于Lovastatin酸的有關(guān)化合物的酸催化內(nèi)酯化的方法是已知的，并敘述于美國專利4，916，239中。對(duì)于Simvastatin酸和三醇酸，內(nèi)酯化反應(yīng)通過在室溫下在含7mM甲磺酸的乙酸異丙酯中攪拌2小時(shí)來進(jìn)行。
實(shí)施例1通過Clonostachys Compactiuscula的全細(xì)胞將Lovastatin酸生物轉(zhuǎn)化成三醇酸在具有1.8L操作體積的2L空氣升液發(fā)酵罐中，在29℃和1.25vvm的充氣速率下使Clonostachys Compactiuscula ATCC38009在培養(yǎng)基EN(葡萄糖1%;胨0.2%;牛油提取液0.1%;酵母提取液0.1%和玉米漿0.3%)中生長48-72小時(shí)。加入Lovastatin銨鹽(0.5g/L最終濃度)，以降低水解活性。加入Lovastatin銨鹽后24-72小時(shí)，通過篩子過濾得到發(fā)酵物，并用緩沖劑(20mM Tris，PH8.5)洗滌該小片，冷凍細(xì)胞小片直到容易使用為止。
為了生物轉(zhuǎn)化，在由Aspergillus terreus發(fā)酵得到的碳酸鹽緩沖劑中由空氣升液發(fā)酵得到的Clonostachys Compactiuscula小片(17g濕重)與20mL粗Lovastatin酸(Cd 20g/L)接觸，在250mL Erlenmeyer燒瓶中在27℃和160rpm下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，17小時(shí)后，約60%的Lovastatin酸轉(zhuǎn)化成三醇酸。
在另一試驗(yàn)中，由空氣升液發(fā)酵得到的Clonostachys Compactiuscula小片(5g濕重)與通過甲醇從Aspergillus terreus發(fā)酵提取的10mL粗Lovastatin酸(3.5g/L)接觸。在生物轉(zhuǎn)化混合物中甲醇的最終濃度為25%。生物反應(yīng)在250mL Erlenmeyer燒瓶中在27℃和160rpm下進(jìn)行，2小時(shí)后，通過薄層色譜測(cè)定，使用Clonostachys Compactiuscula的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)使近100%的Lovastatin酸轉(zhuǎn)化成三醇酸。
實(shí)施例2用Clonostachys Compactiuscula的粗均漿使Lovastatin酸生物轉(zhuǎn)化成三醇酸在含有12mL培養(yǎng)基EN的250mL搖燒瓶中在29℃下使Clonostachys Compactiuscula ATCC38009生長3天，加入Lovastatin銨鹽以得到濃度為2.5g/L，并使發(fā)酵另外繼續(xù)進(jìn)行2天。為了制備粗均漿，通過在3000rpm下離心分離10分鐘得到培養(yǎng)基，然后用50mM PH值為7.7的N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)緩沖劑洗滌。將培養(yǎng)基再次離心分離，并在冰上冷凍細(xì)胞塊，然后用裝有玻璃碎片和粉末干冰的研缽和研杵來研磨，將相當(dāng)于1搖燒瓶量的研磨的均漿再懸浮于2.0mL50mM TES緩沖劑中，并在6000rpm下離心分離10分鐘以除去細(xì)胞碎片和玻璃碎片。上層清液用作含有蛋白質(zhì)濃度為約0.5mg/mL的粗均漿。
為了進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，1體積的粗均漿與等體積的Lovastatin酸銨鹽(5g/L)混合，將混合物在29℃下保溫培養(yǎng)。使用該方法，在2小時(shí)內(nèi)觀察到80-90%的Lovastatin酸轉(zhuǎn)化成三醇酸。
實(shí)施例3從Clonostachys Compactiuscula細(xì)胞提純Lovastatin水解酶使用下述方法將使Lovastatin酸生物轉(zhuǎn)化成三醇酸的水解酶提純，該提純方法是使用MONO Q
陰離子交換柱的快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC
)，使Clonostachys Compactiuscula均漿接近均一性。
如上述實(shí)施例2所述，但其中用50mM三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)緩沖劑(pH7.8)代替50mM TES緩沖劑，通過6000rpm離心分離得到的上層清液在15，000rpm下離心分離20分鐘，得到的上層清液通過0.45mm過濾器過濾。然后將含有0.3-0.5mg/mL蛋白質(zhì)的濾液分批地(10mL)以1.0-2.0mL/分的速率加入到與Pharmacia快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)系統(tǒng)連接的Pharmacia MONO Q
(HR5/5)陰離子交換柱中。
使陰離子蛋白質(zhì)結(jié)合到柱間質(zhì)上后，用在20mM TRIS中的PH值為7.8的氯化鈉(0-500mM)的線性梯度逐一地洗脫水解酶。以1mL部分的量收集洗脫的蛋白質(zhì)，并用Lovastatin銨鹽[在這種情況下水解百分?jǐn)?shù)用TLC(薄層色譜)和光密度分析法或HPLC測(cè)定]或比色底物(鄰硝基苯基丁酸鹽，O-NPB)來測(cè)定，達(dá)到酶已顯示出具有水解活性。當(dāng)使用比色底物時(shí)，水解反應(yīng)是用在410nm下用分光光度分析法測(cè)定，該方法主要敘述于Lawrence，R.C.等人的J.Gen.Microbiol.(1967)48，401-418中。這兩種測(cè)定方法都顯示出當(dāng)NaCl濃度接近300mM時(shí)水解酶被洗脫。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS)凝膠電泳現(xiàn)象顯示出含Lovastatin酸水解酶的部分的峰含有分子量約45000Da的顯著光帶。
使用提純酶的制備方法，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是按照實(shí)施例1、2、4和6中所述的方法進(jìn)行，并且測(cè)定是用Lovastatin銨鹽作為底物由水解酶的Km和比活性構(gòu)成。得到的Km值為4.14mM，在飽和底物條件下，發(fā)現(xiàn)所說的酶具有比活性為0.04mmol水解的Lovastatin銨鹽/mg蛋白質(zhì)/分。
實(shí)施例4通過由Clonostachys Compactiuscula得到的純化的水解酶將Lovastatin酸生物轉(zhuǎn)化成三醇酸使用下述方法，通過使用MONO Q
陰離子交換柱的快速蛋白質(zhì)液相色譜法(FPLC
)將使Lovastatin酸轉(zhuǎn)化成三醇酸的水解酶提純，使之Clonostachys Compactiuscula均漿接近均一性。
如上實(shí)施例2所述，但其中用20mM三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)緩沖劑代替50mM TES緩沖劑，將來自6000rpm離心分離得到上層清液，在15000rpm下離心分離，得到的上層清液通過0.45mm過濾器過濾。然后將含有0.3-0.5mg/mL蛋白質(zhì)的濾液分批地(10mL)加入到與Pharmacia快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)系統(tǒng)連接的Pharmacia MONO Q
陰離子交換柱中。
使陰離子蛋白質(zhì)結(jié)合到柱間質(zhì)上后，使用線性梯度的氯化鈉(0-500mM)逐一地洗脫水解酶。以1mL部分的量收集洗脫的蛋白質(zhì)，并用Lovastatin銨鹽(在這種情況下水解百分?jǐn)?shù)用TLC和光密度分析法或HPLC測(cè)定)或比色底物(鄰硝基苯基丁酸鹽，O-NPB)來測(cè)定，達(dá)到酶已顯示出具有水解活性。當(dāng)使用比色底物時(shí)，水解反應(yīng)是在410nm下用分光光度分析法測(cè)定，該方法主要敘述于Lawrence，R.C.等人的J.Gen.Microbiol.(1967)48，401-418中。這兩種測(cè)定方法都顯示出當(dāng)NaCl濃度接近300mM時(shí)水解酶被洗脫。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS)凝膠電泳現(xiàn)象顯示出含Lovastatin酸水解酶的部分峰含有分子量約45000Da的顯著光帶。
使用純化酶的制備方法，生物轉(zhuǎn)化是按照上述實(shí)施例1和2所述的方法進(jìn)行，并且測(cè)定是用Lovastatin銨鹽作為底物由水解酶的Km和比活性構(gòu)成。得到的Km值為4.14mM，在飽和底物條件下，發(fā)現(xiàn)所說的酶具有比活性為110μmol Lovastatin銨鹽/mg蛋白質(zhì)/小時(shí)。
實(shí)施例5在過量Simvastatin銨鹽的存在下Lovastatin銨鹽的生物轉(zhuǎn)化將45g在實(shí)施例2中所述的培養(yǎng)基EN中生長的(冷凍前用50mM PH為7.8的Tris緩沖劑洗滌)冷凍的ClonostachysCompactiuscula(ATCC38009)細(xì)胞用含玻璃碎片和干冰的研缽和研杵均化。將得到的均化的冷凍的粉末移到合適的管中，并用最少量的50mM Tris(PH7.8)洗滌研缽中剩余的物質(zhì)而將其加入到相同的管中。然后將混合物熔化、并在6000rpm下離心分離10分鐘以除去大的細(xì)胞碎片和玻璃碎片。
將在6000rpm下得到的上層清液用作水解酶的粗來源，并將0.8mL的該上層清液與0.2mL甲醇和1.0mL溶液[在50mM Tris中的18.6mM Simvastatin和Lovastatin(1.4mM)銨鹽，PH7.8]混合。反應(yīng)混合物在29℃下保溫培養(yǎng)，在1小時(shí)、2小時(shí)和17小時(shí)后通過取出0.1mL而取樣，并用0.9mL甲醇稀釋，然后通過使用Whatman C-8柱作為穩(wěn)定相和60∶40的乙腈∶0.5%磷酸的混合物作為流動(dòng)相的HPLC分析樣品;在這些條件下，Simvastatin、Lovastatin和三醇銨鹽的相應(yīng)的保留時(shí)間分別為4.4分、3.8分和2.5分。17小時(shí)后，Lovastatin峰的面積百分?jǐn)?shù)由23.2%降至0.7%，這表明轉(zhuǎn)化率大于99%，在此相同接觸期間內(nèi)，大于96%的初始Simvastatin銨鹽保持不變。
實(shí)施例6按照直接甲基化由Lovastatin酸合成Simvastatin酸的方法將剩余的Lovastatin酸生物轉(zhuǎn)化成三醇酸步驟1制備Lovastatin鉀鹽在氮?dú)庵兄苽湓?25mL四氫呋喃(THF)中的Lovastatin溶液(99%純度;25g;60.57mmol)，然后冷卻至5℃。在15分鐘內(nèi)加入10.01M氫氧化鉀的水溶液(6.1mL)，然后升溫至25℃并攪拌老化，直到完全(＞99%)轉(zhuǎn)化成鉀鹽(用HPLC分析)。
步驟2制備Simvastatin鉀鹽將步驟1制備的Lovastatin鉀鹽溶液加熱至回流，通過10英寸Vigreaux柱蒸餾總的500-700mL THF，同時(shí)將THF進(jìn)行篩干燥以保持最小罐體積為215mL。于是Lovastatin鉀鹽溶液中的水量減少至＜0.1mg/mL。然后用150mL經(jīng)篩干燥的THF(水含量＜0.1mg水/mL)稀釋該溶液，得到的總體積為365mL。將經(jīng)篩干燥的吡咯烷(5.81g;81.7mmol;水含量＜0.2mg/mL)作為一批加入，反應(yīng)物在干冰/丙酮浴中冷卻至-78℃。然后，在1小時(shí)內(nèi)在液面以下加入在己烷中的117mL的1.6M正丁基鋰，同時(shí)保持快速攪拌和內(nèi)溫低于-70℃。
將當(dāng)時(shí)含有吡咯烷鋰中間體的Lovastatin鉀鹽溶液用干冰-乙腈浴升溫至-35℃并老化2小時(shí)，冷卻至-45℃后，將13.32g經(jīng)篩干燥的碘代甲烷(93.0mmol;密度2.89g/mL)一批加入，混合物在-30℃(加入碘代甲烷后的內(nèi)溫)下老化30分鐘。用200ml水驟冷混合物，并在分液漏斗中進(jìn)行相分離，通過再加入水將低層的水層稀釋至體積1250mL，然后冷卻至低于10℃。用6M鹽酸將PH調(diào)節(jié)至6，然后加入250mL乙酸乙酯，將PH進(jìn)一步調(diào)節(jié)到2.0(再用HCl)。再進(jìn)行相分離，然后用175mL冷(5-10℃)乙酸乙酯再萃取水層。將兩部分有機(jī)(乙酸乙酯)層合并，并用150mL水洗滌，然后用硫酸鈉干燥最終的有機(jī)層(至＜10mg/mL水)并過濾。然后，在25℃下將112.3mL甲醇加入到(425mL)干燥的過濾的混合物中，然后在5分鐘內(nèi)加入1.3mL甲醇∶氫氧化銨水溶液(3∶1)。用Simvastatin銨鹽(SAS)接種混合物并老化10分鐘，然后在1小時(shí)內(nèi)再滴加35.9mL甲醇∶氫氧化銨水溶液(3∶1)，然后在2.5小時(shí)內(nèi)將混合物冷卻至-10℃，再老化1小時(shí)。過濾產(chǎn)物并用25mL冷(0℃)甲醇洗滌，真空干燥得到的白色晶體，得到白色針狀的Simvastatin銨鹽(含有作為銨鹽的10%剩余的Lovastatin的87%純度的SAS)。
步驟3將剩余的Lovastatin酸(作為銨鹽)生物轉(zhuǎn)化成三醇酸使用實(shí)施例1和3中所述的方法，將Clonostachys Compactiuscula酯酶提純除去已在培養(yǎng)基EN中生長的57g菌絲體細(xì)胞。使用Pharmacia HR10/10 MONO Q 柱，可使每次提純?cè)囼?yàn)應(yīng)用85mL粗無細(xì)胞提取液。得到總量為0.89mg提純的酯酶(在10mL體積中)，然后通過使用10000分子量斷流CENTRIPREP 裝置(AMICON )的超濾方法濃縮至0.175mg蛋白質(zhì)/mL。
然后用通過直接甲基化Lovastatin制得的Simvastatin銨鹽保溫培養(yǎng)酯酶樣品。蛋白質(zhì)的最終濃度為0.4、4.0和40mg/mL，所用的Simvastatin濃度為10、35和50mM。被改變的其他條件是PH值(確定為7.8和9.5)和甲醇濃度(0、10和20%[V/V，最終濃度])。通過夾雜物100mM TRIS(在PH7.8下進(jìn)行反應(yīng)的情況下)或100mM甘氨酸(PH9.0)將反應(yīng)緩沖。在下列條件下在16小時(shí)內(nèi)得到大于90%的剩余的Lovastatin酸水解成三醇酸
酶濃度 Simvastatin濃度 PH 甲醇濃度(mg/ml) (mM) (%v/v)4.0 10 7.8 04.0 10 7.8 104.0 10 9.5 04.0 10 9.5 104.0 10 9.5 204.0 35 9.5 1040.0 35 7.8 040.0 35 7.8 1040.0 35 9.5 040.0 35 9.5 1040.0 35 9.5 20實(shí)施例7通過直接甲基化按照從Lovastatin酸合成Simvastatin酸的方法將剩余的Lovastatin酸生物轉(zhuǎn)化成三醇酸步驟1制備Simvastatin銨鹽按照實(shí)施例6中步驟1的方法開始制備在THF中的5g Lovastatin的鉀鹽溶液。在干冰/乙腈浴中將經(jīng)篩干燥的吡咯烷(2.48mL;2.4當(dāng)量;29.67mmol;＜0.2mg水/ml)，的12.3mL經(jīng)篩干燥的THF溶液冷卻至-20℃，然后以保持溫度低于-10℃的這樣的速率加入1.6M丁基鋰的己烷(18.2mL;2.35當(dāng)量)溶液，加完該溶液后，吡咯烷鋰/THF溶液在-20℃下老化15分鐘。在干冰/乙腈冷浴中，將在THF中的Lovastatin鉀鹽的干燥溶液冷卻至-35℃，將在-20℃下的吡咯烷鋰/THF溶液以這樣的速率加入到快速攪拌的混合物中，以保持在整個(gè)加入過程中的內(nèi)溫低于-30℃。然后混合物在-35℃下老化2小時(shí)，接著冷卻至-40℃，將1.16mL(18.67mmol;1.5當(dāng)量)碘代甲烷按一批加入到該溶液中，這樣引起混合物的內(nèi)溫升高(至約-20℃)。將內(nèi)溫降低回至-30℃并老化1小時(shí)，然后升溫至-10℃并老化30分鐘。
用40mL水將混合物驟冷并在分液漏斗中進(jìn)行相分離，通過再加入水將低部的水層稀釋至250mL體積，然后冷卻至低于10℃。用6M鹽酸水溶液調(diào)節(jié)PH值至6，然后加入50mL乙酸乙酯，并將PH值進(jìn)一步調(diào)節(jié)至2.0(再用HCl)。再進(jìn)行相分離，然后用35mL冷(5-10℃)乙酸乙酯再萃取水層，合并兩部分有機(jī)(乙酸乙酯)層，然后用30mL水洗滌，之后，用硫酸鈉干燥最終有機(jī)層并過濾。接著，將22.5mL甲醇加入到25℃下的干燥的過濾的混合物中，然后在5分鐘內(nèi)加入0.26mL甲醇∶氫氧化銨水溶液(3∶1)。用Simvastatin銨鹽接種混合物并老化10分鐘，然后在1小時(shí)內(nèi)再逐滴加入7.2mL甲醇/氫氧化銨，在2.5小時(shí)內(nèi)將混合物冷卻至-10℃，并再老化1小時(shí)。過濾產(chǎn)物并用5mL冷(0℃)甲醇洗滌，真空干燥得到的白色晶體，以便得到Simvastatin銨鹽。
步驟2將剩余的Lovastatin酸(作為銨鹽)生物轉(zhuǎn)化成三醇酸按照實(shí)施例6中步驟3的方法進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例8Simvastatin銨鹽的內(nèi)酯化以及純Simvastatin內(nèi)酯的結(jié)晶和分離步驟1Simvastatin銨鹽的內(nèi)酯化在氮?dú)夥障聦⒄麴s水(20mL)、冰醋酸(40mL)和丁基化羥基苯甲醚(BHA，50mg)加入到250mL3頸園底燒瓶中，該批物料溫度調(diào)節(jié)至20-25℃，加入Simvastatin銨鹽(12.5g，27.56mmol)，并在20-25℃下攪拌15分鐘，或直到溶解為止。加入甲磺酸(70%，4.35g，30.8mmol，1.118當(dāng)量)，混合物在20-25℃下老化2小時(shí)，直到內(nèi)酯化反應(yīng)完成多于75%為止。
按照制備例A中的條件用HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)化率。該轉(zhuǎn)化度計(jì)算如下(面積%(Simvastatin銨鹽))/(面積%(Simvastatin銨鹽+Simvastatin)) ×100%步驟2純Simvastatin的結(jié)晶和分離用粗Simvastatin晶種(60mg)將該批物料接種，并在20-25℃下老化0.5小時(shí)。在3小時(shí)內(nèi)加入蒸餾水(22.5mL)(0.13mL/分)，然后加入第二批蒸餾水[在1小時(shí)內(nèi)加入35mL(0.58mL/分)]。將該批物料在20-25℃下老化1小時(shí)，然后用28W/W%氫氧化銨(4.0mL)逐滴加入來處理。
該批物料在20-25℃下老化1小時(shí)，并過濾收集Simvastatin粗晶體，用2∶1的蒸餾水和乙酸乙酯(50mL)、蒸餾水(50mL)和1∶1的甲醇和蒸餾水(50mL)洗滌Simvastatin粗濕濾瓶。在25-30℃下用氮?dú)獯祾卟⒄婵崭稍镌摦a(chǎn)物一整夜，得到Simvastatin的粗白色針狀物(10.38g，HPLC測(cè)定，98W/W%)。
實(shí)施例9純Simvastatin的結(jié)晶和分離在氮?dú)夥障?，將粗Simvastatin(10g，23.89mmol)和丁基化羥基苯甲醚(50mg)加入到含有126.4mL脫氣甲醇的燒瓶中，將該批物料溫度調(diào)節(jié)至20-25℃，并攪拌15分鐘直到固體溶解。該溶液通過活性炭的ECOSORB C
床層過濾，該床層的組成為水、活性炭、纖維素纖維、苯乙烯二乙烯苯和陰離子交換樹脂[91.5g甲醇(50mL)洗滌的ECOSORB C
]。并且該炭餅用40mL脫氣甲醇洗滌。將合并的甲醇溶液移到250mL 3頸園底燒瓶中并在氮?dú)夥障录訜嶂?8-40℃。在30分鐘內(nèi)在液面以下加入脫氣蒸餾水(83.3mL)(2.78mL/分)，并在38-40℃下老化30分鐘。經(jīng)1小時(shí)將該批物料冷卻至25℃，在1小時(shí)內(nèi)于25℃在液面以下加入脫氣蒸餾水(83.3mL)(1.38mL/分)，并經(jīng)1小時(shí)將其冷卻至10-15℃。
將該漿液過濾，在10℃下用50mL50%甲醇/蒸餾水(V/V)洗滌濕濾餅。在35-40℃下用氮?dú)獯祾卟⒄婵崭稍镌摦a(chǎn)物一整夜，得到純Simvastatin白色針狀物(9.49g，HPLC測(cè)定＝99W/W%)。
實(shí)施例10篩選用于Lovastatin酯酶活性的真菌微生物列于下表Ⅰ中的菌株在10mL培養(yǎng)基EN中生長48至72小時(shí)，然后將Lovastatin(對(duì)于該篩選敘述在第2欄中)或Simvastatin(對(duì)于該篩選敘述在第3欄中)以它們的銨鹽形式加入到燒瓶中至最終濃度為2.5g/L。在用薄層色譜分析用于Lovastatin或Simvastatin轉(zhuǎn)化成三醇酸的流體培養(yǎng)基之前，將該培養(yǎng)基再保溫培養(yǎng)96小時(shí)。通過TLC板的密度掃描將水解程度定量，并與使用標(biāo)準(zhǔn)濃度的Lovastatin銨鹽、Simvastatin銨鹽和三醇酸銨鹽的純樣品的平行試驗(yàn)對(duì)比。

實(shí)施例11篩選用于Lovastatin酯酶活性的放線菌類將列于下表Ⅱ的菌株在10mL YN流體培養(yǎng)基(1%肉膏、0.5%酵母提取物、0.5%葡萄糖、0.6%胨，PH7.2)或10mL ISP-1培養(yǎng)基中生長72小時(shí)，然后將lovastatin(對(duì)于該篩選敘述在第2欄中)或simvastatin(對(duì)于該篩選敘述在第3欄中)以它們的銨鹽形式加入到燒瓶中至最終濃度為2.5g/L。在用薄層色譜法分析用于lovastatin或simvastatin轉(zhuǎn)化成三醇酸的流體培養(yǎng)基之前，將該培養(yǎng)基再保溫培養(yǎng)96小時(shí)。通過TLC板的密度掃描將水解程度定量。
權(quán)利要求
1.一種從式(4)化合物與雜質(zhì)式(1)化合物的混合物中分離式(4)化合物的方法，
該方法包括用能夠選擇性分裂Lovastatin的2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈的微生物的培養(yǎng)基，或用由該微生物的培養(yǎng)基得到的水解酶處理所說化合物的混合物，以便轉(zhuǎn)化式(1)化合物成為式(2)化合物，
(2)三醇酸/鹽并且分離和離析以開環(huán)酸、鹽或酯形式的式(4)和式(2)化合物，其中M3和M4獨(dú)自地為(a)H，(b)Li、Na或K，(c)Ca或Mg，(d)Al、Fe、Zn、Cu、Ni或Co，(e)精氨酸、賴氨酸、α，β-二氨基丁酸或?yàn)醢彼幔?f)叔辛基胺、二芐胺、乙二胺、嗎啉或三(羥甲基)氨基甲烷，或(g)NH4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中微生物培養(yǎng)基是真菌培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說的真菌選自下述種屬(a)Clonostachys，(b)Emericella，(c)Diheterospora，(d)Humicola，(e)Dichotomonyces，(f)新赤殼屬(Neocosmospora)，(g)帚霉屬(Scopulariopsis)，(h)Xylogone，(i)Torulomyces，和(j)棱孢殼屬(Thievela)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的真菌為(a)Clonostachys compactiuscula，(b)Monascus ruber，(c)Mortierella isabellina，(d)Emericella unguis，(e)Diheterospora chlamydosporia，(f)Humicola fuscoatra，(g)Dechotomomyces cejpii，(h)Neocosmospora africana，(i)Xylogone sphaerospora，(j)Torulomyces ragena，(k)Thielavia fimeti，(l)Aspergillus unguis，(m)卷枝毛微(Mucor circinelloides)，(n)腐皮鐮孢(Fusarium solani)，(o)產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)，(p)棒曲霉(Aspergillus clavatus)，(q)Scopulariopsis communis，(r)Gilmaniella humicola，(s)Mucor bainieri，(t)tricharus spiralis，或(u)Chaetomium cochliodes。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的真菌為(a)Clonostachys compactiuscula，(b)Humicola fuscoatra，(c)Neocosmospora africana，(d)Xylogone sphaerospora，或(e)Scopulariopsis communis。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說的真菌為Clonostachys compactiuscula(ATCC74178或38009)或其突變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的混合物用從其中的培養(yǎng)基得到的純化形式的水解酶來處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的微生物培養(yǎng)基是細(xì)菌培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，基中所說的細(xì)菌為放線菌類。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所說的放線菌類選自下述種屬(a)鏈霉菌屬(Streptomyces)，(b)游動(dòng)單孢菌屬(Planomonospora)，和(c)Kibdelosporangium。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所說的放線菌類選自如下(a)白淺灰鏈霉菌(Streptomyces albogriscolus)，(b)寡生孢鏈霉菌(Streptomyces paucisporogenes)，(c)吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopius)，(d)產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)，(e)排孢游動(dòng)單孢菌(Planomonospora parontospora)，和(f)Kibdelosporangium aridum。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的式(4)化合物與雜質(zhì)式(1)化合物的混合物是通過式(1)化合物的直接甲基化而產(chǎn)生的，而且其中的式(4)化合物通過高壓液相色譜(HPLC)或結(jié)晶法來分離并將其回收。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中式(1)化合物或其鹽的直接甲基化包括用式CH3X和M+1NR1R2-來處理，其中X為a)氯，b)溴，或c)碘;M+1為a)Li+，b)Na+，或c)K+;和R1和R2為a)獨(dú)自地為C1-3烷基，或b)R1和R2一起相連并與它們連接的氮原子形成5元或6元雜環(huán)如吡咯烷或哌啶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中X是碘，R1R2一起相連并與它們連接的氮原子形成吡咯烷，且M3和M4為NH4或K。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中式(4)產(chǎn)物用結(jié)晶法離析和分離。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說的產(chǎn)物用HPLC來分離。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中式(2)和式(4)化合物的分離和離析包括(a)用乙酸異丙酯和甲磺酸處理，以形成式(3)和式(5)的內(nèi)酯，和(b)通過HPLC或結(jié)晶法來分離和提純式(3)和式(5)的內(nèi)酯，以及(c)以式(3)和式(5)的閉環(huán)內(nèi)酯形式來回收所說的產(chǎn)物。
18.一種以其回收的量制備式(5)化合物或其鹽的方法，
(5)Simvastatin該方法包括，通過將式(6)的內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成開環(huán)酸而直接甲基化式(6)化合物，
(6)Lovastatin接著用式CH3X和M+1NR1R2-處理，其中X為(a)氯，(b)溴，或(c)碘;M+1為(a)Li+，(b)Na+，或(c)K+;和R1和R2為(a)獨(dú)自地為C1-3烷基，或(b)R1和R2一起相連并與它們連接的氮原子形成5元或6元雜環(huán)如吡咯烷或哌啶;隨后用能夠選擇性分裂Lovastatin的2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈的微生物培養(yǎng)基或由該微生物培養(yǎng)基得到的水解酯來處理，之后進(jìn)行內(nèi)酯化，然后用HPLC或結(jié)晶法來分離并回收式(5)產(chǎn)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中X為碘，R1R2一起相連并與它們連接的氮原子形成吡咯烷，且M3和M4為NH4或K。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所說的式(4)的產(chǎn)物用結(jié)晶法來離析和分離。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所說的產(chǎn)物用HPLC來分離。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所說的混合物用Clonostachys compactiuscula(ATCC74178或38009)的水解酶的提純形式來處理。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中內(nèi)酯化包括用乙酸異丙酯和甲磺酸來處理，以形成式(3)和式(5)的內(nèi)酯。
(3)二醇內(nèi)酯 (5)Simvastatin
全文摘要
在直接甲基化Lovastatin來合成Simvastatin中，通過使用能夠水解2-甲基丁酰氧基側(cè)鏈的細(xì)菌或真菌或這類微生物的突變體或從其中得到的無細(xì)胞提取液或從其中得到的水解酶來處理而將剩余的Lovastatin、Lovastatin酸或其鹽進(jìn)行選擇性水解，得到7-[1′、2′、6′、7′、8′、8a′(R)-六氫-2′(S)，6′(R)-二甲基-8′(S)-羥基-1′(S)萘基]-3(R)，5(R)-二羥基庚酸，即三醇酸或三醇鹽，其在內(nèi)酯化成為內(nèi)酯形式之前或之后很容易與Simvastatin分離。該方法產(chǎn)生了高收率和高純度的Simvastatin。
文檔編號(hào)C12R1/88GK1083111SQ93102509
公開日1994年3月2日 申請(qǐng)日期1993年2月6日 優(yōu)先權(quán)日1992年2月7日
發(fā)明者M·J·康達(dá), G·L·蒂沃爾特, S·J·西安西奧西, E·T·皮斯克 申請(qǐng)人:麥克公司