專利名稱：同種異體皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人體皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)方法，更確切地說是涉及同種異體皮膚的培養(yǎng)方法。
對(duì)于大面積深度燒傷及外傷性皮膚缺損等患者的創(chuàng)面修復(fù)治療，目前大都采用自家植皮或自體皮漿、異體供皮等方法，存在皮源少、取皮植皮方法繁鎖、患者痛苦大、創(chuàng)面愈合時(shí)間長、術(shù)后殘留疤痕等問題。
為解決皮源缺乏及皮膚缺損的修復(fù)治療問題，近年來國內(nèi)外相繼開展了人體皮膚細(xì)胞的體外培養(yǎng)工作及研究生產(chǎn)人工合成生物敷料等。人體皮膚細(xì)胞包括表皮細(xì)胞及真皮成纖維細(xì)胞，兩種細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)則存在細(xì)胞間的吞噬作用，目前僅有表皮細(xì)胞的培養(yǎng)及其用培養(yǎng)的同種異體表皮細(xì)胞覆蓋創(chuàng)面的報(bào)導(dǎo)，但存在覆蓋創(chuàng)面愈合不牢固、不耐磨、易破損而形成潰瘍、疤痕等缺陷。
本發(fā)明的目的是研究同種異體皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)方法，特別是真皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的方法對(duì)同種異體皮源進(jìn)行表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的分別培養(yǎng)，在兩種細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到增殖高峰時(shí)，分期分別進(jìn)行同種異體創(chuàng)面移植，達(dá)到早期愈合創(chuàng)面的治療目的。
本發(fā)明同種異體皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)方法是在嚴(yán)格無菌條件下取同種異體健康者的少量皮膚組織，一般為1-2cm2，用洗液洗干凈，洗液采用D-Hank′s液，加入防細(xì)菌感染的青霉素100萬單位/ml、鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml，然后剪除皮下脂肪組織等，制成中厚皮片，再用上述洗液充分沖洗皮片至無油滴為止。
取0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶，按1∶1體積比混合，加入防細(xì)菌污染的青霉素100萬單位/ml、鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml，配制成皮細(xì)胞消化液。通常EDTA和胰蛋白酶是單獨(dú)應(yīng)用的，胰蛋白酶毒性大但細(xì)胞消化作用快，EDTA毒性小但細(xì)胞消化作用慢，本發(fā)明將它們混合應(yīng)用。將處理好的皮片置入皮細(xì)胞消化液中，在4℃的環(huán)境中冷消化12-18小時(shí)，分離出表皮組織和真皮組織，然后再次分別進(jìn)行30-60分鐘消化，分離出表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞。
在皮片消化過程中準(zhǔn)備培養(yǎng)瓶，將幫助細(xì)胞貼壁的鼠尾膠源鋪滿瓶底，瓶口用氨水棉球塞堵，約15分鐘后鼠尾膠源凝固，再用加有青霉素100萬單位/ml、鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml的D-Hank′s洗液清洗干凈放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)備用。
按4∶1體積比混合DMEM培養(yǎng)基和小牛血清FCS，如果制備100ml的培養(yǎng)液，則DMEM取80ml，小牛血清取20ml，再按比例加入胰島素5μg/ml，氫化可的松0.5μg/ml，青霉素100萬單位/ml，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml，配制成復(fù)合培養(yǎng)液。所配制的復(fù)合培養(yǎng)液，PH值為中性，一般在7.2～7.4間，不用再調(diào)整。如果不滿足則用碳酸氫納或鹽酸調(diào)整到中性。通常皮細(xì)胞培養(yǎng)液中還包括有促進(jìn)表皮生成的表皮生長因子，但本發(fā)明實(shí)施例中沒有采用，效果更好。將分離好的表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞分別置入經(jīng)處理過的培養(yǎng)瓶中，加足復(fù)合培養(yǎng)液，25ml的培養(yǎng)瓶一般加3～5ml的復(fù)合培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)表明0.5～1cm2的皮源，可在25ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)，各制備3瓶表皮細(xì)胞和3瓶真皮成纖維細(xì)胞。
表皮細(xì)胞4天有細(xì)胞分裂相出現(xiàn)，7～10天達(dá)到增殖高峰，真皮成纖維細(xì)胞7天左右有細(xì)胞分裂相出現(xiàn)，二周達(dá)到增殖高峰。
在兩種細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，根據(jù)細(xì)胞的生長情況，決定加或不加L-谷氨酰胺，細(xì)胞生長不好有自然老化現(xiàn)象時(shí)則加，細(xì)胞生長好則不加或少加。而通常情況下，L-谷氨酰胺是作為復(fù)合培養(yǎng)液的成份之一的。
按本發(fā)明的培養(yǎng)方法共培養(yǎng)表皮細(xì)胞38次，細(xì)胞均在7～10天達(dá)到增殖高峰，共培養(yǎng)真皮成纖維細(xì)胞26次，細(xì)胞均在二周左右時(shí)達(dá)到增殖高峰。
將培養(yǎng)瓶內(nèi)壁上的細(xì)胞分別用前述皮細(xì)胞消化液消化下來，制成每ml培養(yǎng)液含2×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，根據(jù)創(chuàng)面大小，先涂灑真皮成纖維細(xì)胞懸液，經(jīng)3～5天真皮成纖維細(xì)胞成活后，再將表皮細(xì)胞懸液呈點(diǎn)狀移植于網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)的真皮成纖維細(xì)胞上。上述移植，共做臨床應(yīng)用12例，創(chuàng)面一般在細(xì)胞分期移植后2～3周愈合，治愈率100%。移植后的創(chuàng)面更接近正常皮膚組織，并無殘留疤痕、細(xì)胞較為牢固，經(jīng)臨床觀察，亦無明顯排斥反應(yīng)，用X小體、Y小體鑒定證實(shí)為給體者的皮膚組織細(xì)胞。
本培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)是取少量的皮膚組織可培養(yǎng)出大量的皮膚細(xì)胞，修復(fù)大面積的創(chuàng)面，不僅解決了皮源少的困惑，而且避免了患者取皮、植皮等治療上的繁鎖過程及痛苦，同時(shí)縮短了療程。
權(quán)利要求
1.一種同種異體皮膚的培養(yǎng)方法，其特征在于是采用下列操作1)取健康者皮膚組織，剪除皮下脂肪，制成中厚皮片，用加入青霉素100萬單位，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml的D-hank′s洗液充分沖洗至無油滴；2)取0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶，按1∶1體積比混合，按比例注入青霉素100萬單位/ml，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml，配制成皮細(xì)胞消化液，將處理好的皮片置入皮細(xì)胞消化液中，在4℃環(huán)境中冷消化12～18小時(shí)，分離出表皮組織和真皮組織，再次分別進(jìn)行30～60分鐘消化，分離出表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞；3)將幫助細(xì)胞貼壁的鼠尾膠源鋪滿培養(yǎng)瓶底，瓶口用氨水棉球塞堵，在鼠尾膠源凝固后用注入青霉素100萬單位/ml，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml的D-hank′s洗液清洗干凈；4)按4∶1體積比混合DMEM培養(yǎng)基和小牛血清FCS，按比例加入胰島素5μg/ml，氫化可的松0.5μg/ml，青霉素100萬單位/ml，鏈霉素100μg/ml及兩性霉素0.25μg/ml配制成復(fù)合培養(yǎng)液，將分離好的表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞分別置入上述培養(yǎng)瓶中，加足復(fù)合培養(yǎng)液，在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同種異體皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的操作步驟4)中，由細(xì)胞生長情況加入表皮生長因子L-谷氨酰胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人體皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為解決皮源少等問題而研制。該方法是先取少量皮膚組織制成皮片，處理并沖洗至無油滴。將皮片置入皮細(xì)胞消化液中冷消化，分離出表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞，再分別置入涂有鼠尾膠源的培養(yǎng)瓶中，加足由DMEM、FCS、胰島素、氫化可的松、青鏈霉素及兩性霉素混合配制的培養(yǎng)液，分別在37℃、5％CO
文檔編號(hào)C12N5/02GK1074708SQ9310165
公開日1993年7月28日 申請(qǐng)日期1993年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月22日
發(fā)明者岳毅, 王彧 申請(qǐng)人:北京郵電醫(yī)院