專(zhuān)利名稱(chēng)：人工合成的轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及肽類(lèi)的體外合成，尤其涉及在大腸桿菌(Es-cherichia coli)的核糖體上利用人工合成的tRNA來(lái)合成新生的肽類(lèi)。
在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里，科學(xué)家們一直在試圖發(fā)展一種方法學(xué)，以便能在活細(xì)胞體外有效地修飾和產(chǎn)生蛋白質(zhì)。這種努力的一個(gè)技術(shù)組成部分就是通過(guò)改變酶促氨酰化反應(yīng)的反密碼子或識(shí)別位點(diǎn)而進(jìn)行的tRNA的修飾。通過(guò)產(chǎn)生一組修飾過(guò)的tRNA均能閱讀的一個(gè)單個(gè)的新密碼子，修飾的tRNA使在蛋白質(zhì)的靶位點(diǎn)上替換不同的氨基酸變得相對(duì)簡(jiǎn)單了。
通過(guò)使用一組修飾的tRNA，每一個(gè)對(duì)應(yīng)一種不同的氨基酸，可在蛋白質(zhì)的目的靶位點(diǎn)上摻入特異的氨基酸。因?yàn)槿我惑w系在大多數(shù)情況下只合成一種蛋白質(zhì)，所以氨基酸替換對(duì)于多肽活性的影響可以直接測(cè)定，不必為每一種氨基酸的替換制備克隆，不會(huì)遇到與表達(dá)相關(guān)的常出現(xiàn)的問(wèn)題，也避免了隨后對(duì)在完整細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的測(cè)試。
最終，隨著根據(jù)氨基酸順序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的能力的改進(jìn)，通過(guò)使用僅包含20個(gè)密碼子的mRNA，可以產(chǎn)生全人工設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。其中每一個(gè)密碼子與自然存在的20種蛋白質(zhì)一一對(duì)應(yīng)。(在通用的遺傳密碼中均有一個(gè)密碼子與這20種氨基酸相對(duì)應(yīng)。)通過(guò)使用含有反密碼子的修飾后的tRNA，氨基酸也可以摻入蛋白質(zhì)上一個(gè)或多個(gè)特異位點(diǎn)，這些反密碼子對(duì)應(yīng)于未使用的41種密碼子中的某些密碼子。更進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)修飾過(guò)的tRNA的進(jìn)行化學(xué)而不是酶促氨酰化反應(yīng)，有可能將在自然界中不存在相應(yīng)tRNA的氨基酸摻入到這些人工合成的蛋白質(zhì)中去。這使得將來(lái)有可能可以設(shè)計(jì)、測(cè)試和生產(chǎn)那些使用在活的有機(jī)體內(nèi)不存在的催化機(jī)理和底物的人工酶。
tRNA與一種特異的氨基酸的酰化反應(yīng)可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或酶促反應(yīng)而進(jìn)行，后者使用氨?；?tRNA合成酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)AS)。tR-NA的化學(xué)氨酰化反應(yīng)的過(guò)程已經(jīng)知曉。(見(jiàn)S.A.Robertson等(1989)NuclAcid Res.179649-9660和M.Hagen等(1988)J.org.Chem.535040-5045)。
在活的體系，AS必須高特異性地識(shí)別將要氨?；膖RNA和氨基酸。AS對(duì)一種tRNA的識(shí)別取決于tRNA的特異性的結(jié)構(gòu)特性。在不同的tRNA中，并不存在一種單一的結(jié)構(gòu)特征，使它們相應(yīng)的AS能夠特異識(shí)別它們。(見(jiàn)C.de Duve(1988)Nature 333117-118)。在不同的生物體中，一種特定的tRNA的許多結(jié)構(gòu)特征，并不是非常地保守。以來(lái)源于大腸桿菌、酵母和免子網(wǎng)狀細(xì)胞的AS，在氨?；磻?yīng)進(jìn)行的條件下(鹽濃度、精胺或亞精胺濃度、溫度)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人工合成的tRNA的氨?；奶禺愋杂泻艽蟮淖兓Ｒ呀?jīng)知道tRNA被相應(yīng)的AS識(shí)別的某些原則。一些AS似乎對(duì)所有的反密碼子都有嚴(yán)格的要求，而另一些僅識(shí)別部分反密碼子。Met-tRNA AS嚴(yán)格依賴(lài)于反密碼子CAU，(G.Ghosh et al(1990)Biochem 292220-2225)其他tRNA的AS也許對(duì)反密碼子的第二個(gè)或第三個(gè)核苷酸有要求。
至于其他氨基酸，看來(lái)是識(shí)別tRNA的與反密碼子無(wú)關(guān)的特征，并且對(duì)應(yīng)于存在tRNA結(jié)構(gòu)其它地方的正的識(shí)別位點(diǎn)，在某些情況下對(duì)應(yīng)于負(fù)的識(shí)別位點(diǎn)。
Schimmel和Hou的結(jié)果表明在tRNAAla的氨基酸基上G3-C70堿基對(duì)是Ala-tRNA AS的主要識(shí)別位點(diǎn)(Y.M.Hou et al(1988)Nature 333140-145)。
現(xiàn)在在體外設(shè)計(jì)和生產(chǎn)人工合成的被酶促氨酰化的tRNA已成為可能，這種tRNA能夠用于無(wú)細(xì)胞的翻譯體系。這些合成的tR-NA在闡明核糖體的功能，尤其關(guān)于新生的肽在核糖體內(nèi)的移動(dòng)及其折疊成有活性的構(gòu)象方面可能有重要的價(jià)值。當(dāng)新生的肽在核糖體形成時(shí)，關(guān)于它的準(zhǔn)確位置和構(gòu)象，至今仍不清楚。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供人工合成的tRNA。
本發(fā)明的另一目的在于提供生產(chǎn)合成tRNA的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的在于使用人工合成的tRNA在體外提供增強(qiáng)的多肽。
根據(jù)本發(fā)明，tRNACys，tRNASer，tRNAAlae和tRNAAlai由

圖1A-D所示的DNA序列所編碼。
本發(fā)明的據(jù)信是具有新穎性的特征，在附錄的權(quán)利要求中將詳細(xì)地陳述。通過(guò)參考以下描述及有關(guān)附圖，將有助于更好地理解本發(fā)明本身及其目的和優(yōu)點(diǎn)。
附圖包括圖1顯示pCYS，pSER，pALA和pFMET的序列。tRNACys(AAA)和tRNASer(GGA)的序列來(lái)自于M.Sprinzl等(1984)Nu-cl.Acid Res.12r1-r131。限制性酶切位點(diǎn)的位置及17個(gè)堿基的T7RNA聚合酶啟動(dòng)子(在圖上)被指明。在每個(gè)序列上方的字母，代表了存在于野生型的序列中，而現(xiàn)在被替換的核苷酸。對(duì)每一個(gè)tRNA，反密碼子AAA下自有劃線(xiàn)。
1AtRNACys(AAA)基因(pCYS或序列識(shí)別編號(hào)No.1)由四個(gè)寡核苷酸構(gòu)建而成。這些寡核苷酸退火后連接在經(jīng)Hind Ⅲ/Bam HI消化的PUC18質(zhì)粒上。四種寡核苷酸以在pCYS序列上方和下方的實(shí)線(xiàn)標(biāo)出。在pCYS序列的上方的星號(hào)顯示表示這里有一個(gè)堿基插入。
1BtRNASer(AAA)基團(tuán)(pSER或序列識(shí)別編號(hào)No.2)是這樣構(gòu)建的通過(guò)使用兩個(gè)特異性引物的PCR方法，從大腸桿菌的基因組中復(fù)制得到tRNASer(GGA)基因。在pSER序列的上方和下方用實(shí)線(xiàn)標(biāo)明這些引物。在pSER中，由T到A的替換是為了增加氨?；磻?yīng)。
1CtRNAAlae(AAA)基因(pALA或序列識(shí)別編別No.3)是通過(guò)PCR方法，從大腸桿菌的基因組中復(fù)制得到tRNAALA(GGC)基因而構(gòu)建的。
1DtRNAAlai(AAA)基因(pFMET或序列識(shí)別編號(hào)No.4)是通過(guò)PCR方法，從大腸桿菌的基因組中復(fù)制得到tRNAMetf(CAT)基因而構(gòu)建的，在pFMET序列上方的星號(hào)表示這里有一個(gè)堿基插入。
圖2是在poly(U)引導(dǎo)的延伸過(guò)程中，在新生肽的氨基末端的探針的熒光各向異性。多肽合成是由CPM-Phe-tRNA(A)或CPM-Ser-tRNA(B)開(kāi)始的，在此期間測(cè)定各向異性。在A和B中，多聚苯丙氨酸(poly(Phe))合成用空心三角和點(diǎn)狀線(xiàn)(……)表示;多聚半胱氨酸(poly(Cys))合成用空心圓圈和破折線(xiàn)(----)表示;多聚絲氨酸用空心圓圈和實(shí)線(xiàn)(-)表示。在60分鐘內(nèi)測(cè)量各向異性(采用20℃，熒光受激發(fā)波長(zhǎng)為385nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為475nm)。
圖3是poly(U)引導(dǎo)的采用tRNAAlae(AAA)的多聚丙氨酸(poly(Ala))的合成。Ac Phe-tRNA(0.5μm)預(yù)先結(jié)合于poly(U)編序(poly(U)-programmed)的核糖體(0.5μM)，以便在0.1ml終體積中以0.3A260的tRNAAlai(AAA)(空心標(biāo)記)或0.1A260的tRNAAlae(AAA)(實(shí)心標(biāo)記)作為延伸的tRNA來(lái)源而進(jìn)行的多聚丙氨酸的合成更方便。
在37℃保溫時(shí)用0.5M NaOH使所有氨?；膖RNA去?；?，并用5ml10%的冰冷的三氯乙酸(TCA)沉淀多聚丙氨酸，再測(cè)定沉淀物的放射性，以確定[14C]丙氨酸的摻入。同時(shí)測(cè)定在4μM紅霉素存在情況下多聚丙氨酸的合成，以作對(duì)照(……)。
圖4是游離的或者與核糖體結(jié)合的延伸物成起始物CPM-Ala-tRNAAla(AAA)的發(fā)射光譜。
A.對(duì)游離的tRNA(-)和與核糖體結(jié)合的tRNA(……)的測(cè)量在總體積為600μl中進(jìn)行。核糖體濃度為0.5μM。加入核糖體之后，反應(yīng)混合物在37℃保溫15分鐘。熒光測(cè)量采用激發(fā)波長(zhǎng)385nm，在20℃進(jìn)行。在測(cè)量結(jié)束之后，加入紅霉素至終濃度為4μM。并監(jiān)測(cè)紅霉素對(duì)每種與核糖體結(jié)合的的tRNA的光譜的結(jié)合效應(yīng)(……)。
B.在另外的實(shí)驗(yàn)中，在核糖體結(jié)合后，每種tRNA的發(fā)射光譜都經(jīng)過(guò)測(cè)量。隨后加入稀疏霉素(終濃度＝5μM)測(cè)定發(fā)射光譜，然后加入嘌呤霉素至濃度為0.5mM，再次測(cè)量發(fā)射光譜(-…-…)。在嘌呤霉素存在條件下，測(cè)量發(fā)射光譜結(jié)束之后，測(cè)量每一樣品的熒光各向異性，以確信沒(méi)有發(fā)生各向異性的下降，這種下降表明了嘌呤霉素的反應(yīng)性。
當(dāng)新生的肽從核糖體延伸出來(lái)時(shí)，其構(gòu)象很可能在決定最后的肽產(chǎn)物如何折疊方面，是很關(guān)鍵的。令人信服的證據(jù)已經(jīng)有所報(bào)導(dǎo)一部分，也可能所有的，從天然的mRNA產(chǎn)生的新生的肽，在核糖體的大亞基外表面相對(duì)于肽基轉(zhuǎn)移酶中心的遠(yuǎn)端，退出核糖體。(C.Bernaeu et al(1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 793111-3115)。新生的肽的包含30至40個(gè)氨基酸的部分，被核糖體保護(hù)著不被降解。(L.I.Makin et al.(1967)J.Mol.Biol.26329-346)這也許反映了橫跨肽基轉(zhuǎn)移酶中心和出口區(qū)域所需的肽的長(zhǎng)度。
天然的新生肽離開(kāi)肽基轉(zhuǎn)移中心時(shí)它們的構(gòu)象如何，還不清楚。W.D.Picking et al.((1990)J.Biol.Chem.2661534-1542)已經(jīng)證實(shí)，分別由poly(U)和poly(A)形成的正在延伸的新生的苯丙氨酸(Phe)和賴(lài)氨酸(lys)，兩者行為相當(dāng)不同。為了理解這些研究的結(jié)果，能夠促進(jìn)poly(U)指導(dǎo)的多肽合成的人工合成的tR-NA，已被制造出來(lái)。
材料和化學(xué)藥品下面列出此申請(qǐng)中用到的縮寫(xiě)及其定義EDTA，乙二胺四乙酸二鈉鹽;HEPES，N-(2-羥基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸;TRIS，三羥基甲胺;Poly(U)，聚尿苷酸;Poly(A)，聚腺苷酸;AcPhe-tR-NA，在其α-氨基被?；腜he-tRNA;CPM-Phe-tRNA，Phe-tRNA，在其α-氨基被巰基乙?；缓笈cCPM反應(yīng);CPM-Ser-tRNA，Ser-tRNASer(AAA)在其α-氨基被巰基乙?；缓笈cCPM反應(yīng);CPM，3-(4-順丁烯亞氨苯基)-7-二乙氨基-4-甲基香豆素;tRNACys(AAA)，含有一個(gè)AAA反密碼子的合成tRNACys(AAA);tRNASer(AAA)，含有一個(gè)AAA反密碼子的合成tRNASer;tRNAAlae(AAA)，含有一個(gè)AAA反密碼子的合成延伸物tRNA;tRNAAlai(AAA)，含有一個(gè)AAA反密碼子的合成起始物tRNA;LB，Lennox LB培養(yǎng)基;X-Gal，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷;PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
PUC18質(zhì)粒構(gòu)自Bethesda Research Laboratories(Gaithers-burg，MD)。寡聚脫氧核糖核苷酸在Applied Biosystems公司(Foster City，CA)的381A合成儀上合成，在Applied Biosystems的OPC柱上，根據(jù)制造者的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。DNA聚合酶的Klenow片段、T4DNA連接酶，RNasin(核糖核酸酶阻抑蛋白)和限制在內(nèi)切酶得自Promega Biotec(Madison，WI)、限制性?xún)?nèi)切酶Bst NI和Bst BI購(gòu)自New England Biolabs(Beverly，MA)，PCR試劑來(lái)自Perkin-Elmer Cetus(Norwalk，CT)雙鏈測(cè)序使用自United States Biochemicals(Cleveland，OH)的測(cè)序酶Ⅱ試劑盒。[α-35S]dATP，[35S]半胱氨酸(Cys)、[14C]苯丙氨酸(Phe)和[14C]絲氨酸(Ser)購(gòu)自New England Nuclear(Boston，MA)，脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸及鳥(niǎo)嘌呤核苷一磷酸(GMP)得自Pharmacia(Piscataway，NJ).CPM來(lái)自Molecular Probes(Junc-tion City，OR)。酵母tRNAPhe來(lái)自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO).純化的大腸桿菌起始因子2(IF-2)贈(zèng)自C.Gualerzi博士(Max-Planck-Insitiut fur Molekulare Genetik，Berlin).NuSieve GTG瓊脂糖來(lái)自FMC(Rockland，ME).A202凝膠光譜儀購(gòu)自Fischer Scientific(Houston，TX)。T7RNA聚合酶，根據(jù)P.Davanloo et al(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94971-78所述的程序，從含有質(zhì)粒pAR1219的E.coli BL21中分離得到。大腸桿菌E.coli K12，菌株A19，最初由Drs.K.Nierhaus和H.G.Wittmanu，(柏林)提供給我們。這些生物體的生長(zhǎng)和保存以及核糖體亞基的分離，在O.Odom et al.(1980)Biochemistry195947-5954中已有描述。
pCYS的構(gòu)建選擇人工合成的tRNA與Cys進(jìn)行氨?；且?yàn)镃ys的硫氫基(HS-)基因，能夠容易地、特異地與熒光團(tuán)的順丁烯二酰亞胺或烷基鹵(RX)衍生物起反應(yīng)。以前的研究已經(jīng)表明Cys-tRNA合成酶識(shí)別的，是tRNA接受莖的3∶70堿基對(duì)而不是反密碼子的堿基組成。(Y.M.Hou et al.(1988)Nature 33140-145.)。這樣，可以構(gòu)造一個(gè)在無(wú)細(xì)胞的翻譯體系中識(shí)別poly(U)的Cys-tR-NA。
tRNACys基因(pCYS或序列識(shí)別編號(hào)No.1)含有一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)、T7RNA聚合酶啟動(dòng)子、突變的E.coli基因、Bst NI位點(diǎn)和Bam HI位點(diǎn)。它的合成顯示于圖1A。為了盡可能地保持與野生型tRNACys的相似性，在堿基順序上只改變了三個(gè)位點(diǎn)。首先，反密碼子由ACA變成AAA。其次，為了便于轉(zhuǎn)化子篩選及以后的遺傳操作，構(gòu)造了兩個(gè)內(nèi)部的限制性酶切位點(diǎn)。在D莖上將堿基A21和T24分別變成C21和C24，產(chǎn)生一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)。為了保持莖上的堿基配對(duì)，A10變成了G10。通過(guò)在額外臂上U42和C43中增加一個(gè)A，產(chǎn)生了一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn)。
在分別的反應(yīng)中，5′-3′和3′-5′的Hind Ⅲ/Pst Ⅰ寡核苷酸及5′-3′和3′-5′的PstⅠ/BamHI寡核苷酸，經(jīng)過(guò)加熱到65℃，然后緩慢冷卻至25℃，從而退火連接。兩個(gè)生成的雙鏈寡核苷酸，和Hind Ⅲ/BamHI消化的pUC18產(chǎn)生的三個(gè)片段，加入T4DNA連接酶，在16°保溫過(guò)夜，從而連接并插入到Hind Ⅲ/BamHI消化的pUC18質(zhì)粒中。E.coli XL1B用連接混合物轉(zhuǎn)化，再涂布在含有α-氨基芐青霉素(Amp)和X-gal的LB平板上。帶有包含插入片段的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，因?yàn)橥暾膖RNACys(AAA)基因的存在，所以采用Spe Ⅰ對(duì)質(zhì)粒DNA的少量溶菌產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切分析方法檢出。隨后，插入分段的兩條鏈經(jīng)測(cè)序測(cè)出。
pSER的構(gòu)建和Cys-tRNA合成酶的情形相同，Ser-tRNA合成酶識(shí)別tRNA的其他部分而不是反密碼子。(J.Normanly and J.Abelson(1989)Am.Rev.Biochem.581029-1049.這樣，可以制備用于poly(U)引導(dǎo)的翻譯體系的合成Ser-tRNA。完整的tRNASer(AAA)基因序列(pSER或序列識(shí)別編號(hào)No.2)不是用化學(xué)方法合成的，而是合成兩個(gè)寡核苷酸作為PCR反應(yīng)的引物，從E.coli染色體復(fù)制得到基因(圖1B)，5′引物在含有5′端的4個(gè)額外核苷酸、5′-31HindⅢ序列，T7RNA聚合酶啟動(dòng)子和包含反密碼子AAA在內(nèi)的tRNA的43個(gè)堿基。3′引物含有4個(gè)額外核苷酸、3′-5′Bam HI和Bst NI序列及tRNA的12個(gè)堿基。與野生型的tRNACys相反，在tRNASer的T環(huán)中存在一個(gè)Bst BI限制性位點(diǎn)，因而對(duì)于并不必需的檢出目的，多了一個(gè)新的限制法位點(diǎn)。
0.1ml PCR反應(yīng)包含兩種引物各100p mol，E.coli染色體DNA 20ng，和10單位的Taq I DNA聚合酶。上面覆以礦物油。反應(yīng)按以下程序94℃5分鐘，1個(gè)循環(huán);94℃1分鐘→55℃2分鐘→72℃3分鐘，29個(gè)循環(huán);94℃1分鐘→55℃2分鐘→72℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，反應(yīng)混合物經(jīng)氯仿抽提，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離4%Nusieve GTG瓊脂糖凝膠，用40mM Tris-醋酸(pH7.8)，2mM EDTA)主要產(chǎn)物預(yù)期為124bp的片段。經(jīng)酚抽提除去瓊脂糖之后，124bp的片段的末端用DNA聚合酶的Klenow片段進(jìn)行補(bǔ)平(blunt)，并且用Hind Ⅲ和Bam HI消化。然后，此片段與Hind Ⅲ/Bam HI消化的pUC18一起在T4DNA連接酶存在下，16℃保溫過(guò)夜，從而連接起來(lái)。帶有包含插入的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子E coli XL1B，因?yàn)橥暾膖RNASer(AAA)基因的存在，所以采用Bst BI對(duì)質(zhì)粒DNA的少量溶解物進(jìn)行限制性酶切分析而檢出。插入片段的兩條鏈經(jīng)測(cè)序測(cè)出。
用Bst NI對(duì)pCYS和pSER進(jìn)行消化，結(jié)果產(chǎn)生一個(gè)線(xiàn)性的轉(zhuǎn)錄模板，此模板含有一個(gè)單一的5′伸出的胸腺嘧啶(T)，互補(bǔ)于tRNA3′未端的腺嘌呤(A)。這樣，經(jīng)Bst NI消化的pCYS和pSER的完全轉(zhuǎn)錄預(yù)計(jì)將分別產(chǎn)生75個(gè)和88個(gè)核苷酸的RNA。這些RNA以tRNA接受臂序列3′ACCA而結(jié)束。用終濃度為0.1mg/ml的T7RNA聚合酶，每μgDNA模板產(chǎn)生7-8μg tRNA。雖然，Milligan和Uhlenbeck((1989)Meth，Enzymol.18051-62)報(bào)導(dǎo)過(guò)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄小的RNA時(shí)，會(huì)產(chǎn)生短的流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄(體)，但是在凝膠過(guò)濾層析法(get filtration chromatography)處理之后，20%變性膠的電泳表明只有一種主要的RNA產(chǎn)物繼續(xù)存在。(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。
pALA和pFMET的構(gòu)建另外兩種新的tRNA也在形成。這些tRNAs通過(guò)酶催化和丙氨酸(Ala)起氨?；磻?yīng)，并且擁有可以識(shí)別poly(U)模板的反密碼子AAA。第一個(gè)tRNA，即tRNAAlae(AAA)，被構(gòu)建得與E.coli的延伸物tRNAAla相類(lèi)似。(M.Sprinzl et al.(1985)Nucl.Acid.Res.13rl-r104)tRNAAlae基因(pALA或序列識(shí)別編號(hào)No.3)，其構(gòu)建采用PCR方法，從E.coli基因組中復(fù)制得到tRNAAla(GGC)基因，再將反密碼子GGC變成AAA。然后，使用用于pSER的補(bǔ)平、消化、連接、轉(zhuǎn)化和篩選等過(guò)程，形成pALA。
第二個(gè)tRNA，即tRNAAlai(AAA)，是通過(guò)復(fù)制E.coli的起始物tRNAfMet而構(gòu)建的，并且與之相類(lèi)似。(M，Sprinzl et al.(1985)，Nucl.Acid.Res.13rl-r104)。盡管這個(gè)tRNA的原始結(jié)構(gòu)被修飾過(guò)以用于體外轉(zhuǎn)錄和氨?；磻?yīng)，但是，據(jù)信對(duì)起始物功能是必需的特征被保留了下來(lái)。這些特征包括在接受莖未端的一個(gè)非Wat-son-Crick堿基配對(duì)(B.L.Seong et al.(1987)Proc Natl.Acad.Sci.USA.84334-338H.Wakao et al.(1989)J.Biol Chem.26420363-20371)，一個(gè)在二氫尿嘧啶莖(D莖)上的11位嘧啶-24位嘌呤的堿基配對(duì)(B.L.Seong et al(1987)，和在連續(xù)形成3個(gè)G-C堿基對(duì)的反密碼莖上的，一系列的鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的殘基。(B.L.Seong et al.(1987))。
為產(chǎn)生tRNAAi(AAA)基因(pFMET或序列識(shí)別編號(hào)No.4)對(duì)野生型tRNAfMet的進(jìn)行的修飾如下基因反密碼子的堿基C和T被A代替，形成反密碼子AAA;堿基1C和3C被替換成G;堿基70G和72A被替換成T;基因的堿基17C和17aT之間插入一個(gè)A。然后，用于pSER的補(bǔ)平、消化、連接、轉(zhuǎn)化和篩選等過(guò)程，被用來(lái)形成pFMET。
體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒DNA用BstNI(3U/μg)在60℃消化一小時(shí)，為轉(zhuǎn)錄作準(zhǔn)備?；旌衔锝?jīng)酚抽提后，用乙醇沉淀DNA。線(xiàn)性的DNA(40μg)加入到2ml的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，其中含有50mM Hepe-KOH(pH7.6);10mM二硫蘇糖醇(DTT);50mM Nacl;4mM亞精胺;25mM MgCl2;1.6mM GTP;4mM GMP，ATP，CTP，UTP;50URNasin和0.1mg/ml T7RNA聚合酶。37℃保溫2小時(shí)后，用100U不含核糖酸酶(RNase)的脫氧核糖核酸酸I(DNaseI)消化模板DNA。采用A202凝膠光譜儀，(用10mM Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA，和150mM NaCl使之平衡)，將短的流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄(體)、dNTP和rNTP等與tRNA轉(zhuǎn)錄物用膠過(guò)濾分開(kāi)。tRNA部分用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，然后用乙醇沉淀兩次。
tRNA的氯酰(基)化反應(yīng)用0-70%的硫酸銨((NH4)2SO4)沉淀S150蛋白質(zhì)后，利用沉淀中存在的麥胚合成酶將人工合成的tRNA氨酰(基)化，(S.Lax et al.(1986)，Meth，Enzymol.118109-128).典型的混合物含有100mM Hepes-KOH(pH7.8);15mM Mg(OAC)22mM亞精胺;5mM二硫蘇糖醇(DTT);5mM ATP;30μM各種放射性氨基酸(100Ci/mol);0.8mg/ml合成酶組分和0.5-1A260tRNA/ml。混合物在27℃保溫20分鐘。氨酰(基)化的效率，通過(guò)用三氯乙酸(TCA)沉淀tRNA，再用液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量過(guò)濾后的沉淀物之放射性而確定。
盡管tRNACys(AAA)上從E.coli的野生型tRNACys基因制得的，它不能被E.coli S150組分的合成酶所氨?；?。含有0-70%(NH4)2SO4沉淀的麥胚S150組分的合成酶確實(shí)氨?；藅RNACys(AAA)。這個(gè)酶組分也有效地氨?；撕铣傻膖RNASer(AAA)。根據(jù)僅含有E.coli S150組分的翻譯反應(yīng)，E.coli合成酶也理應(yīng)能氨?；痶RNASer(AAA)(表1)。
用E.coli S150組分作為氨?；鵷RNA合成酶的來(lái)源，將酵母tRNAPhe氨酰(基)化，(B.Hardesty et al.(1971)Meth.Enzy-mol.20316-330)，tRNASer(AAA)、tRNAAlae(AAA)和tRNAAlai(AAA)被上面提及的麥胚的合成酶組分所氨?；?。為了用于非酶促起始的翻譯，Phe-tRNA，Ser-tRNA，Ala-tRNAAlae(AAA)和tRNAAlai(AAA)，采用Rappoport和Lapidot的步驟((1974)Meth-Enzymol 29685-688)，在它們的α-氨基基團(tuán)上被?；?。
氨酰化的效率對(duì)不同的合成tRNA品種是不同的。體外轉(zhuǎn)錄的tRNACys(AAA)僅有大約20%被氨?；?，而用麥胚的合成酶能使55%以上的tRNASer(AAA)氨?；?。(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出).不幸的是，Cys-tRNACys(AAA)是不穩(wěn)定的，這妨礙了它在氨?；蟮姆蛛x。
Cys-tRNACys(AAA)的不穩(wěn)定性妨礙了隨后的純化。但是為了更進(jìn)一步的研究，可以將氨酰化反應(yīng)和大腸桿菌的翻譯反應(yīng)結(jié)合起來(lái)。相反地，通過(guò)重復(fù)Ser-tRNASer(AAA)的純化和用香豆素(coumarin)標(biāo)記的操作，Ser-tRNASer(AAA)是很穩(wěn)定的。
使用麥胚的合成酶或者去除tRNA的E.coliS-150組分作為氨基-tRNA合成酶的來(lái)源時(shí)，tRNAAlae(AAA)的氨?；ǔ＿_(dá)到60%左右(pmol摻入的Ala/pmol tRNA)用兩種制備的合成酶中任何一種時(shí)，tRNAAlai(AAA)的氨酰化達(dá)到大約20%。這兩種tR-NA都沒(méi)有被觀(guān)察到和丙氨酸(Ala)之外的任一種氨基酸發(fā)生氨?；?數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。
表1.
poly(U)引導(dǎo)的(poly(U)-directed)的多聚苯丙氨酸、多聚半胱氨酸和多聚絲氨酸的合成。通過(guò)在37℃5分鐘下，預(yù)先結(jié)合60pmol的Ac Phe-tRNA或者Ac Ser-tRNA時(shí)，(與核糖體的濃度相同)，所有反應(yīng)都是非酶促起始的。所有樣品在37℃保溫30分鐘，在此期間加入NaOH至樣品濃度為0.1M，接著在室溫下放置15分鐘使tRNA-氨基酸之間的鍵水解。在反應(yīng)混合物中的蛋白質(zhì)用三氯乙酸(TCA)沉淀，然后過(guò)濾，過(guò)濾物干燥后，測(cè)量它們的放射性。在測(cè)量[35S]Cys摻入之前，樣品在28℃保溫120分鐘。
反應(yīng) 摻入的氨基酸 抑制多肽 溫度(℃) (pmol) 紅霉素 %由AcPhe-tRNA起始Poly(Phe) 37 1549 -1617 + -5Poly(Cys) 37 99 -58 + 4128 247 -Poly(Ser) 37 499 -47 + 91由AcSer-tRNA起始Poly(Phe) 37 1801 -1797 + 0Poly(Cys) 28 176 -116 + 34Poly(Ser) 37 593 -67 + 89利用人工合成的tRNA進(jìn)行體外翻譯為了測(cè)試tRNACys(AAA)和tRNASer(AAA)的合成反應(yīng)性，將兩者各自用于依賴(lài)于poly(U)的多肽合成。依賴(lài)于poly(U)的[14C]Phe對(duì)多聚苯丙氨酸的摻入，按照O.Odom et al.(1980)所描述的進(jìn)行測(cè)量。為了非酶促起始，在poly(U)存在情況下將0.6μM Ac Phe-tRNA或Ac Ser-tRNA預(yù)先結(jié)合于0.6μM的大腸桿菌核糖體(37℃10分鐘)。(W.D.Picking et al.(1990))。為了檢測(cè)紅霉素(注一種抗菌素)的敏感性(Sensitivity)，在預(yù)保溫步驟之前，加入抗菌素至終濃度5μM。多聚絲氨酸中[14C]Ser的摻入，除了用1.17A260/ml合成的tRNASer(AAA)替換了tRNAPhe(AAA)以外，和多聚苯丙氨酸同樣進(jìn)行。在最終體積100μl中加入E.coli S150組分，使延伸開(kāi)始。
為了協(xié)助依賴(lài)于poly(U)的多聚半胱氨酸的合成，翻譯的分析(assay)作了修改。如上所述，Ac Phe-tRNA或Ac Ser-tRNA(60 pmol)預(yù)先結(jié)合于60pmol的核糖體。然后加入翻譯所需的所有東西(除了tRNA和氨基酸)至100μl。為了使多聚半胱氨酸的合成起始，上面所述的Cys-tRNACys(AAA)的氨?；磻?yīng)偶聯(lián)于翻譯混合物，每種都加入相等體積至最終反應(yīng)體積200μl。然后，反應(yīng)在37℃保溫30分鐘或28℃保溫120分鐘，使tRNACys(AAA)能被麥胚的半胱氨酰-tRNA合成酶再次氨酰基化。為了檢測(cè)每種新生的肽的構(gòu)象和周?chē)h(huán)境，將CPM-Phe-tRNA或CPU-S-tR-NA，按上述所述預(yù)先結(jié)合。為了保證大多數(shù)熒光團(tuán)確實(shí)都結(jié)合，熒光氨?；?tRNA結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的濃度減小到核糖體濃度的10%左右。用CPM標(biāo)記兩種合成的[14C]丙氨酰-tRNA中每一種的氨基酸基團(tuán)，按照前面描述的對(duì)天然的和人工合成的tRNA的標(biāo)記一樣進(jìn)行。CPM-Ala-tRNA的純化，基本按照描述過(guò)的對(duì)CPM-Ser-tRNASer(AAA)純化，采用反相的高效液相層析(HPLC)在C1柱上進(jìn)行。
應(yīng)用人工合成的CYS-tRNA和Ser-tRNA及野生型tR-NAPhe進(jìn)行的體外翻譯，結(jié)果顯示于表1。Cys的摻入在28℃和37℃兩個(gè)溫度下測(cè)量。在較低溫度下，便于麥胚的酶對(duì)tRNACys(AAA)的再次氨?；饔酶?。在poly(U)存在下，AcPhe-tRNA或Ac Ser-tRNA和核糖體以1∶1的摩爾比預(yù)先結(jié)合時(shí)，所有的翻譯反應(yīng)都是非酶促起始的。產(chǎn)生了六種類(lèi)型的帶有新生肽的核糖體的反應(yīng)混合物。其中每三種在氨基未端各分別含有N-Ac Phe和N-Ac Ser。5μM紅霉素抑制每一種多肽合成的敏感性，同樣被測(cè)試。平行地，在未標(biāo)記氨基酸存在下，用[14C]Ac Phe-tRNA來(lái)起始每一種多肽，目的在于估計(jì)在合成每種新生肽時(shí)都完全有活性的核糖體的數(shù)目。(數(shù)據(jù)未列出)在紅霉素存在或不存在的情況下，摻入多聚苯丙氨酸的Phe超過(guò)1500 pmol(表1)，這確定了在多聚苯丙氨酸合成中，反應(yīng)混合物中30%的核糖體(18pmol)是有活性的。利用這個(gè)數(shù)值，可以計(jì)算出新生的多聚苯丙氨酸長(zhǎng)度大約為80個(gè)氨基酸。因?yàn)楹铣傻膖R-NASer(AAA)能被粗制的E.coli S150組分所氨?；虼?，多聚絲氨酸的合成，按照多聚苯丙氨酸合成的方式同樣進(jìn)行。在這種情形中，然后，只有大約500p mol的Ser摻入到多聚絲氨酸。這個(gè)合成被紅霉素抑制大約90%(表1)。僅有10%左右的核糖體在多聚絲氨酸合成中是有活性的。但是，這同樣給出了肽的平均長(zhǎng)度為80個(gè)氨基酸左右(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。
在37℃，30分鐘內(nèi)，99p mol的Cys摻入到多聚半胱氨酸中(被紅霉素抑制41%)(表1)。估計(jì)在多聚半胱氨酸合成中，15%的核糖體(10p mol)是有活性的，這意味著肽平均長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸。需要注意的是，這個(gè)合成是在麥胚氨酰化和E.coli翻譯相偶聯(lián)的系統(tǒng)中進(jìn)行的。在37℃，只有很有限的tRNA能被麥胚合成酶氨?；?。為了校正之，多聚半胱氨酸的合成同樣在28°起始，并在此溫度下反應(yīng)120分鐘。(表1)，這種情況下，摻入了247p mol Cys。象在37℃時(shí)一樣，多聚半胱氨酸合成中有10p mol核糖體具有活性，所以這給出了這種情況下肽平均長(zhǎng)度大約為25個(gè)氨基酸。
在poly(U)引導(dǎo)的翻譯體系，大量的多聚苯丙氨酸合成(長(zhǎng)的平均肽長(zhǎng)度;高比例的的帶有新生肽的核糖體)也許反映了苯丙氨酸肽的非典型特性。用TCA沉淀時(shí)，短的苯丙氨酸肽似乎比短的絲氨酸肽或短的半胱氨酸肽更容易沉淀。這也許對(duì)Phe摻入的總量相對(duì)較大有貢獻(xiàn)，同時(shí)也可能是在多聚絲氨酸或者多聚半胱氨酸合成中，表現(xiàn)活性的核糖體的百分比相對(duì)較低的一個(gè)主要因素。另外一個(gè)使Phe總摻入量相對(duì)較大的因素是，在多聚苯丙氨酸形成時(shí)，保持肽合成速率基本線(xiàn)性的持續(xù)時(shí)間。在大多數(shù)肽(除了多聚苯丙氨酸)中觀(guān)察到的肽合成速率的下降現(xiàn)象，也許反映了產(chǎn)物的反饋抑制。Spirin等((1988)Science 2421162-1164)觀(guān)察到，當(dāng)肽產(chǎn)物形成時(shí)，如果將產(chǎn)物從反應(yīng)混合物中移去，基本線(xiàn)性的合成速率將持續(xù)很多小時(shí)。新生的多聚苯丙氨酸是如此難以溶解，因此，它們?cè)诜磻?yīng)溶液中能有效地移去。這樣，導(dǎo)致形成與在連續(xù)流動(dòng)的翻譯體系中相同的情形。
在表1中顯示的結(jié)果也表明，poly(U)引導(dǎo)的來(lái)自于合成tR-NA的多聚半胱氨酸和多聚絲氨酸的合成，對(duì)紅霉素的抑制是敏感的。相反，在同樣條件下，多聚苯丙氨酸合成不被這種抗菌素所抑制。這和以前的觀(guān)察是一致的(G.Chinali et al.(1988)Biochem，Biochy.Acta.94971-78;T.Otaka et al(1975)Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 722649-2652;D.Vasquez(1979)Molecular Bi-ology Biochemistry and Biophysics Springer-Verlag，Berlin，vol.30，P.312)，并且支持了這樣的假設(shè)對(duì)紅霉素敏感性的不同，是新生的肽自身特性所導(dǎo)致的結(jié)果。
依賴(lài)于poly(U)的多肽合成，用Ala-tRNAAlae(AAA)和Ala-tRNAAlai(AAA)試驗(yàn)過(guò)。通過(guò)預(yù)先結(jié)合Ala-tRNAAlai(AAA)、Ala-tRNAAlae(AAA)和P-he-tRNA的乙?；苌铮瑓f(xié)助多肽合成。氨酰-tRNA的N-乙?；前凑誖appoport和Lapidot的方法(1974)，與氨基酸N-羥基丁二酰胺酯進(jìn)行的。非酶促的tR-NA結(jié)合于核糖體是在以下條件進(jìn)行的50mM Tris-HCl(pH7.5);100mM NH4Cl;15mM Mg(OAc)2;5mM2-巰基乙醇;0.2mg/ml poly(U);0.5μM核糖體和0.5μM?；膖RNA。多聚丙氨酸合成，除了以[14C]Ala為氨基酸來(lái)源，及以tRNAAlai(AAA)或tRNAAlae(AAA)為tRNA來(lái)源外與前面描述過(guò)的多聚苯丙氨酸和多聚絲氨酸一樣起始。(W.D.Picking et al.(1991)J.Biol.Chem.2661534-1542)使用時(shí)，tRNAAlae(AAA)的終濃度為1A260單位/ml，而tRNAAlai(AAA)濃度為大約3A260單位/ml，以便在所有多聚丙氨酸分析中，使氨?；痶RNA的量的基本相同。按照以前在W.D.Picking et al(1991)所描述的，測(cè)定[14C]Ala對(duì)多聚丙氨酸的摻入。
僅有tRNAAlae(AAA)支持依賴(lài)于poly(U)的多聚丙氨酸(poly(Ala))的合成(圖2)。依賴(lài)于合成延伸物tRNA的poly(Ala)的合成是線(xiàn)性的在37℃時(shí)超過(guò)60分鐘(圖2);在20℃時(shí)更長(zhǎng)，超過(guò)2小時(shí)。(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。相反地，當(dāng)使用tRNAAlai(AAA)時(shí)，poly(Ala)合成僅略高于背景水平(圖2)。在這個(gè)體系，poly(Ala)合成的一個(gè)有趣的特征是，它對(duì)紅霉素的抑制敏感(圖2)。這與poly(Phe)合成對(duì)紅霉素的抗性正好相反。(W.D.Picking et al(1991))。
接著進(jìn)行測(cè)試以確定，是否Ac Ala-tRNAAlai(AAA)或Ac Ala-tRNAAlae(AAA)能夠被非酶促地預(yù)結(jié)合于核糖體以協(xié)助poly(Ala)合成。來(lái)自Ac Ala-tRNAAlae(AAA)的Ala摻入poly(Ala)是相似的，而無(wú)論預(yù)結(jié)合于poly(U)編序的(poly(U)-pro-grammed)70S核糖體上的是Ac Ala-tRNAAlae(AAA)，Ac Ala-tR-NAAlai(AAA)還是Ac Phe-tRNA(表2)。
合成的新生的poly(Ala)鏈的數(shù)量是這樣確定的測(cè)量來(lái)自預(yù)結(jié)合的Ac-[14C]氨?；鵷RNA的放射性標(biāo)記的氨基酸的摻入，然后在未標(biāo)記氨基酸存在下合成poly(Ala)。通過(guò)平行確定帶放射活性的Ala的摻入，和知道合成的新生肽鏈的數(shù)目，就有可能估計(jì)出新生poly(Ala)鏈的長(zhǎng)度。
無(wú)論起始的tRNA是什么，生成的新生的肽的長(zhǎng)度都相近(表2)。這些數(shù)據(jù)的重要特征在于，雖然tRNAAlai(AAA)對(duì)肽的延伸不具功能，但它能結(jié)合到核糖體的P位點(diǎn)，從而允許非酶促起始的肽合成。同樣應(yīng)當(dāng)注意到，與起始的酰基-tRNA無(wú)關(guān)。(即使是Ac Phe-tRNA)，poly(Ala)合成被紅霉素抑制。(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。
表2在預(yù)結(jié)合三種不同的N-封閉(N-blocked)氨?；?tRNA之后的poly(Ala)的合成。
起始新生tRNA 摻入的Ala 起始的新生鏈 鏈長(zhǎng)度pmol pmolAcPhe-tRNA 676 18 38AcAla-tRNAAla/AAAe626 13 52AcAla-tRNAAla/AAAi614 14 44在無(wú)放射性的Ala存在時(shí)使用Ac[14C]氨酰基-tRNA，從而確定起始的新生鏈的數(shù)量。[14C]Ala用來(lái)測(cè)量摻入poly(Ala)的Ala的pmol數(shù)。新生的poly(Ala)的平均長(zhǎng)度，如方法所述，通過(guò)pmol Ala/pmol新生(肽)鏈而給出。
這兩種氨?；腁la tRNA的α-氨基基團(tuán)上的CPM殘基的熒光特性，反映了tRNA在溶液中游離時(shí)或者結(jié)合于核糖體上時(shí)熒光基團(tuán)周?chē)沫h(huán)境。CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)結(jié)合于70S核糖體時(shí)其許多特性與CPM-Phe-tRNA及合成的CPM-SerRNASer(AAA)相同，這些特性在上面討論過(guò)并且以前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)過(guò)(W.D.Picking et al.(1991))。然而，對(duì)于CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)，熒光各向異性數(shù)據(jù)表明，當(dāng)CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)和CPM-Ala-tR-NAAlae(AAA)在溶液中呈游離態(tài)時(shí)，前者上的熒光基團(tuán)比后者上的結(jié)合更為牢固。相反地，一旦起始物tRNA的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物結(jié)合于70S核糖體，其上的熒光團(tuán)看出去，比在延伸物tRNA上的同種探針更容易自由地移動(dòng)，另外，盡管每種熒光tRNA都結(jié)合于核糖體“P位點(diǎn)”，但隨后它們對(duì)紅霉素的結(jié)合的反應(yīng)是不同的。綜合這些結(jié)果從功能上來(lái)判斷，當(dāng)兩個(gè)tRNA在“P位點(diǎn)”時(shí)，CPM探針和可能與之相連接的Ala并不是在相同的位置。這種與紅霉素結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)的結(jié)合上的差別，并沒(méi)有阻止抗菌素對(duì)poly(Ala)合成的抑制，無(wú)論這種合成是通過(guò)預(yù)結(jié)合N-封閉的延伸物Ala-tRNA起始，還是通過(guò)預(yù)結(jié)合起始物Ala-tRNA或Phe-tRNA而起始。
這些功能上的差異也許反映了起始物和延伸物tRNA兩者在結(jié)構(gòu)上的差異。在原核的起始物tRNA上有許多強(qiáng)烈保護(hù)的區(qū)域，與延伸物tRNA形成對(duì)比。(B.L.Seong et al.(1987);H.Wakon et al.(1989);and C.O.Gualerzi et al.，(1990)Biochem.295881-5889)這些特征包括在殘基1和72之間缺少一個(gè)Wat-son-Crick堿基對(duì)，在二氫尿嘧啶莖(D莖)上存在嘌呤11-嘧啶24堿基對(duì)，以及在反密碼莖上三個(gè)連續(xù)的G-C堿基對(duì)。(B.L.Seong et al(1987))，后一特征可用來(lái)區(qū)分起始物tRNA和延伸物tR-NA，并且是特異結(jié)合于核糖體P位點(diǎn)所必需的。(B.L.Seong et al.(1987))。已經(jīng)表明，在反密碼子莖這一部分的定點(diǎn)突變將導(dǎo)致tRNAfMet的起始物功能的逐漸消失。這三個(gè)連續(xù)的G-C堿基對(duì)的出現(xiàn)暗示著，它給予起始物tRNA的反密碼子特殊的結(jié)構(gòu)特性和電磁特性。(K.A.Sharp et al(1990)Biochem.29340-346)新的新生多肽延伸的熒光測(cè)量首先，CPM-Phe-tRNA或CPM-Ser-tRNA被用來(lái)起始依賴(lài)于poly(U)的poly(Phe)、poly(Cys)和poly(Ser)的合成。酵母Phe-tRNA的α-基團(tuán)的CPM標(biāo)記在O.Odom等(1990)中有描述。類(lèi)似地，Ser-tRNASer(AAA)在絲氨?；糠值摩?基團(tuán)被標(biāo)記。熒光tRNA結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，按照純化CPM-Phe-tRNA相類(lèi)似的方式，在C1層析柱上用反相的HPLC純化。
穩(wěn)定態(tài)的熒光測(cè)量在來(lái)自SLM-Aminco Iustruments，Inc.(Urbana，IL)的8000-型光子計(jì)數(shù)光譜熒光儀(photon-counting spectrofluormeter)上，按照在W.Rbychlik等所描述的進(jìn)行。((1983)Biochemistry 22∶85-93)。光譜數(shù)據(jù)按1nm間隔而測(cè)定，采用的掃描率(scanning rate)為0.5秒/每個(gè)波長(zhǎng)增量。因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)與光倍加器的靈敏度之間存在依賴(lài)關(guān)系，所以所有測(cè)量都被自動(dòng)地校正。熒光測(cè)量，是在激發(fā)波長(zhǎng)的吸收小于0.1，0.5ml體積和20℃(目的在于有意減慢延伸的速度)條件下進(jìn)行的。穩(wěn)定態(tài)熒光各向異性的測(cè)量，按照O.Odom所描述的進(jìn)行。((1984)Bro chem-istry 2350695076)。
隨著新生肽的形成，也同時(shí)測(cè)定氨基酸上CPM探針的熒光各向異性。CPM-Phe-tRNA結(jié)合于核糖體的肽酰轉(zhuǎn)移酶中心時(shí)，結(jié)果導(dǎo)致熒光各向異性從0.18增加到0.36。這高的熒光各向異性反映了，CPM-Phe-tRNA的氨基酸在肽酰轉(zhuǎn)移酶中心結(jié)合的牢固程度。(W.D.Picking et al.(1990))。最初的poly(Phe)的少量肽鍵的合成，導(dǎo)致了各向異性的下降，但接著當(dāng)新生肽延伸時(shí)，各向異性又增加了。相反，依賴(lài)于poly(A)的poly(Lys)合成，當(dāng)氨基未端探針從肽?；D(zhuǎn)移酶中心延伸出來(lái)時(shí)，其各向異性將會(huì)快速的下降，并且沒(méi)有隨后的增加。
一旦用CPM-Phe-tRNA起始poly(Cys)或poly(Ser)的合成后，各向異性大幅度下降，其方式與前述的poly(Lys)的方式有些相似(圖3)。然而，與poly(Lys)合成不同的是，這些新生肽的各向異性在短時(shí)間內(nèi)持續(xù)后穩(wěn)定之后再次下降(圖3A)。如果兩種新生肽在只有幾個(gè)氨基酸時(shí)，其氨基酸未端脫離核糖體的肽酰tRNA中心，那么上述結(jié)果是可以預(yù)期的。新生的Ser肽比新生的Cys肽長(zhǎng)(表1)，這也許是前者的最終各向異性較低的原因。這些結(jié)果及以前的結(jié)果暗示，poly(Lys)和poly(Ser)的新生多肽與poly(A)引導(dǎo)的新生的poly(Lys)非常相似，都是直接延伸進(jìn)入周?chē)娜芤褐械摹?br> 為了進(jìn)一步的證實(shí)上述的結(jié)果并不是由CPM-Phe-tRNA起始翻譯造成的，用CPM-Ser-tRNA起始包括poly(Phe)在內(nèi)的每種新生多肽種類(lèi)。當(dāng)肽延伸時(shí)發(fā)生的熒光的變化，按上面所述的進(jìn)行監(jiān)測(cè)。和以前看到的一樣，各向異性在poly(Phe)的最初的肽鍵形成時(shí)減少，然后，當(dāng)肽延伸時(shí)，又增大了。(圖3;W.D.Picking et al(1990))。當(dāng)poly(Cys)肽和poly(Ser)肽的最初的肽鍵形成時(shí)，CPM-Ser探針的各向異性同樣大大地減少;但是，與poly(Phe)的結(jié)果相反，當(dāng)多肽延伸時(shí)，各向異性沒(méi)有增加。有趣的是，在幾個(gè)氨基酸(估計(jì)為3或4個(gè))加到氨基未端CPM-Ser之后，在一段短時(shí)期內(nèi)各向異性的下降停止了。(圖3B)。這個(gè)結(jié)果，與當(dāng)肽由CPM-Phe起始時(shí)得到的結(jié)果很相近。這個(gè)結(jié)果原因尚不清楚。這也許反映了短的新生肽的構(gòu)象，或者當(dāng)肽開(kāi)始延伸時(shí)，探針?biāo)龅降暮颂求w的一種特殊的結(jié)構(gòu)特征。
為了估計(jì)新的poly(Ala)鏈的平均長(zhǎng)度(表2)，有必要確定上述依賴(lài)于poly(U)的多肽分析中，有活性的核糖體的數(shù)目。為此，在加入其它蛋白質(zhì)合成必需組分前，通過(guò)在37℃保溫15分鐘，將55pmol的Ac[14C]Phe-tRNA(100Ci/mol)，Ac[14C]Ala-tR-NAAlae(AAA)或Ac[14C]Ala-tRNAAlai(AAA)(50Ci/mol)，預(yù)結(jié)合于poly(U)編序的核糖體(50pmol)上，在預(yù)結(jié)合Ac[14C]氨?；?tRNA之后，多肽合成按前面所述的進(jìn)行，除了此時(shí)使用非放射性Ala，以使摻入被TCA沉淀的物質(zhì)的放射性，僅僅來(lái)自于預(yù)結(jié)合的N-封閉的氨基酸。這使得能對(duì)一些進(jìn)行核糖體進(jìn)行測(cè)量，這些核糖體上，來(lái)自于預(yù)結(jié)合的[14C]標(biāo)記的Ac-aa-tRNA(注aa即氨基酸)的氨基酸隨后被摻入到新生的poly(Ala)。當(dāng)摻入到poly(Ala)中的Ala的總pmol數(shù)被測(cè)出時(shí)(前面描述過(guò))，這個(gè)值除以有活性的核糖體數(shù)目(通過(guò)測(cè)量合成的新生肽鏈的數(shù)目而確定)，從而給出新生的poly(Ala)鏈的平均長(zhǎng)度的估算值。
表3CPM-Ala-tRNAAla/AAAe和CPM-Ala-tRNAAla/AAAi的熒光特性。
tRNA種類(lèi)位置各向異性量子產(chǎn)量 Emmax(nm)CPM-Ala-tR- 自由游離 0.185 0.393 479NAAla/AAAe結(jié)合(P位點(diǎn)) 0.346 0.503 473結(jié)合(P位點(diǎn))10.312 0.472 475CPM-Ala-tR- 自由游離 0.205 0.449 478NAAla/AAAi結(jié)合(P位點(diǎn)) 0.310 0.516 475結(jié)合(P位點(diǎn))10.208 0.466 4781在結(jié)合熒光的tRNA種類(lèi)之前，脫?；膖RNAPhe和poly(U)編序的核糖體以1.1∶1的比率預(yù)結(jié)合。
按上面所述，再次使用來(lái)自SLM-Aminco Instruments，Inc.(Urbana，IL)的8000型光子計(jì)數(shù)光譜熒光儀，測(cè)量穩(wěn)定態(tài)熒光。熒光tRNA如上所述結(jié)合于核糖體，除了這些tRNA的濃度被減小為核糖體濃度的10%左右，以保證最大量的tRNA結(jié)合。光譜的測(cè)量，采用1nm發(fā)射間隔，掃描率為0.5秒/每波長(zhǎng)增量，激發(fā)波長(zhǎng)385nm。各向異性和相關(guān)的強(qiáng)度測(cè)量，在發(fā)射波長(zhǎng)475nm下進(jìn)行。因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)與光倍加器靈敏度之間的依賴(lài)關(guān)系，測(cè)量值自動(dòng)被校正。熒光測(cè)量在體積0.6ml，20℃下進(jìn)行。在激發(fā)波長(zhǎng)的單吸收小于0.1時(shí)，得到所有測(cè)量值。熒光各向異性測(cè)量值按以前W.L.Picking et al(1991)中所述的而得到。CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)和CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)的量子產(chǎn)量，通過(guò)與在0.5M H2SO4的硫酸奎寧相比較而得出。(后者在25℃的量子產(chǎn)量為0.508)。(R.A.Ve-lapold et al(1980)“A Fluorescence Standard Reference ManualQuine Sulfate Dihydrate，”National Bureau of Standards special Publication 260-64，U.S.Government Printing office，Washing-ton，D.C)。
有趣的是，這兩種tRNA在測(cè)試條件下，其熒光各向異性和量子產(chǎn)量是不同的。自由游離的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)(0.185)的各向異性，與以前看到的天然的延伸物tRNA CPM-Phe-tRNAPhr(0.181)及人工合成的延伸物tRNA CPM-Ser-tRNASer(AAA)(0.175)，是相類(lèi)似的。一旦結(jié)合于70S核糖體后，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的各向異性和量子產(chǎn)量，和以前研究的tRNA一樣以同樣的方法增加。(W.D.Picking et al.(1991);表3)相反地，與CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)在游離時(shí)(0.185)及結(jié)合于P位點(diǎn)時(shí)(0.346)相比，CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)，游離于溶液時(shí)有較高的各向異性(0.205)，而結(jié)合于P位點(diǎn)時(shí)有較低的各向異性(0.310)(表3)。通過(guò)加入嘌呤霉素，已經(jīng)證實(shí)，每種tRNA都與P位點(diǎn)結(jié)合。這導(dǎo)致，當(dāng)每種CPM-Ala-嘌呤霉素產(chǎn)物形成然后從核糖體釋放時(shí)，結(jié)合的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)(降至0.175)和CPM-Ala-tR-NAAlai(AAA)(降至0.183)的各向異性的大幅度下降。(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。
當(dāng)脫?；膖RNAPhe預(yù)結(jié)合于70S核糖體，以促進(jìn)CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)結(jié)合于A位點(diǎn)時(shí)，并沒(méi)有觀(guān)察到量子產(chǎn)量、各向異性或發(fā)射光譜的變化。這意味著沒(méi)有發(fā)生結(jié)合(表3)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)在預(yù)結(jié)合脫?；痶RNAPhe之后，當(dāng)反應(yīng)組分在Sephacryl S-300上被膠過(guò)濾分開(kāi)時(shí)，CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)與核糖體組分不在一起。(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。相反地，用增大的各向異性(0.312)和量子產(chǎn)量(0.472)(表3)來(lái)判斷，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)看上去結(jié)合于核糖體A位點(diǎn)。通常，少于10%的結(jié)合于A位點(diǎn)的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)與嘌呤霉素起反應(yīng)。(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。
數(shù)據(jù)暗示，人工合成的起始物tRNA保留了天然的tRNAfMet的結(jié)合特性。這些特性與其熒光特征相一致，并使其有別于延伸物Ala-tRNA。
CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)和CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)(25pmol)，也用于檢測(cè)IF-2對(duì)tRNA與30S和70S核糖體結(jié)合的影響。在純化的IF-2(105pmol)存在和不存在情況下，在連續(xù)加入30S亞基(195pmol)和50S亞基(195pmol)之后，測(cè)量熒光各向異性和量子產(chǎn)量。測(cè)量在下列條件進(jìn)行50mM Tris-HCl(pH7.5)，6mM Mg(OAC)2，50mMNH4Cl，1mM GTP，5mM DTT和0.2mg/ml poly(U)，終體積600μl。當(dāng)測(cè)量結(jié)束后，提高M(jìn)g2+的濃度至15mM，以協(xié)助非酶促的tRNA結(jié)合，然后再次測(cè)量各向異性和量子產(chǎn)量。結(jié)果似乎表明用IF-2起始肽并非一定需要甲硫氨酸(Met)或AUG密碼子。事實(shí)上，突變后識(shí)別UUC和GUC密碼子并分別被Phe和Ala所氨?；钠鹗嘉飔RNA，已經(jīng)被表明，當(dāng)mRNA在起始密碼位置含有相應(yīng)密碼子時(shí)，能在體內(nèi)酶促起始有活性的β-半乳糖苷酶。(R.Chottapadhyay et al(1990)Biochem.294263-4268)。在相似的研究中，當(dāng)存在突變后識(shí)別起始琥珀密碼子(UAG)的起始物tRNA時(shí)，從琥珀密碼子，也許包括谷氨酰胺(Gln)密碼子，可以起始有活性的氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶。(U.Varshney et al(1990).Proc.Natl.Acad.Sci.871586-1590)表4IF-2介導(dǎo)的CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)核糖體的結(jié)合tRNA 加入 各向異性 量子產(chǎn)量CPM-Ala-tRNAAla/AAAi無(wú) 0.206 0.449+30S 0.204 0.450+50S 0.238 0.453+9mMMg20.308 0.503+IF-2&30S 0.232 0.440+50S 0.300 0.5169mMMg20.306 0.512CPM-Ala-tRNAAlae/AAA 無(wú) 0.182 0.393+30S 0.187 0.389+50S 0.200 0.393+9mMMg20.340 0.483+IF-2&30S 0.188 0.393
+50S 0.197 0.3979mMMg20.343 0.488在測(cè)量熒光之前，在6mM Mg2+存在下，將IF-2和/或者30S核糖體亞基與熒光tRNA在37℃保溫15分鐘。隨后加入各種試劑之后，反應(yīng)混合物在37℃保溫10分鐘，然后在20℃保溫15分鐘(在用于熒光測(cè)量的小杯中)，然后讀取熒光值。所有的反應(yīng)按Meth-ods中所述的，在總體積600μl中進(jìn)行。在加入核糖體之后，[Mg2+]增加9mM(達(dá)到終濃度15mM)，以利于熒光tRNA的非酶促結(jié)合的進(jìn)行。隨后再次測(cè)量各向異性和量子產(chǎn)量作為對(duì)照。
使用純化的E.coli IF-2使tRNA結(jié)合于30S和70S核糖體(在6mM Mg2+中)，來(lái)測(cè)試tRNAAlai(AAA)在酶促起始肽合成中的功能。增加了的各向異性和量子產(chǎn)量表明，IF-2使CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)結(jié)合于30S亞基更易進(jìn)行。(表4)。然后，當(dāng)50S亞基加入到反應(yīng)混合物時(shí)，根據(jù)熒光各向異性的增加，表明超過(guò)80%的CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)結(jié)合于70S核糖體(在6mM Mg2+中)。(表4)。當(dāng)反應(yīng)混合物中[Mg2+]增加到15mM介導(dǎo)tR-NA的非酶促結(jié)合時(shí)，僅觀(guān)察到結(jié)合有少量的輕微增加。(表4)。用poly(U)，在6mM Mg2+，缺少I(mǎi)F-2時(shí)，CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)并沒(méi)有結(jié)合于30S核糖體亞基，與70S核糖體的結(jié)合也很少。(表4)。只有在增加[Mg2+]至15mM之后，起始物tRNA在缺少I(mǎi)F-2下才結(jié)合于poly(U)編序的核糖體。(表4)這些數(shù)據(jù)表明，在6mM Mg2+中IF-2特異性地介導(dǎo)CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)結(jié)合于30S核糖體亞基，或者結(jié)合于70S核糖體。
相反，在6mM Mg2+時(shí)，無(wú)論IF-2存在與否，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)都不結(jié)合于30S或70S核糖體。(表4)。但是，在各種情況下，一旦[Mg2+]增加至15mM，它就快速地結(jié)合。在高濃度Mg2+時(shí)，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的各向異性和量子產(chǎn)量，都增加到以前在核糖體結(jié)合所觀(guān)察到的數(shù)值。
來(lái)自CPM的香豆素部分的熒光，對(duì)探針周?chē)h(huán)境的疏水性、帶電情況及其他因素非常敏感。和上述討論的CPM-Ser-tRNA一樣，這種環(huán)境的敏感性被用來(lái)在不同條件下比較兩種CPM-Ala-tRNA。CPM-Ala-tRNAlae(AAA)和CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)的熒光發(fā)射光譜在下列情形下測(cè)量游離于溶液中時(shí)，結(jié)合于poly(U)編序的核糖體時(shí)，與紅霉素同時(shí)結(jié)合于核糖體時(shí)，與嘌呤霉素和稀疏霉素一起同時(shí)結(jié)合于核糖體時(shí)(圖4A和4B)。本實(shí)驗(yàn)室研究表明，稀疏霉素結(jié)合于70S核糖體時(shí)，并不阻止嘌呤霉素的結(jié)合，但抑制嘌呤霉素與結(jié)合于P位點(diǎn)的N-?；?Phe-tRNA之間的反應(yīng)。(Odom and Hardestry，manuscript in prearation)。
一旦結(jié)合于核糖體，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的發(fā)射光譜的強(qiáng)度便增加，同時(shí)伴隨著一個(gè)相當(dāng)大的藍(lán)移(6nm)。(圖4，破折線(xiàn)對(duì)實(shí)線(xiàn))。CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)的發(fā)射經(jīng)過(guò)與CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)相似。雖然前者在結(jié)合于核糖體之后，伴隨著較微小的藍(lán)移(3nm)，其熒光強(qiáng)度只有相對(duì)較小的增加。
當(dāng)紅霉素結(jié)合于早已含有CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的核糖體時(shí)，相應(yīng)的熒光強(qiáng)度增加15%，同時(shí)伴隨著發(fā)射最大值的進(jìn)一步藍(lán)移(3nm)(圖4，點(diǎn)線(xiàn))。有趣的是，紅霉素導(dǎo)致的結(jié)果是，CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)的相應(yīng)光譜強(qiáng)度僅增加3%，同時(shí)伴隨著發(fā)射光譜的2nm藍(lán)移。(圖4B，點(diǎn)線(xiàn))。這些觀(guān)察結(jié)果表明，起始物tR-NA的CPM-Ala部分存在于核糖體上與紅霉素結(jié)合位點(diǎn)不同的某個(gè)部位。為了探究這種可能性，在連續(xù)加入稀疏霉素和嘌呤霉素之后，測(cè)量每種tRNA的熒光(在結(jié)合于poly(U)編序的核糖體之后)。單獨(dú)的稀疏霉素對(duì)兩種熒光tRNA的發(fā)射光譜幾乎沒(méi)有影響。(數(shù)據(jù)未列出)。但是，稀疏霉素是嘌呤霉素與結(jié)合于核糖體P位點(diǎn)的?；?tRNA反應(yīng)的抑制物。這使檢測(cè)嘌呤霉素的結(jié)合對(duì)每tRNA熒光的影響作為可能。(圖4A和4B)。嘌呤霉素結(jié)合后，導(dǎo)致結(jié)合的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的熒光強(qiáng)度增加26%，同時(shí)伴隨著發(fā)射最大值的4nm藍(lán)移(圖4，破折/點(diǎn)/點(diǎn)線(xiàn))，沒(méi)有觀(guān)察到各向異性的變化。這個(gè)結(jié)果證實(shí)稀疏霉素對(duì)嘌呤霉素反應(yīng)性的抑制。相反地，結(jié)合嘌呤霉素后，結(jié)合的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的熒光僅增加了6%，同時(shí)也伴隨著4nm的藍(lán)移。(圖4B，破折/點(diǎn)/點(diǎn)線(xiàn))。
使用紅霉素和稀疏霉素/嘌呤霉素得到結(jié)果表明，起始物tR-NA的CPM-Ala部分與延伸物tRNA的CPM-Ala部分在核糖體上處于不同的部位。這些結(jié)果的一個(gè)令人感興趣的特征是，不論哪種CPM-Ala-tRNA起始，poly(Ala)合成都被紅霉素抑制。而且，當(dāng)結(jié)合到核糖P位點(diǎn)時(shí)，每種N-酰基-tRNA都能與嘌呤霉素反應(yīng)(在稀疏霉素不存在時(shí))。這意味著，就稀疏霉素和嘌呤霉素的結(jié)合位點(diǎn)而言，起始物tRNA的CPM-Ala部分和延伸物tRNA的同樣部分，存在于不同的部位，它對(duì)兩種抗菌素的功能并未產(chǎn)生明顯的影響。這種差異的潛在意義，還不清楚，但是很有可能這反映了tR-NA構(gòu)象上，而不是肽?；傅墓δ苌系牟顒e。
綜上所述，人工合成的tRNACys，盡管氨?；潭缺容^低，能有效地用于poly(U)引導(dǎo)的poly(Cys)合成。合成的tRNASer(AAA)是氨酰化反應(yīng)的更好的底物，同時(shí)也能有效地用于poly(U)引導(dǎo)的翻譯體系。poly(U)引導(dǎo)的poly(Cys)和poly(Ser)合成的一個(gè)有趣特征是，都對(duì)預(yù)結(jié)合紅霉素帶來(lái)的抑制很敏感，而不論非酶促的起始，是用Ac Ser-tRNA還是用Ac Phe-tRNA。這與poly(Phe)合成正好相反，無(wú)論poly(Phe)合成由Ac Phe-tRNA還是由Ac Ser-tRNA起始，都不受紅霉素的影響。這些數(shù)據(jù)意味著，紅霉素的敏感性是由于新生肽的作用，而不是mRNA或tRNA的作用。
為了擴(kuò)展這些數(shù)據(jù)，當(dāng)形成poly(Phe)，poly(Cys)或poly(Ser)時(shí)測(cè)定了連接在Phe或Ser的氨基未端上的CPM探針的熒光特性。不管用CPM-Phe還是CPM-Ser起始，poly(Phe)的行為相同，而且似乎在肽?；D(zhuǎn)移酶中心附近積累形成一種不溶性的物質(zhì)。另一方面，無(wú)論用Ac Ser-tRNA還是Ac Phe-tRNA起始，以Cys或Ser延伸出來(lái)的新生肽，似乎是直接從肽酰基轉(zhuǎn)移酶的中心脫離進(jìn)入周?chē)芤旱?。這個(gè)結(jié)果與在poly(Cys)中得到的相似。
比較兩種合成的Ala tRNA，延伸物tRNA(tRNAAlae(AAA)和起始物tRNA(tRNAAlai(AAA))，用體外翻譯及熒光技術(shù)來(lái)判斷，兩者在核糖體的肽合成過(guò)程中行為不同。tRNAAlai(AAA)在依賴(lài)于poly(U)的poly(Ala)肽的延伸中不起作用，而相應(yīng)的tR-NAAlae(AAA)卻能有效地用于此過(guò)程。相反，在15mM Mg2+存在下，兩種Ac Ala-tRNA都能非酶促結(jié)合于poly(U)編序的70S核糖體的P位點(diǎn)。用這種方式，當(dāng)tRNAAlae(AAA)作為延伸物tRNA來(lái)源時(shí)，每一個(gè)都能用于起始poly(Ala)的合成。但是，在6mM Mg2+時(shí)，只有起始物tRNA的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物才能在IF-2和GTP酶促結(jié)合。這些結(jié)果表明，tRNAAlai(AAA)保留了起始物的功能，而只有tRNAAlae(AAA)具有肽延伸功能。
本發(fā)明適合于進(jìn)行所述的工作，并得到所述的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)以及其他所述內(nèi)容。出于示范的目的，這里描述了本發(fā)明的最佳實(shí)施例。但是，合成和使用中的大量細(xì)節(jié)可以改變，而不會(huì)背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)及附錄的權(quán)利要求書(shū)的范圍。因此，應(yīng)當(dāng)知道，不要將本發(fā)明局限于上述的特殊形式，相反，本發(fā)明包括了所有的修飾和不同的構(gòu)建以及落入本發(fā)明實(shí)質(zhì)及附錄的權(quán)利要求范圍的相同的結(jié)果。
序列清單關(guān)于序列識(shí)別編號(hào)No.1的信息(SEQ ID NO1)(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度102堿基對(duì)(bp)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)有(ⅳ)序列描述SEQ ID NO1AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGCGCGTT AGCAAAGCGGTTCTGCAGCG GATTAAAAAT CCGTACTAGT CCGGTTCGACTCCGGAACGC GCCTCCAGGA TC關(guān)于序列識(shí)別編號(hào)No.2的信息(SEQ ID NO2)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度124堿基對(duì)(bp)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)有(ⅳ)序列描述SEQ ID NO2GAGAAGCTTT AATACGACTC ACTATAGGAG AGGTGTCCGAGTGGCTGAAG GAGCACGCCT AAAAAGTGTG TATACGGCAACGTATCGGGG GTTCGAATCC CCCCCTCTCC GCCAGGATCCGAGA關(guān)于序列識(shí)別編號(hào)No.3的信息(SEQ ID NO3)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度104堿基對(duì)(bp)
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)有(ⅳ)序列描述SEQ ID NO3AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGGGCTAT AGCTCAGCTGGGAGAGCGCC TGCTTAAAAC GCAGGAGGTC TGCGGTTCGATCCCGCGTAG CTCCACCAGG ATCC關(guān)于序列識(shí)別編號(hào)No.4的信息(SEQ ID NO4)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度106堿基對(duì)(bp)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)有(ⅳ)序列描述SEQ ID NO4AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGGGGGGT GGAGCAGCCATGGTAGCTCG TCGGGCTAAA AACCCGAAGG TCGTCGGTTCAAATCCGGCC CCCTCTACCA GGATCC
權(quán)利要求
1.一種含合成的tRNA的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列含一個(gè)AAA反密碼子；一個(gè)RNA聚合酶啟動(dòng)子；一個(gè)tRNA基因，所述的tRNA基因含有目的氨基酸的特定tRNA合成酶的識(shí)別位點(diǎn)；且至少兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列包括一個(gè)Hind Ⅲ位點(diǎn)，一個(gè)T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，一個(gè)突變的大腸桿菌基因，一個(gè)Bst NI位點(diǎn)和一個(gè)Bam HI位點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征在于，還包括通過(guò)分別把A21和T24堿基變成C21和C24產(chǎn)生的一個(gè)Pst Ⅰ位點(diǎn)，和通過(guò)把A加到所述的DNA序列中T42和C43之間產(chǎn)生的Spe Ⅰ位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA序列，即tRNACys(AAA)基因，其特征在于，核酸序列為AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGCGCGTT AGCAAAGCGGTTCTGCAGCG GATTAAAAAT CCGTACTAGT CCGGTTCGACTCCGGAACGC GCCTCCAGGA TC
5.一種制備權(quán)利要求4所述的tRNACys(AAA)基因的方法，其特征在于，包括制備5′-3′和3′-5′Hind Ⅲ/Pst Ⅰ寡核苷酸及5′-3′和3′-5′Pst Ⅰ/Bam HI寡核苷酸;使所述的5′-3′和3′-5′Hind Ⅲ/Pst Ⅰ寡核苷酸，及5′-3′和3′-5′Pst Ⅰ/Bam HI寡核苷酸退火;形成所述退火的寡核苷酸和Hind Ⅲ/Bam HI消化的pUC18質(zhì)粒的連接混合物;保溫所述的連接混合物;用所述的保溫過(guò)的連接混合物來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌;把所述的轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌暴露于α-氨基芐青霉素和X-gal;篩選有插入片段，因而其質(zhì)粒上攜帶有完整tRNACys(AAA)基因的所述的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子;并對(duì)所述的插入片段的雙鏈進(jìn)行測(cè)序。
6.如權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征在于，在所述核酸序列的T環(huán)中還含有一個(gè)Bst BI限制性酶切位點(diǎn)。
7.如權(quán)利要求6所述的DNA序列，即tRNASer(AAA)基因，其特征在于，核酸序列為GAGAAGCTTT AATACGACTC ACTATAGGAG AGGTGTCCGAGTGGCTGAAG GAGCACGCCT AAAAAGTGTG TATACGGCAACGTATCGGGG GTTCGAATCC CCCCCTCTCC GCCAGGATCCGAGA
8.一種制備權(quán)利要求7所述的tRNASer(AAA)基因的方法，其特征在于，包括從大腸桿菌基因組復(fù)制tRNASer(GGA)基因;在所述基因中用AA替換GG，形成AAA反密碼子;補(bǔ)平(blunting)所述的替換后的基因的末端;用Hind Ⅲ和Bam HI消化所述的末端補(bǔ)平的基因;將所述的消化后的基因連接到pUC18質(zhì)粒上;用連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌;篩選有插入片段，因而其質(zhì)粒上攜帶有完整tRNASer(AAA)基因的所述的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子;并對(duì)所述的插入片段的雙鏈進(jìn)行測(cè)序。
9.如權(quán)利要求6所述的DNA序列，即tRNAAlae(AAA)基因，其特征在于，核酸序列為 AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGGGCTAT AGCTCAGCTGGGAGAGCGCC TGCTTAAAAC GCAGGAGGTC TGCGGTTCGATCCCGCGTAG CTCCACCAGG ATCC
10.一種制備如權(quán)利要求9所述的tRNAAlae(AAA)基因的方法，其特征在于，包括從大腸桿菌基因組復(fù)制tRNAAla(GGC)基因;用AAA替換在所述的基因的GGC形成AAA反密碼子;補(bǔ)平替換后的基因的末端;用Hind Ⅲ和Bam HI消化所述的末端補(bǔ)平的基因;將所述的消化后的基因連接到pUC18質(zhì)粒上;用連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌;篩選有插入片段，因而其質(zhì)粒上攜帶有完整tRNAAlae(AAA)基因的所述的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子;并對(duì)所述的插入片段的雙鏈進(jìn)行測(cè)序。
11.如權(quán)利要求6所述的DNA序列，即tRNAAlai(AAA)基因，其特征在于，核酸序列為AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGGGGGGT GGAGCAGCCATGGTAGCTCG TCGGGCTAAA AACCCGAAGG TCGTCGGTTCAAATCCGGCC CCCTCTACCA GGATCC
12.一種制備如權(quán)利要求11所述的tRNAAlai(AAA)基因的方法，其特征在于，包括從大腸桿菌基因組復(fù)制tRNAfMet(CAT)基因;用A替換所述基因反密碼子中的C和T堿基，形成AAA反密碼子;在所述的替換后的基因中，用G替換堿基1C和3C，用T替換堿基70G和72A;在所述的替換后的基因的堿基17C和17aT之間插入一個(gè)A;補(bǔ)平所述的替換后的基因的末端;用Hind Ⅲ和Bam HI消化所述的末端補(bǔ)平的基因;將所述的消化后的基因連接到pUC18質(zhì)粒上;用所述的連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌;篩選有插入片段，因而其質(zhì)粒上攜帶有完整tRNAAlai(AAA)基因的所述的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子;對(duì)所述的插入片段的雙鏈進(jìn)行測(cè)序。
全文摘要
從tRNA
文檔編號(hào)C12N15/09GK1086261SQ92110198
公開(kāi)日1994年5月4日 申請(qǐng)日期1992年8月29日 優(yōu)先權(quán)日1991年8月30日
發(fā)明者博伊德·哈德斯蒂, 溫迪L·皮克林 申請(qǐng)人:發(fā)展研究基金會(huì)