基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的引物組、試劑盒和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的引物組、試劑盒和方法，引物組包括外側(cè)引物對(duì)F3和B3、內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP，其序列分別為SEQ ID NO:1～4；試劑盒包含如下組分：1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A；2）陽(yáng)性對(duì)照樣品；3）空白對(duì)照樣品；4）顯色劑；方法包括下列步驟：1）待檢樣品RNA提??；2）啤酒花矮化類(lèi)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；3）顯色檢測(cè)。本發(fā)明提供的快速檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的分子生物學(xué)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有簡(jiǎn)便易行、檢測(cè)高效性、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的引物組、試劑盒和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的引物組、試劑盒和方法，屬于生物檢測(cè)試劑【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]類(lèi)病毒是迄今已知的引起植物病害的最小致病因子，為環(huán)狀RNA分子，其全長(zhǎng)基因組由246?399個(gè)核苷酸組成，能引起許多經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)生嚴(yán)重病害。根據(jù)其序列和結(jié)構(gòu)的同源性、復(fù)制特性分為2個(gè)組，分別為馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒組(PSTVd)和鱷梨日斑類(lèi)病毒組(ASBVd)。啤酒花矮化類(lèi)病毒(Hop stunt vroid)屬于馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒科啤酒花矮化類(lèi)病毒屬，通常含307個(gè)左右核苷酸。1970年，日本的Yamamoto等人首次在矮化的啤酒花上發(fā)現(xiàn)了啤酒花矮化類(lèi)病毒。1985年，日本的Sano首次在葡萄上發(fā)現(xiàn)了 HSVd，經(jīng)過(guò)15年的研究，認(rèn)為HSVd的初侵染源為葡萄，在進(jìn)化過(guò)程中逐漸適應(yīng)了新的寄主。目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的HSVd寄主包括黃瓜、葡萄、桃、李、扁桃、杏等草本及木本植物。中國(guó)已經(jīng)在啤酒花、桃、李、杏、葡萄、扁桃等植物上報(bào)道了 HSVd。因此，建立啤酒花矮化類(lèi)病毒的新型檢測(cè)鑒定方法，對(duì)于提高啤酒花矮化類(lèi)病毒的檢疫檢驗(yàn)效率、防止啤酒花矮化類(lèi)病毒的傳入、傳出，保護(hù)我國(guó)農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)，促進(jìn)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的順利出口，具有十分重要的意義。植物類(lèi)病毒由于不顯性侵染比較普遍，癥狀表現(xiàn)受環(huán)境溫度的影響較大，而且?guī)追N鑒別植物對(duì)不同類(lèi)病毒的反應(yīng)癥狀相似，故難于應(yīng)用生物測(cè)定的方法。由于類(lèi)病毒不能產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)，所以也不能使用檢測(cè)病毒的電鏡、血清學(xué)方法。因此，選用分子生物學(xué)方法對(duì)啤酒花矮化類(lèi)病毒進(jìn)行檢測(cè)。
[0003]在現(xiàn)有的核酸檢測(cè)方法中，常用的有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR)，該方法靈敏、特異，但需要高品質(zhì)熱循環(huán)儀，而且因?yàn)闇囟妊h(huán)導(dǎo)致較長(zhǎng)。其他新開(kāi)發(fā)的核酸擴(kuò)增方法，比如 NASBA (nucleic acid sequence-based amplificat1n)、3SR (self-sustained sequence replicat1n) > SDA (strand displacementamplificat1n)等,在擴(kuò)增循環(huán),都有各自的創(chuàng)新點(diǎn)。NASBA和3SR使用一系列轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄過(guò)程來(lái)循環(huán)以避免高溫變性作用，SDA則使用限制性?xún)?nèi)切酶和修飾過(guò)的模板來(lái)循環(huán)擴(kuò)增。雖然它們的敏感性都很高，可以檢測(cè)并擴(kuò)增小于10個(gè)拷貝的核酸樣本，但是它們還有各自需要克服的缺點(diǎn)。技術(shù)要求、材料要求、技術(shù)本身特異性缺陷等方面嚴(yán)重束縛了這些技術(shù)的推廣應(yīng)用。因此，有必要提供一種更便捷，檢測(cè)靈敏度更高的檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題的是提供一種用于檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物組、試劑盒和檢測(cè)方法，即利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的引物和試劑盒，本發(fā)明可以克服其他檢測(cè)方法在病毒檢測(cè)的局限性，為啤酒花矮化類(lèi)病毒的檢測(cè)提供有效工具，能夠快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且低成本的檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
本發(fā)明提供的啤酒花矮化類(lèi)病毒RT-LAMP檢測(cè)引物組，包括外側(cè)引物對(duì)F3和B3、內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP,它們的堿基序列分別為SEQ ID NO:1?4。
[0006]本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒，包含如下組分:
1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A:
包含 2 X RT-LAMP Mix 12.5 μ L、AMV-Bst 混合液 1.5 μ L、RNase-Free Water 2.8μ L、RT-LAMP檢測(cè)引物組6.2 μ L，F(xiàn)IP和BIP各2.5 μ L、終濃度均為I μ M ;F3和B3引物各0.6 μ L，終濃度均為0.25 μ Μ;引物F3、B3、FIP和BIP分別具有序列表SEQ ID N0:1?4的堿基序列；
2)B反應(yīng)液陽(yáng)性對(duì)照樣品:含啤酒花矮化類(lèi)病毒RNA模板，作為陽(yáng)性模板。
[0007]3) C反應(yīng)液空白對(duì)照樣品:為去離子水。
[0008]4)顯色劑:為10%的熒光染料SYBR GREEN I。
[0009]本發(fā)明還提供一種使用以上試劑盒，檢測(cè)樣品中啤酒花矮化類(lèi)病毒的方法，依次包括下列步驟:
I)待檢樣品RNA提取
采取Trizol法或RNA提取試劑盒抽提RNA模板。
[0010]2)啤酒花矮化類(lèi)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
A:在反應(yīng)管中依次加入待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A 23 yL，充分混勻。
[0011]B:在63 1:恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)60 min。
[0012]C:80 °C終止反應(yīng)，5 min取出待檢。
[0013]擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)設(shè)立2個(gè)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照(B反應(yīng)液代替RNA模板)、空白對(duì)照(C反應(yīng)液代替RNA模板)
3)顯色檢測(cè)
在每個(gè)反應(yīng)管中加入I μ L顯色劑D，直接用肉眼觀察顏色變化，在陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照都成立的情況下(即B液出現(xiàn)擴(kuò)增，加入顯色劑后，擴(kuò)增反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色；C液無(wú)擴(kuò)增，加入顯色劑后，擴(kuò)增反應(yīng)液顏色為橙色)，如果樣品的反應(yīng)管中擴(kuò)增反應(yīng)液顏色變?yōu)槌壬?，說(shuō)明待檢樣品不含啤酒花矮化類(lèi)病毒，如果顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明待檢樣品含有啤酒花矮化類(lèi)病毒。
[0014]上述啤酒花矮化類(lèi)病毒RT-LAMP檢測(cè)方法在番茄、辣椒上的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明提供的快速檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的分子生物學(xué)方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益結(jié)果是:
1、簡(jiǎn)便易行:該檢測(cè)方法通過(guò)恒溫水浴鍋或有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)物顏色變化即可判定結(jié)果，省去了昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過(guò)程。
[0016]2、檢測(cè)高效性:該檢測(cè)方法所用檢測(cè)時(shí)間不足I小時(shí)，而PCR擴(kuò)增時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要2小時(shí)以上，這樣能大大提高了檢測(cè)的效率。
[0017]3、靈敏度高:以啤酒花矮化類(lèi)病毒RNA為模板，該方法的檢測(cè)下限為10 f g/μ L，是常規(guī)PCR的100倍。
[0018]4、準(zhǔn)確性高:該方法幾乎不受反應(yīng)混合液中存在的大量外源本底R(shí)NA和雜質(zhì)的影響，不需要從樣本中純化RNA，可直接利用發(fā)病組織或病殘?bào)w提取RNA快速檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。
[0019]5、特異性強(qiáng):該方法通過(guò)2對(duì)引物特異性識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，相對(duì)于PCR引物識(shí)別靶序列的2個(gè)獨(dú)立區(qū)域而言，特異性大幅提高，假陽(yáng)性出現(xiàn)的概率也隨之降低。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1是RT-LAMP特異性實(shí)驗(yàn)圖。I:啤酒花矮化類(lèi)病毒；2:陰性對(duì)照；3:蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒；4:梨泡狀潰瘍類(lèi)病毒；5:桃潛隱花葉病毒；6:蘋(píng)果莖痘病毒；7:葡萄黃斑類(lèi)病毒_2。
[0021]圖2 是RT-LAMP 靈敏性實(shí)驗(yàn)圖。其中 1-8:1X 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T5、I X 10' I X 10' 1.56 X I(T8 ng/ μ LHSVd 感病材料總 RNA。
[0022]圖3 是 RT-PCR 靈敏性實(shí)驗(yàn)圖。其中 1-8:1 X 10—1、I X 10_2、I X 10_3、I X 10_4、I X 10_5、I X 10' I X 10' 1.56 X I(T8 ng/ μ L HSVd 感病材料總 RNA。

【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，并根據(jù)啤酒花矮化類(lèi)病毒全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的RT-LAMP檢測(cè)引物組，包括外側(cè)引物對(duì)F3和B3、內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP，由此發(fā)明了用于檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法及試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒，僅需通過(guò)對(duì)葡萄、啤酒花等疑似感染植株樣品進(jìn)行RNA提取并進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，即可快速檢測(cè)出是否感染啤酒花矮化類(lèi)病毒，方便基層快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地進(jìn)行病害診治，進(jìn)而采取適當(dāng)?shù)姆乐未胧?，減少病害帶來(lái)的損失。
[0024]實(shí)施例1特異性實(shí)驗(yàn)
(I)引物設(shè)計(jì)
LAMP方法，只有當(dāng)2對(duì)引物與目的片段的六個(gè)區(qū)域都匹配上時(shí)才能進(jìn)行擴(kuò)增。本發(fā)明根據(jù)NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中KJ754184.1 (山東分離物)、腿357802.I (遼寧分離物)，在保證擴(kuò)增的兼并性和通用性的前提下通過(guò)比較分析基因高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)LAMP外側(cè)引物對(duì)F3和B3、內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP，設(shè)計(jì)完成后將引物在數(shù)據(jù)庫(kù)的Primer-Blast模塊下進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，最后選取以下RT-LAMP檢測(cè)引物組:
外側(cè)引物對(duì)F3和B3
上游引物 F3:TGGAGTAGAGGCTCTGCC (見(jiàn)序列表 SEQ ID N0:1),
下游引物 B3:TCTTTGCATGCCTTTTGCG (見(jiàn)序列表 SEQ ID NO: 2)。
[0025]內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIB和BIP，
上游引物 FIP:GTCGCGTCTCCAAGAAGAGCC-CGAAACACCATCGATCGTCC (見(jiàn)序列表 SEQ IDN0:3),
下游引物 BIP: CTGCTCGGTTCGCTCCAACC-AGGGGCTCAAGAGAGGATC (見(jiàn)序列表 SEQ IDN0:4)。
[0026](2)病毒RNA的提取取0.1 g啤酒花矮化類(lèi)病毒、蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒、梨泡狀潰瘍類(lèi)病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋(píng)果莖痘病毒、葡萄黃斑類(lèi)病毒-2樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mL Trizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心lOmin。取上清，15°C~30°C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C~30°C,放置2min~3min ;2°C~8°C，12000 g，離心15min。小心吸取約為600 PL的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C~8°C,12000 g,離心lOmin。去除上清液,沉淀中加入I mL 75%乙醇,洗漆；2°C ~8°C, 7500 g,離心5min。去除上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 μ L -50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0027](3)六種類(lèi)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
Α:分別在反應(yīng)管中依次加入六種類(lèi)病毒的待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A 23 μ L，充分混勻。
[0028]B:在63 1:恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)60 min。
[0029]C:80 °C終止反應(yīng)，5 min取出待檢。
[0030](3)顯色檢測(cè)
加入顯色劑D進(jìn)行顯色反應(yīng)，管3~管7，即蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒、梨泡狀潰瘍類(lèi)病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋(píng)果莖痘病毒、葡萄黃斑類(lèi)病毒-2的RNA模板均無(wú)擴(kuò)增，反應(yīng)液顏色沒(méi)有變化依然為橙色。陽(yáng)性對(duì)照管管I (以反應(yīng)液B為模板RNA)反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，空白對(duì)照管管2 (以反應(yīng)液C為模板RNA)反應(yīng)液顏色為橙色。凝膠見(jiàn)圖1。
[0031]該組引物經(jīng)在線BLAST的結(jié)果證實(shí)，具有很高的特異性，不會(huì)與其他病毒交叉反應(yīng)。啤酒花矮化類(lèi)病毒屬于馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒科，因此研究選擇了同科近似種病毒梨泡狀潰瘍類(lèi)病毒及其他四種葡萄、李、桃上常見(jiàn)的類(lèi)病毒為測(cè)試毒種。經(jīng)驗(yàn)證，除啤酒花矮化類(lèi)病毒RNA出現(xiàn)擴(kuò)增，反應(yīng)管反應(yīng)液變?yōu)榫G色外，其余病毒均無(wú)擴(kuò)增，反應(yīng)管均為橙色，與預(yù)期相符，證明該組引物的良好特異性，與上述毒株均無(wú)交叉反應(yīng)。
[0032]實(shí)施例2敏感性實(shí)驗(yàn)
(I)用DEPC水將HSVd類(lèi)病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀釋?zhuān)来螢?X10'I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T5、I X 10' I X 10' 1.56 X l(T8ng/ μ L,各取 2 μ L 為模板分別進(jìn)行LAMP及RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增引物組包含:
外側(cè)引物對(duì)F3和B3
上游引物 F3:TGGAGTAGAGGCTCTGCC (見(jiàn)序列表 SEQ ID N0:1),
下游引物 B3:TCTTTGCATGCCTTTTGCG (見(jiàn)序列表 SEQ ID N0:2)。
[0033]內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIB和BIP，
上游引物 FIP:GTCGCGTCTCCAAGAAGAGCC-CGAAACACCATCGATCGTCC (見(jiàn)序列表 SEQ IDN0:3),
下游引物 BIP: CTGCTCGGTTCGCTCCAACC-AGGGGCTCAAGAGAGGATC (見(jiàn)序列表 SEQ IDN0:4)。
[0034](2)病毒RNA的提取
取0.1 g不同稀釋濃度的樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mL Trizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心lOmin。取上清，15°C~30°C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C~30°C,放置2min~3min ;2°C~8°C，12000 g，離心15min。小心吸取約為600 PL的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C~8°C,12000 g,離心lOmin。去除上清液,沉淀中加入I mL 75%乙醇,洗漆；2°C ~8°C, 7500 g,離心5min。去除上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 μ L -50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0035](3)不同濃度的啤酒花矮化類(lèi)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
Α:分別在反應(yīng)管中依次加入不同稀釋倍比的待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A 23 μ L，充分混勻。
[0036]B:在63 1:恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)60 min。
[0037]C:80 °C終止反應(yīng)，5 min取出待檢。
[0038](4 ) RT-PCR擴(kuò)增及檢測(cè)
RT-PCR擴(kuò)增體系參照TIANGEN公司的Quant —步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明配置，反應(yīng)條件為 50 °C反轉(zhuǎn)錄 30 min ；94 °C預(yù)變性 2 min; 94 °C 30 s，53 °C 30 s，72 °C 30 s，循環(huán)反應(yīng)35次；65 °C延伸10 min。
[0039]取1.5 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 mL?6mL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。
[0040](5)顯色檢測(cè)
加入顯色劑D進(jìn)行顯色反應(yīng)，管1-管5即I X 10' I X 10' I X 10' I X 10' IX I(T5 ng/μ L的RNA樣品均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，其檢測(cè)限可達(dá)到fg級(jí)；電泳結(jié)果顯示，啤酒花矮化類(lèi)病毒使用RT-PCR方法能夠得到10_3稀釋倍數(shù)，只有pg級(jí)水平。這說(shuō)明本發(fā)明的LAMP方法的檢測(cè)靈敏度高出PCR方法100倍(見(jiàn)圖2和圖3)。
[0041]實(shí)施例3:實(shí)際樣品檢測(cè)及對(duì)比實(shí)驗(yàn)
將從山東、新疆等地田間采集的具有典型HSVd類(lèi)癥狀的病樣及實(shí)驗(yàn)室留樣(進(jìn)境法國(guó)、意大利葡萄苗等)，分別采用LAMP、RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的效果，以進(jìn)一步評(píng)估LAMP方法的可靠性。
[0042]1、實(shí)際樣品LAMP檢測(cè) I)病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2V ~8°C, 12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加 500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；21:~81:，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0043](3)不同來(lái)源樣品的啤酒花矮化類(lèi)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
Α:分別在反應(yīng)管中依次加入不同稀釋倍比的待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A 23 μ L，充分混勻。
[0044]B:在63 1:恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)60 min。
[0045]C:80 °C終止反應(yīng)，5 min取出待檢。
[0046](4 ) RT-PCR擴(kuò)增及檢測(cè)
RT-PCR擴(kuò)增體系參照TIANGEN公司的Quant —步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明配置，反應(yīng)條件為 50 °C反轉(zhuǎn)錄 30 min ；94 °C預(yù)變性 2 min; 94 °C 30 s，53 °C 30 s，72 °C 30 s，循環(huán)反應(yīng)35次；65 °C延伸10 min。
[0047]取1.5 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 mL?6mL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。
[0048](5 ) LAMP產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物檢測(cè)
LAMP產(chǎn)物加入顯色劑D進(jìn)行顯色反應(yīng)，PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:利用上述LAMP和RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)實(shí)際樣品，所有不同地理來(lái)源的啤酒花矮化類(lèi)病毒樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，兩種方法的符合率100%，但LAMP對(duì)設(shè)備要求更低，便捷性更聞。
[0049]本發(fā)明所建立的檢測(cè)方法能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出啤酒花矮化類(lèi)病毒，為科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供了一種簡(jiǎn)便、快速、成本低廉的檢測(cè)技術(shù)，也為該病所引起的不同病害的早期預(yù)警及合理用藥提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)，對(duì)增加生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益都具有現(xiàn)實(shí)而深遠(yuǎn)的意義。
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物組，其特征在于，所述的引物組包括外側(cè)引物對(duì)F3和B3、內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP，其序列分別為SEQ ID NO:1?4。
2.權(quán)利要求1所述的引物組在檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的引物組在制備檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種檢測(cè)啤酒花矮化類(lèi)病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)擴(kuò)增試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含如下組分: 1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A:
2 X RT-LAMP Mix 12.5 μ L、AMV-Bst 混合液 1.5 μ L、RNase-Free Water 2.8 μ L、RT-LAMP檢測(cè)引物組6.2 μ L，F(xiàn)IP和BIP各2.5 μ L、終濃度均為I μ M ;F3和B3引物各0.6 μ L，終濃度均為0.25 μ M ;引物F3、B3、FIP和BIP分別具有序列表SEQ ID NO:1?4的堿基序列； 2)B反應(yīng)液是陽(yáng)性對(duì)照樣品:含啤酒花矮化類(lèi)病毒RNA模板，作為陽(yáng)性模板； 3)C反應(yīng)液是空白對(duì)照樣品:為去尚子水； 4)顯色劑:為10%的熒光染料SYBRGREEN I。
5.一種應(yīng)用權(quán)利要求4所述的試劑盒檢測(cè)樣品中啤酒花矮化類(lèi)病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步驟: 1)待檢樣品RNA提取 采取Trizol法或RNA提取試劑盒抽提RNA模板， 2)啤酒花矮化類(lèi)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 Α:在反應(yīng)管中依次加入待檢模板RNA 2 μ L和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A 23 μ L,充分混勻； B:在63 1:恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)60 min ； C:80 °C終止反應(yīng)，5 min后取出待檢； 擴(kuò)增時(shí)，設(shè)立2個(gè)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照； 3)顯色檢測(cè) 在每個(gè)反應(yīng)管中加入I μ L顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，如果樣品的反應(yīng)管中擴(kuò)增反應(yīng)液顏色變?yōu)槌壬f(shuō)明待檢樣品不含啤酒花矮化類(lèi)病毒，如果顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明待檢樣品含有啤酒花矮化類(lèi)病毒。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104513867SQ201410851964
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】吳興海, 張成標(biāo), 魏曉棠, 甘琴華, 封立平, 歷艷, 王簡(jiǎn), 宋濤 申請(qǐng)人:張成標(biāo)