一種銅綠假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種銅綠假單胞菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌，命名為：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)A1，保藏編號為CCTCC NO：M 2014585。本發(fā)明提供的菌株A1對銅綠微囊藻具有溶解作用，是以通過分泌胞外物質(zhì)來進(jìn)行溶藻，且該物質(zhì)具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，是非蛋白質(zhì)類物質(zhì)。將菌株A1上清液以6:100的體積比接種到藻液中，第5天，處理組藻已經(jīng)徹底黃化且藻細(xì)胞葉綠素a的去除率為80.29％。
CCTCC NO：M2014585
20141123
【專利說明】一種銅綠假單胞菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株由富營養(yǎng)化水體中篩得的具有溶藻作用的菌種，該菌株對造成水 體富營養(yǎng)化的主要藻類--銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa)具有溶解作用。
[0002] 本發(fā)明所稱的銅綠假單胞菌，命名為：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) A1，已于2014年11月23日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號為CCTCC NO :M 2014585。

【背景技術(shù)】
[0003] 隨著工業(yè)進(jìn)程的加快和經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，全球水體富營養(yǎng)化程度加劇，已成為世 界各國所面臨的重大環(huán)境問題。以中國為例，2009年中國環(huán)境質(zhì)量狀況公報指出：全國地 表水污染依然較重，其中湖泊（水庫）富營養(yǎng)化問題突出。26個國控重點湖泊（水庫）中， 滿足II類水質(zhì)的1個，占3. 9% ;111類的5個，占19. 2% ;IV類的6個，占23. 1% ;V類的 5個，占19. 2%;劣V類的9個，占34. 6%。主要污染指標(biāo)為總氮和總磷。營養(yǎng)狀態(tài)為重度 富營養(yǎng)的1個，占3. 8% ;中度富營養(yǎng)的2個，占7. 7% ;輕度富營養(yǎng)的8個，占30. 8% ;其 他均為中營養(yǎng)，占57. 7%。目前水體富營養(yǎng)化所導(dǎo)致的藍(lán)藻水華污染問題已成為全球關(guān)注 的焦點，藍(lán)藻水華(water bloom)是淡水水體富營養(yǎng)化的主要表征，目前確定的有毒藻種包 括銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa)、水華魚腥藻（Aabaenaflos aguae)、水華束絲藻 (Aphanizomenon flosaquae)、阿氏亶頁藻（Oscillatoria agardhil)、亶頁藻（Oscillatoria rubescens)、泡沫節(jié)球藻（Nodular spumigena)等，其中，銅綠微囊藻是主要水華藻種。有 害藻類水華有規(guī)律地爆發(fā)在富營養(yǎng)化水體中，并在我國及世界范圍的爆發(fā)頻率有逐年增加 的趨勢，探索行之有效的抑制藻類水華暴發(fā)的途徑極為迫切。
[0004] 由于傳統(tǒng)治理水體富營養(yǎng)化的方法存在這樣那樣的缺點，因此人們尋找了一種更 好的方法-生物法，該法從控制藻類繁殖和調(diào)整藻類群落結(jié)構(gòu)方面著手，使整個水生生態(tài) 系統(tǒng)趨于平衡并向良好方向發(fā)展，所以生物方法應(yīng)作為解決藻類水華污染的主要方向開展 研宄。溶藻微生物，特別是溶藻細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，為生物控藻提供了一條新思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決以上問題，本發(fā)明提供一種對銅綠微囊藻具有溶解作用的銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)Al〇
[0006] 本發(fā)明所稱的銅綠假單胞菌，命名為：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) A1，已于2014年11月23日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號為CCTCC NO :M 2014585。 以下簡稱菌株Al。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是利用菌株Al的有效成分來溶解銅綠微囊藻。
[0008] 本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)Al的篩選方法如下：
[0009] 從沈陽某富營養(yǎng)化水體中采集水樣，用移液管吸取ImL液體置于9mL無菌水中，作 為KT 1稀釋液。再將該溶液依次稀釋為1〇_2、1〇_3、1〇_4、1〇_ 5溶液，劃線挑取菌落形態(tài)不同的 菌種進(jìn)行純化培養(yǎng)，最終獲得單一菌種并分別編號為Al?Dl。
[0010] 將各種細(xì)菌分別置于200mL液體培養(yǎng)基中，以160r/min，30°C搖床培養(yǎng)24h，將所 有相同濃度的菌液，等體積接種到試驗藻中，并設(shè)空白對照，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過 測定葉綠素 a(Chla)的含量及每天觀察了解銅綠微囊藻的生長情況，選出溶藻效果最好的 細(xì)菌。最終5種菌株能使藻液呈現(xiàn)不同程度的黃化，其中Al菌使銅綠微囊藻黃化的速度更 快，效果更好。
[0011] 菌株Al的鑒定結(jié)果如下：
[0012] A.菌株Al的形態(tài)與特征：
[0013] 菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，乳白色半透明。呈桿狀，為革蘭氏陰性 菌，無芽孢。
[0014] B.菌株Al的生理生化特性
[0015] 菌株Al為好氧菌，不能進(jìn)行硝酸鹽還原反應(yīng)；能夠氧化乙酸和液化明膠，但不能 水解淀粉；檸檬酸鹽，油脂，V-P試驗呈陽性，吲哚試驗呈陰性。
[0016] C.菌株Al的16SrDNA的測序及進(jìn)化樹的制作
[0017] 菌株Al基因組總DNA提?。喊闯Ｒ?guī)方法，經(jīng)菌株培養(yǎng)，菌體收集，菌體裂解，DNA提 取，沉淀，洗滌，抽（晾）干7個步驟，最終得到基因組總DNA，取IOyL用1%瓊脂糖凝膠電 泳檢測。
[0018] 菌株Al基因組DNA的PCR擴(kuò)增：以總DNA為模板，50 μ L反應(yīng)體系見表1。
[0019] 表 1
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 一種銅綠假單胞菌，其特征在于：命名為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) A1，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO :M 2014585。
2. 權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌在溶解銅綠微囊藻中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于方法如下： 1) 菌株的培養(yǎng)：將保藏編號為CCTCC NO :M 2014585的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) A1于培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 2) 將培養(yǎng)后的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)Al菌液，經(jīng)8000r/min，4°C離 心，取上清液； 3) 按接種量為6%，將上清液加入銅綠微囊藻液中。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的培養(yǎng)基是：牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaCl 5g，pH 值 7. 0 ?7. 2,蒸餾水 lOOOmL。
【文檔編號】C12N1/20GK104498387SQ201410691653
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】付保榮, 苗斌, 楊玉東, 魯男, 張潤潔, 何哲, 左世文, 王淑妍 申請人:遼寧大學(xué)