用于檢測(cè)大腸桿菌o157:h7的顯色培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種用于檢測(cè)大腸桿菌O157：H7與其他腸道菌群的顯色培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含有瓊脂、蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉，還含有山梨醇、肌醇、性紅、β-半乳糖苷酶顯色底物、4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，牛膽鹽、亞碲酸鉀、頭孢克肟。本發(fā)明公布的顯色培養(yǎng)基能快速簡(jiǎn)便地從大腸菌群中鑒別出大腸桿菌O157：H7。
【專利說明】用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物檢測(cè)的培養(yǎng)基，尤其涉及一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157:H7 的顯色培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002] 出血性大腸桿菌（enterohemorrhage E. Coli，EHEC)是大腸桿菌的一個(gè)亞型,EHEC 分為157、26、111血清型，主要致病菌株為0157:H7,可引起感染性腹瀉，因能引起人類的出 血性腸炎而得名。
[0003] EHEC 0157:H7除不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇外，其他常見的生化特征與大腸埃希氏 菌基本相似，但也有某些生化反應(yīng)不完全一致，具有鑒別意義。EHEC0157:H7雖然有UidA 基因，但其編碼的β -葡萄糖醛酸酶無活性，不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷 (MUG)產(chǎn)生熒光，S卩MUG陰性。
[0004] EHEC 0157:Η7的顯色培養(yǎng)基利用原理為大腸桿菌0157:Η7不發(fā)酵或2天內(nèi)不發(fā) 酵山梨醇以及表達(dá)β-半乳糖苷酶，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加山梨醇和β-半乳糖苷酶的顯色 底物；在這種顯色培養(yǎng)基中，大腸桿菌菌落顯示發(fā)酵山梨醇的色澤，而EHEC 0157:Η7呈現(xiàn) β-半乳糖苷酶顯色底物中顯色基團(tuán)的顏色。
[0005] 研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中存在不發(fā)酵山梨醇，β -葡萄糖醛酸酶陽性，但 EHEC0157:H7血清也不凝集的菌株，給EHEC 0157:Η7的顯色培養(yǎng)造成假陽性。目前，還沒有 將用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :Η7的顯色培養(yǎng)基。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :Η7的顯色培養(yǎng)基。
[0007] 本發(fā)明的所采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :Η7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂 15-20g、蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化鈉5-10g，還含有山梨醇10-20g、肌醇4-7g、 性紅0. 005-0. 03g、β -半乳糖苷酶顯色底物0. 05-3g、4-甲基扇型酮-β -D-葡萄糖苷酸 0. 1-0. 2g、異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. 05-0. 2g，牛膽鹽l-5g、亞締酸鉀l-5mg、頭孢 克月虧 0· Ol-O. 06mg。
[0009] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖。
[0010] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖在IOOOmL培 養(yǎng)基中的含量為〇. lg。
[0011] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物為鄰硝基苯_β -D-半乳糖苷。
[0012] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物鄰硝基苯_β-D-半乳糖苷在IOOOmL培養(yǎng)基中 的含量為2g。
[0013] 優(yōu)選的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為 0. 05-0. 2g。
[0014] 優(yōu)選的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為0. 15g。
[0015] 優(yōu)選的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為0. lg。
[0016] 優(yōu)選的，用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊 脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、性紅0. Olg、鄰硝基 苯-β -D-半乳糖苷2g、4-甲基扇型酮-β -D-葡萄糖苷酸0. lg、異丙基-β -D-硫代批喃半 乳糖苷〇. lg、牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀2mg、頭孢克月虧0. 04mg。
[0017] 優(yōu)選的，用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有 瓊脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、性紅0. Olg、 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖0. lg、4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸0. lg、異丙 基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀2mg、頭孢克廂0. 04mg。
[0018] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了山梨醇和中性紅，除大腸桿菌0157 :H7外的大腸菌群發(fā) 酵山梨醇產(chǎn)酸，在pH指示劑中性紅作用下顯示出紅色色澤，而大腸桿菌0157 :H7不利用山 梨醇而呈現(xiàn)無色菌落。
[0019] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了 β -半乳糖苷酶顯色底物I和β -半乳糖苷酶顯色底物 II，大腸菌群在β -半乳糖苷酶作用下分解底物，游離出顯色劑，使菌落呈現(xiàn)出顯色劑的色 澤。
[0020] 膽鹽可抑制樣品中大部分的革蘭氏陽性球菌，包括牛膽鹽、豬膽鹽、三號(hào)膽鹽、去 氧膽酸鈉和混合膽鹽。本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了膽鹽。
[0021] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了，可抑制樣品中部分的革蘭氏陰性桿菌如大腸菌群以及 容易擴(kuò)散生長(zhǎng)的變型桿菌的抗生素亞碲酸鉀和頭孢克肟。
[0022] 本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基能快速簡(jiǎn)便地從大腸菌群中鑒別出大腸桿菌0157 :Η7。

【具體實(shí)施方式】
[0023] -種用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :Η7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂 15-20g、蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化鈉5-10g，還含有山梨醇10-20g、肌醇4-7g、 性紅0. 005-0. 03g、β -半乳糖苷酶顯色底物0. 05-3g、4-甲基扇型酮-β -D-葡萄糖苷酸 0. 1-0. 2g、異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. 05-0. 2g，牛膽鹽l-5g、亞締酸鉀l-5mg、頭孢 克月虧 0· Ol-O. 06mg。
[0024] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖，在IOOOmL 培養(yǎng)基中的含量為〇. lg。
[0025] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物為鄰硝基苯-β -D-半乳糖苷，在IOOOmL培養(yǎng)基 中的含量為2g。
[0026] 優(yōu)選的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為 0. 05-0. 2g。
[0027] 優(yōu)選的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為0. 15g。
[0028] 優(yōu)選的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為0. lg。
[0029] 本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的方法，包括如下步驟：
[0030] (1)制備顯色平板：每IOOOmL去離子水中加入上述顯色培養(yǎng)基除亞碲酸鉀、頭孢 克肟外的原料，攪拌，加熱煮沸至完全溶解，待冷至約50°C，加入過濾除菌的亞碲酸鉀、頭孢 克肟，混勻，倒平板，備用；
[0031] (2)接種培養(yǎng)：將樣品或含樣品的增菌液接種到顯色平板上，37°C培養(yǎng)22?26h ;
[0032] (3)結(jié)果分析：若顯色平板上出現(xiàn)光滑、略突起、直徑1?3mm、藍(lán)綠色的菌落，且菌 落在366nm下無藍(lán)白色熒光，說明該樣品存在大腸桿菌0157 :H7,其它腸道菌或被抑制或?yàn)?顯示紅色或顯色藍(lán)綠色但在366nm下呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光。
[0033] 本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的方法，包括如下步驟：
[0034] (1)制備顯色平板：每IOOOmL去離子水中加入上述顯色培養(yǎng)基除β -半乳糖苷酶 顯色底物鄰硝基苯-D-半乳糖苷、亞締酸鉀、頭孢克廂外的原料，攪拌，加熱煮沸至完全 溶解，待冷至約50°C，加入過濾除菌的鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷、亞碲酸鉀、頭孢克|虧，混 勾，倒平板，備用；
[0035] (2)接種培養(yǎng)：將樣品或含樣品的增菌液接種到顯色平板上，37°C培養(yǎng)22?26h ;
[0036] (3)結(jié)果分析：若顯色平板上出現(xiàn)光滑、略突起、直徑1?3mm、黃色的菌落，且菌落 在366nm下無藍(lán)白色熒光，說明該樣品存在大腸桿菌0157 :H7,其它腸道菌或被抑制或?yàn)轱@ 示紅色或顯色黃色但在366nm下呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光。
[0037] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限如此。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] -種用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊 脂l〇g、蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，還含有山梨醇15g、肌醇5g、性紅0. lg、 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖0. lg、4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸0. lg、異丙 基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. Ig,牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀2mg、頭孢克月虧0. 04mg。
[0040] 實(shí)施例2
[0041] 一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂10g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，還含有山梨醇15g、肌醇5g、性紅0. lg、鄰硝基 苯-β -D-半乳糖苷2g、4-甲基扇型酮-β -D-葡萄糖苷酸0. lg、異丙基-β -D-硫代批喃半 乳糖苷〇. lg，牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀2mg、頭孢克月虧0. 04mg。
[0042] 實(shí)施例3特異性實(shí)驗(yàn)
[0043] 將 E. coli 0157:H7NCTC12900、E. coli 0157:H7882364、E. coli 0157:H7ATCC43895、E.coli 0157:H7ATCC43888、E.coli ATCC8739、E.coli CMCC(B)44102、 E. coli CMCC(B)44103、P. vulgaris CMCC(B)49027等8種標(biāo)準(zhǔn)菌株分別制成適當(dāng)濃度的標(biāo) 準(zhǔn)菌懸液（濃度為108?109cfu/mL)，分別劃線接種到用實(shí)施例1顯色培養(yǎng)基制成的平板 上，37°C培養(yǎng)18?24h。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0044] 表1大腸桿菌E. coli 0157:H7顯色培養(yǎng)基的特異性顯色試驗(yàn)結(jié)果
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每lOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂15-20g、 蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化鈉5-10g，其特征在于，還含有山梨醇10-20g、肌醇 4_7g、性紅0. 005-0. 03g、0 -半乳糖苷酶顯色底物0. 05-3g、4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄 糖苷酸〇. 1-0. 2g、異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷0. 05-0. 2g，牛膽鹽l-5g、亞碲酸鉀 l-5mg、頭孢克肟 0? 01-0. 06mg。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于， 3 -半乳糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -半乳糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于， 5_溴-4-氯-3-吲哚-P -半乳糖在lOOOmL培養(yǎng)基中的含量為0. lg。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于， 3 -半乳糖苷酶顯色底物為鄰硝基苯-3 -D-半乳糖苷。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于，鄰 硝基苯-D-半乳糖苷在1000mL培養(yǎng)基中的含量為2g。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征 在于，所述4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄糖苷酸在1000mL培養(yǎng)基中的含量為0. 05-0. 2g。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于，所 述4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄糖苷酸在1000mL培養(yǎng)基中的含量為0. 15g。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于，所 述4-甲基扇型酮-0-D-葡萄糖苷酸在1000mL培養(yǎng)基中的含量為0. 10g。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于，每 1000mL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、 性紅0. 01g、鄰硝基苯-0 -D-半乳糖苷2g、4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄糖苷酸0. lg、異丙 基-0 -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽1. 5g、亞締酸鉀2mg、頭孢克月虧0. 04mg。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測(cè)大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于，每 1000mL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、性 紅0? 01g、5-溴-4-氯-3-卩引哚-半乳糖0? lg、4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄糖苷酸0? lg、 異丙基-D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽1. 5g、亞締酸鉀2mg、頭孢克月虧0. 04mg。
【文檔編號(hào)】C12Q1/10GK104388525SQ201410682521
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】金京勛 申請(qǐng)人:蘇州嘉禧蘿生物科技有限公司