金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基及其檢測試紙的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基，其中每1000mL培養(yǎng)基含有如下重量的組分：蛋白胨8-12g、酵母粉5-8g、丙酮酸鈉3-6g、氯化鈉55-90g、亞碲酸鉀30-45g、氯化鋰7-10g、瓊脂10-20g、復(fù)合特異性酶顯色底物0.2-0.5g、二甲基甲酰胺30-75g、抗生素0.04-0.08g、助顯色劑0.05-0.1g，余量為水。本發(fā)明使用高鹽培養(yǎng)基等金葡菌選擇性培養(yǎng)基，添加金葡菌天然耐性抗生素提高選擇性，添加金葡菌代謝酶特異性底物顯色，提高檢查效率，還可制作成檢測試紙條方便實際使用。
【專利說明】金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基及其檢測試紙

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種適用于金黃色葡萄球菌的選擇性顯色培養(yǎng)基，以及采用該選擇性 顯色培養(yǎng)基的檢測試紙。

【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是引起葡萄菌屬食物中毒的主要病 原微生物，也是影響世界各國經(jīng)濟的重要食源性疾病之一。人們攝取的食物和飲料中受到 金黃色葡萄球菌污染時，將會產(chǎn)生一種或以上的腸毒素，引起食物中毒，常見的中毒癥狀是 嘔吐和腹瀉。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在，另外，金黃色葡萄球菌在人 類和溫血動物的皮膚和鼻腔中均能存活。食品加工者和無癥狀攜帶者是食品污染的主要 來源，生產(chǎn)過程中缺乏衛(wèi)生監(jiān)督管理容易有金黃色葡萄球菌及其腸毒素的存在。食品樣品 中超過10 6-108CFU/g(mL)的金黃色葡萄球菌可引起食物中毒，而lg(mL)腸毒素，相當(dāng)于 10 5CFU/g(mL)的金黃色葡萄球菌，即可使敏感人群在l-6h后出現(xiàn)中毒癥狀。許多官方法 規(guī)規(guī)定不同種類的食品允許低濃度的金黃色葡萄球菌存在中，例如雞蛋和熟食制品不需檢 出，生肉及其制品中金黃色葡萄球菌最低限量為l〇 2-l〇3CFU/g (mL)。
[0003] 食品中金黃色葡萄球菌常規(guī)的檢驗方法是在37°C環(huán)境下，金黃色葡萄球菌用選擇 性肉湯濃縮富集24-48h后直接接種于選擇性培養(yǎng)基（如Baird, parker瓊脂）培養(yǎng)，隨后挑 取可疑菌落經(jīng)血漿凝固酶試驗進行生化鑒定。傳統(tǒng)方法需要5-6天時間，其他相似的方法 如最大可能數(shù)法（Most Probable Number，MPN)同樣耗時費力，不能滿足快速檢測需求。尋 找快速、簡單、準確的金黃色葡萄球菌檢測方法是研究人員十分關(guān)注的課題。國內(nèi)外的研究 者在食品安全快速檢測方面，已經(jīng)取得了很大的進展，新的快速檢測技術(shù)逐漸應(yīng)用于食品 安全快速檢測領(lǐng)域。目前，關(guān)于金黃色葡萄球菌及其腸毒素檢測的方法很多。常用的分子生 物學(xué)方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain React ion, PCR)、核酸探針技術(shù)、重組 DNA技術(shù)以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等，主要用于金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測，這類方法優(yōu) 點是靈敏度高、特異性強，但是檢測方法復(fù)雜，需要昂貴的實驗儀器設(shè)備以及專業(yè)技術(shù)人員 操作，檢測成本相對較高，同時PCR擴增產(chǎn)物容易引起實驗室的污染等問題，也不利于在一 般實驗室的應(yīng)用。免疫學(xué)方法應(yīng)用較多的有乳膠凝集技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、免疫熒光技術(shù)以 及免疫磁珠技術(shù)等，可以實現(xiàn)對病原微生物的快速檢測，本類技術(shù)具有操作簡單、高通量的 優(yōu)點，在此基礎(chǔ)上研究出的自動熒光酶標(biāo)儀，可以極大程度地提高檢測的靈敏度和特異性， 但由于儀器設(shè)備過于昂貴，也不利于在基層實驗室的推廣應(yīng)用。新型的測試片法、顯色培 養(yǎng)基法，以及生化試劑盒法都是在金黃色葡萄球菌傳統(tǒng)平板檢測方法改進而來的。測試片 是將顯色培養(yǎng)基附著在無紡布、濾紙等固體載體上，運用測試卡片的技術(shù)制成的，自問世以 來，以其便于攜帶、簡便、快速、特異性高等優(yōu)點為許多國家所采用，尤其適用于現(xiàn)場以及突 發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢測檢測。由于紙片面積小，微生物生長產(chǎn)生過多的粘液使相鄰菌 落融合，使用時間較長時，無法準確計數(shù)。
[0004] 顯色培養(yǎng)基的問世，是傳統(tǒng)平板檢測方法的一個重大突破。顯色培養(yǎng)基是建立在 細胞內(nèi)生化反應(yīng)的基礎(chǔ)上，利用微生物自身代謝而產(chǎn)生特異性酶或其他特異性物質(zhì)，在培 養(yǎng)基中添加相應(yīng)的顯色底物，使菌落呈現(xiàn)特定的顏色進而實現(xiàn)分離和鑒別微生物的目的。 目前，金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基產(chǎn)品比較成熟的主要有法國科瑪嘉公司的CHROMagar Staphaureus、法國生物梅利埃公司的 S aureus ID和BD 公司的BBLTM CHROMagarTM. Staph aureust弓丨。近年來，國內(nèi)一些生物科技公司也致力于金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基的研究。 市面上常用的顯色培養(yǎng)基產(chǎn)品也有很高的特異性和靈敏度，但由于顯色培養(yǎng)基價格昂貴， 檢測成本高及購買不方便，使其推廣應(yīng)用受到限制，不能滿足實際需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種適用于金黃色葡萄球菌的選擇性顯色培養(yǎng)基，以及采用該選擇性 顯色培養(yǎng)基的檢測試紙，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
[0006] 本發(fā)明首先涉及一種金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基，其中每IOOOmL培養(yǎng)基 含有如下重量的組分：蛋白胨8-12g、酵母粉5-8g、丙酮酸鈉3-6g、氯化鈉55-90g、亞碲酸 鉀30-45g、氯化鋰7-10g、瓊脂10-20g、復(fù)合特異性酶顯色底物0. 2-0. 5g、二甲基甲酰胺 30_75g、抗生素0. 04-0. 08g、助顯色劑0. 05-0. lg，余量為水。
[0007] 所述復(fù)合特異性酶顯色底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和 5_溴-4-氯-3- a -D-批喃半乳糖苷的混合物，兩者的重量配比優(yōu)選為0. 2-1. 5 :1，最好是 0. 8-1. 0 ： 1 〇
[0008] 所述抗生素選自鏈霉素、氨芐西啉、甲氧西林、阿米卡星、磺胺嘧啶的一種以上，優(yōu) 選氨芐西啉或磺胺嘧啶。
[0009] 所述助顯色劑選自麥芽糖、硫酸鎂、氯化鐵或過氧化月桂酰的一種以上。
[0010] 本發(fā)明還涉及一種采用該金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基制作的檢測試紙，其 至少含有一吸附有上述金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基的吸水濾紙。
[0011] 為了更好的區(qū)分金黃色葡萄球菌，在顯色培養(yǎng)基添加雜菌生長抑制劑，包括鏈霉 索、氨芐西啉、甲氧西林、阿米卡星、磺胺嘧啶等金黃色葡萄球菌耐性抗生素，可以抑制大部 分革蘭氏陰性菌的生長和部分革蘭氏陽性菌的生長。
[0012] 蛋白胨、酵母粉、丙酮酸鈉、氯化鈉為金黃色葡萄球菌生長提供豐富的營養(yǎng)和適宜 的生長環(huán)境，有助于葡萄球菌快速生長。
[0013] 助顯色劑與特異性酶顯色底物相結(jié)合，加強顯色效果。
[0014] 本發(fā)明使用高鹽培養(yǎng)基等金葡菌選擇性培養(yǎng)基，添加金葡菌天然耐性抗生素提高 選擇性，添加金葡菌代謝酶特異性底物顯色，提高檢查效率，還可制作成試紙條方便實際使 用。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基解決了現(xiàn)有顯色培養(yǎng)基不能很好地區(qū)分金黃色葡萄球菌和其它葡 萄球菌的缺陷，本發(fā)明不僅可以作為金黃色葡萄球菌和其它葡萄球菌確認培養(yǎng)基，還可以 作為從樣品中特異性分離金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基，應(yīng)用前景廣泛。

【具體實施方式】
[0015] 下面給出本發(fā)明較佳實施例，以詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0016] 實施例1
[0017] 蛋白胨8g、酵母粉5g、丙酮酸鈉3g、氯化鈉55g、亞締酸鉀30g、氯化鋰7g、瓊脂 l〇g、5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0· 08g、5-溴-4-氯-3-a -D-吡喃半乳糖苷0· 4g、二 甲基甲酰胺30g、鏈霉素0. 03g、氨芐西啉0. 05g、過氧化月桂酰0. lg，余量為水。
[0018] 將上述成分溶于水至IOOOmL,加熱煮沸，調(diào)節(jié)pH至7. 4±0. 2，120°C滅菌15min，即 可使用。
[0019] 實施例2
[0020] 蛋白胨12g、酵母粉8g、丙酮酸鈉6g、氯化鈉90g、亞締酸鉀45g、氯化鋰10g、瓊脂 20g、5-溴-4-氯-3- Π 引哚基磷酸酯〇. 13g、5-溴-4-氯-3- Π 引哚基磷酸酯〇. lg、二甲基甲 酰胺75g、甲氧西林0. 04g、氯化鐵0. 02g、過氧化月桂酰0. 03g，余量為水。
[0021] 將上述成分溶于水至IOOOmL,加熱煮沸，120°C滅菌15min，即可使用。
[0022] 實施例3
[0023] 蛋白胨10g、酵母粉6g、丙酮酸鈉5g、氯化鈉70g、亞締酸鉀35g、氯化鋰8g、瓊脂 15g、5-溴-4-氯-3- Π 引哚基磷酸酯0· 14g、5-溴-4-氯-3- Π 引哚基磷酸酯0· 16g、二甲基甲 酰胺45g、抗生素氨芐西啉0. 025g、磺胺嘧啶0. 025g、硫酸鎂0. 05g、過氧化月桂酰0. 03g，余 量為水。
[0024] 將上述成分溶于水至IOOOmL,加熱煮沸，120°C滅菌15min，即可使用。
[0025] 實施例4
[0026] 金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基檢測試紙的制備：將選定的吸水濾紙浸入金黃 色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基中浸漬10-15分鐘后取出烘干，冷卻至室溫后裁成一定規(guī)格 試紙備用。
[0027] 實施例5
[0028] 在實施例4得到的試紙上下兩面分別蓋覆一層聚丙烯保護膜。
[0029] 實施例6
[0030] 特異性驗證。將金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙 門菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、弗氏朽1檬酸桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀菌、宋 內(nèi)志賀菌、志賀菌I型、志賀菌II型、鮑氏志賀菌和副溶血性弧菌接種在實施例1-3培養(yǎng)基 中，37°C培養(yǎng)18h。結(jié)果如表1，" + "表示陽性結(jié)果，"一"表示陰性結(jié)果。
[0031] 表1顯色培養(yǎng)基特異性檢驗結(jié)果
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基，其中每IOOOrnL培養(yǎng)基含有如下重量的組 分：
2. 如權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基，其特征在于，所述復(fù)合特 異性酶顯色底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和5-溴-4-氯-3- a -D-吡喃半乳糖苷 的混合物。
3. 如權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基，其特征在于，所述 5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和5-溴-4-氯-3- a -D-批喃半乳糖苷的重量配比為 0· 2_1· 5 :1 〇
4. 如權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基，其特征在于，所述 5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和5-溴-4-氯-3- a -D-吡喃半乳糖苷的重量配比為 0. 8-1. 0 ： 1 〇
5. 如權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基，其特征在于，所述抗生素 選自鏈霉素、氨芐西啉、甲氧西林、阿米卡星、磺胺嘧啶的一種以上。
6. 如權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基，其特征在于，所述抗生素 選自優(yōu)選氨芐西啉或磺胺嘧啶。
7. 如權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基，其特征在于，所述助顯色 劑選自麥芽糖、硫酸鎂、氯化鐵或過氧化月桂酰的一種以上。
8. -種金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基檢測試紙，其特征在于，其中至少含有一吸 附有權(quán)利要求1-7任一項所述金黃色葡萄球菌選擇性顯色培養(yǎng)基的吸水濾紙。
【文檔編號】C12R1/445GK104388526SQ201410681446
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】金京勛 申請人:蘇州嘉禧蘿生物科技有限公司