基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法,包括(1)針對(duì)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化后的Alu序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物;(2)標(biāo)本血清DNA提取和亞硫酸氫鈉處理;(3)對(duì)處理后的標(biāo)本進(jìn)行BSP測(cè)序;(4)根據(jù)測(cè)序結(jié)果,分析篩選出檢測(cè)位點(diǎn),并針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)探針;(5)制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品PCR產(chǎn)物;(6)將探針包被到微球上(7)將包被了探針的微球與PCR產(chǎn)物雜交孵育,并在液相芯片機(jī)器上進(jìn)行檢測(cè),讀取數(shù)據(jù);(8)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后,計(jì)算出每個(gè)樣品的甲基化水平。本發(fā)明方法相較于現(xiàn)有的檢測(cè)方法,是一種高通量、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠的定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法。
【專利說(shuō)明】基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種基因甲基化水平的定量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Alu和LINE等重復(fù)序列是研宄基因組整體甲基化水平的主要靶基因。
[0003]Alu家族是靈長(zhǎng)類動(dòng)物基因組內(nèi)最具特征性的短散在重復(fù)序列。人Alu元件由兩個(gè)不完全對(duì)稱的單體組成,典型Alu長(zhǎng)282 bp,左右兩部分為同源序列,其間為富含腺苷酸的連接區(qū)。Alu RNA實(shí)質(zhì)上為獲得polyA結(jié)構(gòu)的7sL RNA 二聚體,而7sL RNA是信號(hào)識(shí)別顆粒的重要組成部分。Alu序列作為人類基因組中的調(diào)控序列,對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)起重要作用。Alu元件的去甲基化是基因組穩(wěn)定性降低的標(biāo)志,也是基因組重組和染色體易位的必要條件。
[0004]目前,甲基化水平的檢測(cè)方法主要有甲基化特異PCR (MSP)、結(jié)合亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶分析(COBRA)、亞硫酸氫鹽基因測(cè)序(BSP)、焦磷酸測(cè)序、定量甲基化特異PCR(Methylight)以及高分辨率溶解曲線檢測(cè)(HRM)等。目前運(yùn)用這些方法對(duì)Alu序列進(jìn)行甲基化水平檢測(cè)存在以下這些問(wèn)題:MSP和COBRA方法均局限于對(duì)某一或兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定性檢測(cè),對(duì)操作過(guò)程和位點(diǎn)選擇有很高的要求,受標(biāo)本個(gè)體差異的影響較大,同時(shí)定性檢測(cè)不如定量檢測(cè)準(zhǔn)確可靠;BSP和焦磷酸測(cè)序雖然可以檢測(cè)一定范圍內(nèi)DNA序列的所有CpG位點(diǎn)的甲基化水平,但操作繁瑣,每一個(gè)樣本檢測(cè)均需構(gòu)建多個(gè)克隆,分別測(cè)序后統(tǒng)計(jì)分析甲基化水平,甲基化水平結(jié)果的準(zhǔn)確性在一定程度上取決于選取克隆數(shù)的多少,并且這兩種方法并不能稱為是完全意義上的定量檢測(cè);Methylight雖然可以定量檢測(cè)基因的甲基化水平,但目前一般只對(duì)基因中某一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),Alu序列中有多個(gè)CpG位點(diǎn),其中的某一個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平是否能夠完全代表Alu基因的整體甲基化水平還有待研宄。HRM檢測(cè)可以檢測(cè)基因整體的甲基化水平,對(duì)基因中的各個(gè)CpG位點(diǎn)的具體甲基化水平卻無(wú)法研宄。
[0005]因此,針對(duì)Alu基因,建立一種新的、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠的定量甲基化檢測(cè)方法十分有必要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于針對(duì)Alu基因,提供一種操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠的基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法,其特征是:包括下列步驟:
(I)針對(duì)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化后的Alu序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物;(2)標(biāo)本血清DNA提取和亞硫酸氫鈉處理;(3)對(duì)處理后的標(biāo)本進(jìn)行BSP測(cè)序;(4)根據(jù)測(cè)序結(jié)果,分析篩選出檢測(cè)位點(diǎn),并針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)探針;(5)制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品PCR產(chǎn)物;(6)將探針包被到微球上(7)將包被了探針的微球與PCR產(chǎn)物雜交孵育,并在液相芯片機(jī)器上進(jìn)行檢測(cè),讀取數(shù)據(jù);(8)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后,計(jì)算出每個(gè)樣品的甲基化水平。
[0008]步驟(I)中,選擇Alu 22bp?259bp為靶序列,此片段中共有17個(gè)CpG位點(diǎn),針對(duì)這個(gè)片段,上下游引物分別為5’ - TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3’和5’ -CCCAAACTAAAATACAATAA -3,。
[0009]步驟(5)中,基因合成24個(gè)CpG位點(diǎn)分別為CG和TG兩種堿基類型的兩段Alu基因,以這兩段序列的系列體積比稀釋溶液作為該方法的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0010]通過(guò)BSP檢測(cè)標(biāo)本后選擇185bp進(jìn)行下游檢測(cè),根據(jù)此位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探針序列為:探針 CG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTCGGGAGGCGGAGGT,和探針 TG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTTGGGAGGTGGAGGTo
[0011]Alu序列是根據(jù)RepeatMasker和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道找到的Alu家族的共有保守序列(圖1)。經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后,Alu原序列中的CpG位點(diǎn)處的C不變,其他位置的C變?yōu)門(mén),以該轉(zhuǎn)化后的序列一一亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化后的Alu序列作為下游檢測(cè)的模板(圖2)。發(fā)生了甲基化的CpG位點(diǎn),經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鈉處理后仍然為CG,而處于非甲基化狀態(tài)的CpG位點(diǎn),經(jīng)過(guò)處理后變?yōu)門(mén)G,由于我們需要得到所有甲基化和非甲基化產(chǎn)物,故設(shè)計(jì)引物時(shí)避開(kāi)CpG位點(diǎn),選擇Alu 22bp?259bp為靶序列,此片段中共有17個(gè)CpG位點(diǎn),針對(duì)這個(gè)片段,本發(fā)明中Alu基因的上下游引物分別為5’- TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3’和5’-CCCAAACTAAAATACAATAA -3’(圖2方框處),以此序列作為BSP檢測(cè)的上下游引物;在該上下游引物5’端加上生物素標(biāo)記,作為基于液相芯片的定量甲基化檢測(cè)的引物。
[0012]本發(fā)明中首先通過(guò)BSP測(cè)序篩選出下游檢測(cè)的靶位點(diǎn),使得下游基于該位點(diǎn)的檢測(cè)更加有針對(duì)性,更能有效的代表Alu基因的整體甲基化水平。根據(jù)篩選出的CpG位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)CG和TG兩種類型的探針。為了與含有羧基的微球進(jìn)行偶聯(lián),每條探針的5’端均需加入一個(gè)氨基。
[0013]液相芯片系統(tǒng)是一種以熒光編碼微球?yàn)楹诵?,集流式?xì)胞、激光分析、高速數(shù)字信號(hào)處理等多種技術(shù)于一體的多指標(biāo)并行分析技術(shù)平臺(tái)。該方法具有通量大、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。目前液相芯片系統(tǒng)對(duì)核酸的檢測(cè)應(yīng)用主要集中在對(duì)基因進(jìn)行單核苷酸多樣性分析(SNP)和病毒核酸檢測(cè)。液相芯片系統(tǒng)能夠在同一個(gè)樣本中對(duì)單個(gè)或多個(gè)靶基因進(jìn)行檢測(cè),并可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè),本發(fā)明中我們將其引入到Alu基因甲基化檢測(cè)中,利用液相芯片系統(tǒng)中的微球包被特異性探針,微球在流式細(xì)胞功能的作用下單個(gè)通過(guò)激光分析系統(tǒng),在高速數(shù)字信號(hào)處理系統(tǒng)的作用下進(jìn)行分析,使甲基化檢測(cè)通量更高、操作更簡(jiǎn)便。由于結(jié)合液相芯片系統(tǒng),本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路和方法不僅可用于對(duì)Alu基因中各CpG位點(diǎn)分別進(jìn)行甲基化水平檢測(cè),也可以選擇性的將針對(duì)不同位點(diǎn)的探針進(jìn)行組合,在一個(gè)標(biāo)本中同時(shí)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行甲基化水平檢測(cè),多位點(diǎn)檢測(cè)有利于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和可靠性。不僅如此,液相芯片系統(tǒng)的運(yùn)用使得大規(guī)模樣本同時(shí)檢測(cè)成為可能,極大的提高了樣本檢測(cè)效率。
[0014]本發(fā)明方法相較于現(xiàn)有的檢測(cè)方法,是一種高通量、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠的定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是Alu原始序列。
[0016]圖2是經(jīng)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化后的Alu序列,方框處為引物位置,灰色陰影處為CG位點(diǎn)。
[0017]圖3是質(zhì)粒CG序列。方框處為CG位點(diǎn)。
[0018]圖4是質(zhì)粒TG序列。方框處為T(mén)G位點(diǎn)。
[0019]圖5是液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]圖6是批內(nèi)重復(fù)性結(jié)果。
[0021]圖7是批間重復(fù)性結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1:基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因185bp處CpG位點(diǎn)的甲基化水平
(I)靶序列選擇和引物設(shè)計(jì)
根據(jù)ItepeatMasker和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道找到Alu家族的共有保守序列(圖1)。經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后,Alu序列中的CpG位點(diǎn)處的C不變,其他位置的C變?yōu)門(mén),以該轉(zhuǎn)化后的序列作為下游檢測(cè)的模板(圖2)。
[0023]發(fā)生了甲基化的CG位點(diǎn),經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鈉處理后仍然為CG,而處于非甲基化狀態(tài)的CG位點(diǎn),經(jīng)過(guò)處理后變?yōu)門(mén)G,由于我們需要得到所有甲基化和非甲基化產(chǎn)物,故設(shè)計(jì)引物時(shí)避開(kāi)CG位點(diǎn),選擇Alu 22bp?259bp為靶序列,本發(fā)明中Alu基因的上下游引物分別為 5’- TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3’ 和 5’- CCCAAACTAAAATACAATAA -3’(圖 2 方框處),以此序列作為BSP檢測(cè)的上下游引物;在該上下游引物5’端加上生物素標(biāo)記,作為基于液相芯片的定量甲基化檢測(cè)的引物。
[0024](2)血清DNA提取和標(biāo)本處理
使用含有促凝劑和分離膠的血清分離管無(wú)菌采集新鮮血液3 miaeoog離心10分鐘,吸取上層血清,并放于-80°c保存。血清DNA提取按照德國(guó)Qiagen公司核酸提取試劑盒(QIAamp MinElute Virus Spin Kit)說(shuō)明書(shū)對(duì)血清中游離DNA進(jìn)行提取。按照德國(guó)Qiagen公司的亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化試劑盒(Epitect Bisulfite Kit)說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)化上步提取的DNA,回收后-20°C保存。
[0025](3) BSP 檢測(cè)
將經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化的DNA標(biāo)本送上海睿安公司進(jìn)行BSP測(cè)序,每個(gè)標(biāo)本要求做8個(gè)克隆。
[0026](4)去甲基化位點(diǎn)選擇
根據(jù)Alu基因185bp處的CG位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)CG和TG兩種類型的探針,每條探針的5’端均加入一個(gè)氨基(為了與含有羧基的微球進(jìn)行偶聯(lián))。
[0027]探針序列分別為:
探針 CG:NH2-1TITITITTTGAATTCGGGAGGCGGAGGT,和探針 TG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTTGGGAGGTGGAGGTo
[0028](5)標(biāo)準(zhǔn)品制備
基因合成24個(gè)CpG位點(diǎn)分別為CG和TG兩種堿基類型的兩段Alu基因(見(jiàn)圖6和圖7),將其分別構(gòu)建到PCDNA3.1載體中,用上下游都標(biāo)記了生物素的引物對(duì)這兩種質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系為:20 μ L PCR混合物中包含10 μ L南京天為生物公司的PCR混合液(BU-Taq 2 X Master PCR Mix),0.5 μ L 的質(zhì)粒 DNA, 10 μ M 的上下游引物各 0.4μ L和8.7 μ L雙蒸水。PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性10分鐘,隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94°C變性30秒,59°C退火30秒,72°C延伸30秒),最后在72°C延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物按照體積比配成CG含量(CG%)分別為0%、20%、40%、60%、80%和100%的溶液,以此作為該方法的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0029](6)樣本PCR產(chǎn)物制備
以步驟(2)中亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化后的DNA為模板,用上下游都標(biāo)記了生物素的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系為:20 μ L PCR混合物中包含10 μ L南京天為生物公司的PCR混合液(BU-Taq 2 X Master PCR Mix),2 μ L 的標(biāo)本 DNA, 10 μΜ 的上下游引物各 0.4 μ L和7.2 μ L雙蒸水。PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性10分鐘,隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94°C變性30秒,57°C退火30秒,72°C延伸30秒),最后在72°C延伸10分鐘。
[0030](7)微球包被
將步驟(4)中我們?cè)O(shè)計(jì)的兩種探針?biāo)蜕虾M妇肮具M(jìn)行微球包被,每種探針包被到唯一編號(hào)的一種微球上。
[0031](8)雜交孵育及上機(jī)檢測(cè)
將包被了探針CG/TG的兩種微球配制成工作微球混合物,每22 μ L工作微球混合物含有16.8 yL 1.5 X TMAC (sigma),兩種微球各0.1 yL,5 μ L I X TE緩沖液。向96孔板中每孔加入22 μ L工作微球混合物和3 μ L PCR產(chǎn)物,95°C變性5分鐘,47 °C孵育30分鐘。用I XTE緩沖液將親和素-藻紅蛋白(streptavidin-R-phycoerythrin, sigma)稀釋成最終濃度為10 μ g/mL的工作報(bào)告溶液混合物,30分鐘后每孔加入該溶液75 μ L, 47°C孵育15分鐘。在液相芯片(Luminex 200 xMAP)上47°C進(jìn)行檢測(cè),并讀取數(shù)據(jù)。在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí),加入一個(gè)陰性對(duì)照,陰性對(duì)照PCR擴(kuò)增體系為:20 uL PCR混合物中包含10 UL南京天為生物公司的PCR混合液(BU-Taq 2XMaster PCR Mix),10 μΜ的上下游引物各0.4 yL和9.2 yL雙蒸水。PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性10分鐘,隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94°C變性30秒,59°C退火30秒,72°C延伸30秒),最后在72°C延伸10分鐘。陰性對(duì)照的讀數(shù)為本底值,其他讀數(shù)均需扣除本底值后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0032](9)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
以CG含量(0%、20%、40%、60%、80%和100%)為橫坐標(biāo),探針CG讀數(shù)/ (探針CG讀數(shù)+探針TG讀數(shù))為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到相應(yīng)的回歸方程。
[0033](10)液相芯片檢測(cè)Alu基因甲基化水平
根據(jù)機(jī)器給出的每個(gè)標(biāo)本的探針CG和探針TG讀數(shù),代入回歸方程,計(jì)算得到相應(yīng)標(biāo)本的CG含量,即標(biāo)本的甲基化水平。
[0034](11)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
用GraphPad Prism v5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P < 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩獨(dú)立樣本比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),多個(gè)獨(dú)立樣本比較用Kruskall-Wallis H檢驗(yàn),雙變量相關(guān)分析用Spearman相關(guān)檢驗(yàn);受試者工作曲線(Receiver Operator CharacteristicCurve, ROC曲線)用于評(píng)價(jià)參數(shù)作為診斷標(biāo)志物的準(zhǔn)確性和精確性,依據(jù)最大曲線下面積(Area Under the Curve,AUC)計(jì)算最佳截?cái)嘀导捌錅?zhǔn)確度和精確度。
[0035](12)對(duì)上述建立基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。
[0036]線性:以CG含量(0%、20%、40%、60%、80%和100%)為橫坐標(biāo),探針CG讀數(shù)/ (探針CG讀數(shù)+探針TG讀數(shù))為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到回歸方程y=0.6679x+0.0476和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性R2=0.9888 (圖5),線性良好。
[0037]重復(fù)性:反應(yīng)設(shè)立2個(gè)復(fù)孔,分別選取CG%為20%和60%的溶液,同一批重復(fù)做20個(gè)測(cè)定,批內(nèi)CV值分別為13.9%和4.7% (圖6)。選取CG%為20%和60%的溶液,連續(xù)測(cè)定5天,每天重復(fù)做4個(gè)測(cè)定,批間CV值分別為16.2%和6.0% (圖7),該方法重復(fù)性佳。
【權(quán)利要求】
1.一種基于液相芯片定量檢測(cè)AlU基因甲基化水平的方法,其特征是:包括下列步驟:(I)針對(duì)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化后的Alu序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物;(2)標(biāo)本血清DNA提取和亞硫酸氫鈉處理;(3)對(duì)處理后的標(biāo)本進(jìn)行BSP測(cè)序;(4)根據(jù)測(cè)序結(jié)果,分析篩選出檢測(cè)位點(diǎn),并針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)探針;(5)制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品PCR產(chǎn)物;(6)將探針包被到微球上(7)將包被了探針的微球與PCR產(chǎn)物雜交孵育,并在液相芯片機(jī)器上進(jìn)行檢測(cè),讀取數(shù)據(jù);(8)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后,計(jì)算出每個(gè)樣品的甲基化水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法,其特征是:步驟(I)中,選擇Alu 22bp?259bp為靶序列,此片段中共有17個(gè)CpG位點(diǎn),針對(duì)這個(gè)片段,上下游引物分別為5’ - TTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGT -3’和5’ -CCCAAACTAAAATACAATAA -3,。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法,其特征是:步驟(5)中,基因合成24個(gè)CpG位點(diǎn)分別為CG和TG兩種堿基類型的兩段Alu基因,以這兩段序列的系列體積比稀釋溶液作為該方法的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相芯片定量檢測(cè)Alu基因甲基化水平的方法,其特征在于:通過(guò)BSP檢測(cè)標(biāo)本后選擇185bp進(jìn)行下游檢測(cè),根據(jù)此位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探針序列為:探針CG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTCGGGAGGCGGAGGT,和探針 TG:NH2-TTTTTTTTTTGAATTTGGGAGGTGGAGGT0
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104498591SQ201410676539
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】戚菁, 鞠少卿, 施煒, 李曉紅, 郭益冰, 申嫻娟, 陸晶晶, 施維, 朱慧, 吳信華 申請(qǐng)人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院