一種木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，屬于生物酶制劑生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明以玉米芯為主要原料，利用玉米芯稀酸汽爆料水浸液為誘導(dǎo)物來源，采用黑曲霉液態(tài)深層發(fā)酵法，包括：a）菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng)，b）補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)，c）木聚糖酶的提純和d）發(fā)酵液殘渣的處理，特別地，在b）補(bǔ)料發(fā)酵過程中連續(xù)流加玉米芯稀酸汽爆料水浸液為誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，同時在一個發(fā)酵周期內(nèi)間歇排出發(fā)酵醪液，經(jīng)板框過濾，超濾濃縮，添加防腐劑后，得液體木聚糖酶產(chǎn)品。本發(fā)明所得木聚糖酶酶活力提高60~70%，產(chǎn)量提高40~50%，在原料消耗及能耗不增加的情況下，大幅度提高產(chǎn)品酶活力和出產(chǎn)率，增加產(chǎn)能，提高設(shè)備利用率，降低單位酶活力發(fā)酵成本。
【專利說明】一種木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物酶制劑生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法。

【背景技術(shù)】
[0002]木聚糖酶是指可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括外切β-1，4-木聚糖酶、內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶和β_木聚糖酶。木聚糖酶在飼料、食品、造紙、紡織、醫(yī)藥及能源等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。木聚糖酶用作飼料酶制劑，可以有效解除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，促進(jìn)畜禽對粗飼料的消化吸收。木聚糖酶作為新型的紙漿漂白助劑，降低漂白用氯，解決紙漿工業(yè)中的環(huán)境污染問題。在纖維素燃料乙醇的生產(chǎn)實踐中，添加木聚糖酶可剝離木質(zhì)素與纖維素之間的聚合態(tài)，易于酶解過程中的酶與底物的充分接觸，利于酶解反應(yīng)的發(fā)生，同時能夠分解半纖維素成為酵母可利用的單糖，提高出酒率，降低纖維乙醇的成本。隨著纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的加快，木聚糖酶的開發(fā)研究更加備受關(guān)注。
[0003]木聚糖酶的生產(chǎn)菌種主要由細(xì)菌、真菌和霉菌。其中，霉菌具有許多表達(dá)木聚糖酶的基因，產(chǎn)酶水平高于酵母菌和細(xì)菌，在木聚糖酶的發(fā)酵方面應(yīng)用最為廣泛。木聚糖酶主要通過以上微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲得，根據(jù)發(fā)酵工藝的不同，可分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種。固態(tài)發(fā)酵是傳統(tǒng)的發(fā)酵方式，菌種大多是霉菌，具有控制簡單、成本較低、無污染、產(chǎn)率較高等優(yōu)點，但是固態(tài)發(fā)酵同時也存在以下缺點:不易控制，酶系復(fù)雜，纖維素等酶含量高，難以精酶化等。液態(tài)深層發(fā)酵是液態(tài)發(fā)酵的常用發(fā)酵方式，已經(jīng)成為發(fā)酵工業(yè)的主導(dǎo)方式，該方法便于在生產(chǎn)過程中進(jìn)行實時檢測、控制，易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。同時，由于液體輸送方便，便于機(jī)械化操作，產(chǎn)品也易于提取精制。
[0004]CN 101182470 A公開了一種制備木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，采用黑曲霉發(fā)酵法，其特征在于將適量黑曲霉菌株無菌條件下接入不銹鋼母罐中，生產(chǎn)發(fā)酵罐加入發(fā)酵培養(yǎng)基至罐體積70?75% ;培養(yǎng)發(fā)酵:30°C，15(T200r/min，通風(fēng)0.Γ?.5VVM，70?80Η，在發(fā)酵中后期4(Γ60Η之間補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)；停止發(fā)酵:發(fā)酵至7(Γ80Η，依據(jù)鏡檢菌體形態(tài)，若菌體開始自溶即停止發(fā)酵；發(fā)酵液主要有三種處理方式:酶粗品的鹽析法和噴霧干燥法，絮凝-超濾法制得精制固體酶和精制液態(tài)酶。液態(tài)深層發(fā)酵比固態(tài)發(fā)酵的酶活力要高出1(Γ30%，粗酶每噸生產(chǎn)成本降低20%以上。該發(fā)明所得木聚糖酶的酶活力提高有限，可能是由于產(chǎn)酶階段發(fā)酵罐中的誘導(dǎo)物對木聚糖酶合成的促進(jìn)作用不明顯導(dǎo)致的。
[0005]高效生產(chǎn)木聚糖酶的因素有很多，關(guān)鍵因素是選擇合適的誘導(dǎo)底物和最佳培養(yǎng)基組成。在發(fā)酵過程中，還有一些因素影響著木聚糖酶的產(chǎn)生，如底物的可接近性、低聚木糖的釋放速率和數(shù)量及化學(xué)特性，還有所能產(chǎn)生的木糖量等。若酶與底物結(jié)合得緊密，則會有一部分木聚糖酶因結(jié)合在不溶性底物上而在處理酶液時被丟失。因此酶與底物結(jié)合的緊密程度也會影響到木聚糖酶的產(chǎn)量。另外，微生物菌體本身產(chǎn)生的代謝酶(如蛋白酶、糖苷轉(zhuǎn)移酶等)都會影響到木聚糖酶的產(chǎn)量。
[0006]我國具有豐富的玉米芯、甘蔗渣、小麥麩、秸桿等富含半纖維素類自然資源的農(nóng)林廢棄物，長期以來未受到充分重視和開發(fā)利用。而現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)木聚糖酶的成本仍比較高，而大多數(shù)合成原料價格又比較貴，如何利用廉價的纖維素材料高效生產(chǎn)木聚糖酶是研究者和生產(chǎn)者關(guān)注的重點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種木聚糖酶液態(tài)深層發(fā)酵方法，在原料消耗及能耗不增加的情況下，大幅度提高產(chǎn)品酶活力和出產(chǎn)率，增加產(chǎn)能，提高設(shè)備利用率，降低單位酶活力發(fā)酵成本。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態(tài)深層發(fā)酵法，具體包括以下步驟:
a)菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng):將黑曲霉菌株Aspergillusniger CGMCC N0.5833轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，30 0C，培養(yǎng)4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養(yǎng)基(121?124。。，滅菌30min)中，于180?220r/min，28?32°C條件下，培養(yǎng)18?24h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.3、.5% (v/v)的接種量接入一級種子罐中，于28?32°C，通氣比1:
0.6、.8 (v/v)的條件下，培養(yǎng)If 20h，得到一級種子液；將所述一級種子液以8?10% (v/V)的接種量接入二級種子罐，于28?32°C，通氣比1:0.6、.8 (v/v)的條件下，培養(yǎng)8?12h，得到二級種子液；
b)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng):在發(fā)酵罐中加入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為5(Γ60%(ν/ν)，調(diào)節(jié)pH值為4.5^5.0,于12f 124°C，滅菌30min ;待培養(yǎng)基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10?15%的接種量接入所述二級種子液，接種后(TlOh，通氣比為1:0.6?1.5(v/V)，攪拌轉(zhuǎn)速為15(T200r/min，培養(yǎng)溫度為30?32°C;接種1h以后，通氣比1:0.5?1.0 (v/V)，攪拌轉(zhuǎn)速10(T200r/min，培養(yǎng)溫度28?30°C ;當(dāng)還原糖濃度在0.1% (w/w)以下時，開始加入補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為每小時補(bǔ)料量為發(fā)酵培養(yǎng)基的1.2^1.6%(w/w)，控制還原糖的濃度在0.2% (w/w)以下；當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐體積的80%時進(jìn)行排料，至發(fā)酵液體積達(dá)發(fā)酵罐體積的70%時停止排料，一個發(fā)酵周期內(nèi)重復(fù)排料操作，發(fā)酵周期為5?7天;
c)木聚糖酶的提純:發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，所得過濾液用有機(jī)膜進(jìn)行超濾，濃縮至所需倍數(shù)；然后加入防腐劑，得液體木聚糖酶產(chǎn)品；
d)發(fā)酵液殘渣的處理:將經(jīng)過板框壓濾機(jī)所得的發(fā)酵液殘渣進(jìn)行烘干處理，使之含水量為10?15% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
[0009]步驟a)中所述三角瓶種子培養(yǎng)基、一級種子罐及二級種子罐的組成均為，以質(zhì)量百分比計，葡萄糖1.5%，麩皮4%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，余量為水；
步驟b)中所述發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為，以質(zhì)量百分比，玉米芯5.(Γ7.0%，麩皮
1.0?2.0%，玉米漿1.5?3.0%，硫酸銨0.4?0.6%，磷酸二氫鉀0.2?0.4%，硫酸鎂0.1?0.3%，氯化鈣0.05、.15%，微量元素0.05、.2%，余量為水。
[0010]進(jìn)一步的，所述玉米芯的粒度小于0.5mm。
[0011]步驟b)中所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為，質(zhì)量百分比計，葡萄糖3.(Γ5.0%，玉米漿
2.0?3.0%，硫酸銨0.6?0.8%，磷酸二氫鉀0.4?0.8%，硫酸鎂0.2?0.4%，氯化鈣0.1?0.3%，微量元素0.05、.1%，其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
[0012]進(jìn)一步的，所述微量元素的組成為，質(zhì)量百分比計，鑰酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%，余量為水。
[0013]進(jìn)一步的，所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯，于0.5?1.0% (w/w)的硫酸溶液中浸泡,6?1kg壓力下保持10?15min,進(jìn)行汽爆處理，然后添加水分，使汽爆處理后的玉米芯固形物含量保持在6?10% (w/w)，浸泡f2h，利用板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
[0014]進(jìn)一步的，步驟c)中所述有機(jī)膜為膜分子量為10000道爾頓的有機(jī)膜。
[0015]進(jìn)一步的，步驟c)中所述防腐劑的組分配比為:氯化鈉7g?10g，苯甲酸鈉
0.1g?0.3g。
[0016]由于本發(fā)明一種木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，包括a)菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng)，
b)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)，c)木聚糖酶的提純和d)發(fā)酵液殘渣的處理，該方法無廢棄物排出，環(huán)保無污染，具有以下有益效果:
(O該方法能夠在原料消耗及能耗不增加的情況下，增加產(chǎn)能，提高設(shè)備利用率，降低單位酶活力發(fā)酵成本，所得產(chǎn)品的酶活力提高6(Γ70%，出產(chǎn)率提高4(Γ50% ；
(2)本發(fā)明以玉米芯為主要原料通過液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，為玉米芯的綜合開發(fā)與利用提供了新方法和新途徑；
(3)本發(fā)明在補(bǔ)料過程中所采用的玉米芯稀酸汽爆料水浸液中含有一定量的低聚木糖，在木聚糖酶的發(fā)酵過程中有利于誘導(dǎo)黑曲霉菌株產(chǎn)酶；與以往直接以粉碎后的玉米芯補(bǔ)料相比，降低了玉米芯的粉碎成本，同時以液體方式補(bǔ)料避免了玉米芯顆粒堵塞管道的風(fēng)險；
(4)本發(fā)明所采取的連續(xù)流加、間歇放料模式，可有效解除發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)的匱乏及產(chǎn)物的反饋抑制，提高木聚糖酶的發(fā)酵水平；
(5)本發(fā)明所用原料玉米芯為可再生資源，且來源廣泛，價格低廉，以其為原料發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，不僅能夠變廢為寶，而且還降低了木聚糖酶的生產(chǎn)成本，所得殘渣還可做飼料添加劑使用。

【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做一步的說明。
[0018]實施例一
下面以1m3發(fā)酵罐為例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0019]本發(fā)明木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態(tài)深層發(fā)酵法，可按以下步驟進(jìn)行:
a)菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng):將黑曲霉菌株niger CGMCC N0.5833轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，于30°C條件下培養(yǎng)4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養(yǎng)基(121?124°C下，滅菌30 min)中，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，28°C條件下培養(yǎng)24h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.3% (v/v)的接種量接入一級種子罐中，于28°C,通氣比1:0.8 (v/v)的條件下，培養(yǎng)20h，得到一級種子液；將所述一級種子液以8% (v/v)的接種量接入二級種子罐，于28°C，通氣比1:0.6 (v/v)的條件下，培養(yǎng)10h，得到二級種子液；此步驟中，所述的三角瓶種子培養(yǎng)基、一級種子罐及一級種子罐的組成均為，以質(zhì)量百分比，葡萄糖1.5%，麩皮4%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，余量為水；
b)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng):在1m3發(fā)酵罐中，裝入5m3發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(以質(zhì)量百分比計，粒度小于0.5mm的玉米芯6.0%，麩皮1.0%，玉米漿2.0%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.1%，氯化鈣0.12%，微量元素0.05%，余量為水)，將所述發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為5.0，于12f 124°C下滅菌30min ;待培養(yǎng)基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的接種量接入所述二級種子液，接種后6h，通氣比為1:0.6(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)溫度為320C ;接種后20h，通氣比為1:0.5 (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)溫度為29°C ;發(fā)酵35h時，還原糖濃度為0.05%(w/w)，加入補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為60L/h,還原糖的濃度控制在0.15% (w/w);當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)到8m3時,開始進(jìn)行排料,至發(fā)酵液體積達(dá)7m3時，停止排料；一個發(fā)酵周期內(nèi)重復(fù)排料操作，發(fā)酵周期為6天；
其中，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比組成為，葡萄糖3.0%，玉米漿2.5%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.3%，氯化鈣0.1%，微量元素0.08%,其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液，調(diào)節(jié)PH值為4.7，于12fl24°C下滅菌30min。所述微量元素的質(zhì)量百分比組成為，鑰酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%。所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯，于0.7%(w/w)硫酸溶液中浸泡，8kg壓力下保持12min，進(jìn)行汽爆處理，然后添加一定量的水分，使處理后的玉米芯固形物含量保持在8% (w/w)，浸泡1.5h，利用板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液；
c)木聚糖酶的提純:發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，所得過濾液用膜分子量為10000道爾頓的有機(jī)膜進(jìn)行超濾，濃縮至所需倍數(shù)；然后加入防腐劑，其組分配比為氯化鈉7g，苯甲酸鈉0.lg，得液體木聚糖酶產(chǎn)品；
d)發(fā)酵液殘渣的處理:將經(jīng)過板框壓濾機(jī)所得的發(fā)酵液殘渣進(jìn)行烘干，使之含水量在10% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
[0020]木聚糖酶的酶活力單位統(tǒng)一定義(U):在pH=4.8，50°C條件下，每分鐘降解底物生成I μ moL木糖所需的酶量為I個活力單位。
[0021]經(jīng)測定，本實施例所得木聚糖酶的酶活力為2568.35U/mL，單罐單批發(fā)酵液總量12.4噸；與現(xiàn)有的木聚糖酶液態(tài)深層發(fā)酵工藝相比，木聚糖酶的酶活力提高了 60%，出產(chǎn)率提高40%，單位酶活力發(fā)酵成本降低8%。
[0022]實施例二
下面以20m3發(fā)酵罐為例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0023]本發(fā)明木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態(tài)深層發(fā)酵法，可按以下步驟進(jìn)行:
a)菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng):將黑曲霉菌株niger CGMCC N0.5833轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，于30°C條件下培養(yǎng)4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養(yǎng)基(121?124°C下，滅菌30 min)中，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，30°C條件下培養(yǎng)20h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.5% (v/v)的接種量接入所述一級種子罐中，于30°C，通氣比1:0.7的條件下，培養(yǎng)18h，得到一級種子液；將所述一級種子液以10% (v/v)的接種量接入二級種子罐，于30°C，通氣比1:0.7的條件下，培養(yǎng)12h，得到二級種子液。其中，所述的三角瓶種子培養(yǎng)基、一級種子罐及二級種子罐的組成均為:以質(zhì)量百分比，葡萄糖1.5%，麩皮4%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，余量為水；
b)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng):在20m3發(fā)酵罐中，裝入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基12m3(以質(zhì)量百分比，粉碎粒度小于0.5mm的玉米芯7.0%，麩皮1.5%，玉米漿3.0%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.2%，氯化鈣0.05%,微量元素0.1%，余量為水)，將上述培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值為4.8，于12f 124°C下滅菌30min，；待培養(yǎng)基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的12% (v/v)的接種量接入所述二級種子液,接種后9h,通氣比為1:1，攪拌轉(zhuǎn)速為160r/min,培養(yǎng)溫度為30°C;接種后15h，通氣比為1:0.8，攪拌轉(zhuǎn)速為110r/min，培養(yǎng)溫度為28°C;發(fā)酵32h，還原糖濃度為0.08%，加入補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為每小時補(bǔ)料量為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基1.4% (w/w),還原糖控制在0.1% (w/w);當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐體積的80%時進(jìn)行排料，至發(fā)酵液體積達(dá)發(fā)酵罐體積的70%時停止排料，一個發(fā)酵周期內(nèi)重復(fù)排料操作，維持發(fā)酵液體積在發(fā)酵罐體積的70%之間，發(fā)酵周期為7天；
其中，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比組成為，葡萄糖4.0%，玉米漿2.0%，硫酸銨0.7%，磷酸二氫鉀0.7%，硫酸鎂0.4%，氯化鈣0.2%，微量元素0.06%,其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液，調(diào)節(jié)PH值為4.5，于12f 124°C下滅菌30min。所述微量元素的質(zhì)量百分比組成為，鑰酸銨0.04%,硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%。所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯，于0.5%(w/w)硫酸溶液中浸泡，6kg壓力下保持lOmin，進(jìn)行汽爆處理，然后添加一定量的水分，使處理后的玉米芯固形物含量保持在6% (w/w)，浸泡lh，利用板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液；
c)木聚糖酶的提純:發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，所得過濾液用膜分子量為10000道爾頓的有機(jī)膜進(jìn)行超濾，濃縮至所需倍數(shù)；然后加入防腐劑，其組分配比為氯化鈉8g，苯甲酸鈉0.2g，得液體木聚糖酶產(chǎn)品；
d)發(fā)酵液殘渣的處理:將經(jīng)過板框壓濾機(jī)所得的發(fā)酵液殘渣進(jìn)行烘干，使之含水量在13% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
[0024]經(jīng)測定，本實施例所得木聚糖酶的酶活力為2968.04U/mL，單罐單批發(fā)酵液總量32.5噸；與現(xiàn)有的木聚糖酶液態(tài)深層發(fā)酵工藝相比，木聚糖酶的酶活力提高了 65%，出產(chǎn)率提高46%，單位酶活力發(fā)酵成本降低6%。
[0025]實施例三
下面以50m3發(fā)酵罐為例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0026]本發(fā)明木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態(tài)深層發(fā)酵法，可按以下步驟進(jìn)行:
a)菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng):將黑曲霉菌株niger CGMCC N0.5833轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，于30°C條件下培養(yǎng)4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養(yǎng)基(121?124°C下，滅菌30 min)中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，32°C條件下培養(yǎng)18h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.4% (v/v)的接種量接入所述一級種子罐中，于32°C，通氣比1:0.6的條件下，培養(yǎng)20h，得到一級種子液；將所述一級種子液以9% (v/v)的接種量接入二級種子罐，于32°C，通氣比1:0.8的條件下，培養(yǎng)8h，得到二級種子液。其中，所述三角瓶種子培養(yǎng)基、一級種子罐及二級種子罐的組成均為:以質(zhì)量百分比，葡萄糖1.5%，麩皮4%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，余量為水；
b)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng):在60m3發(fā)酵罐中，裝入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基36m3(以質(zhì)量百分比，粉碎粒度小于0.5mm玉米芯5.0%，麩皮2.0%，玉米漿1.5%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.3%，氯化鈣0.15%，微量元素0.2%，余量為水)，將上述培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值為4.5，于12f 124°C下滅菌30min ;待培養(yǎng)基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的15%(v/v)的接種量接入所述二級種子液,接種后4h,通氣比為1:1.5,攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min,培養(yǎng)溫度為32°C ;接種后llh，通氣比為1:1，攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min，培養(yǎng)溫度為29°C ;發(fā)酵30h，還原糖濃度為0.02%,加入補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為每小時補(bǔ)料量為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基1.6% (w/w),還原糖控制在0.12% (w/w);當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐體積的80%時進(jìn)行排料，至發(fā)酵液體積達(dá)發(fā)酵罐體積的70%時停止排料，一個發(fā)酵周期內(nèi)重復(fù)排料操作，維持發(fā)酵液體積在發(fā)酵罐體積的80%之間，發(fā)酵周期為5天；
其中，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比組成為，葡萄糖5.0%，玉米漿3.0%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.4%，氯化鈣0.3%，微量元素0.1%，其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液，調(diào)節(jié)PH值為4.5，于12fl24°C下滅菌30min。所述微量元素的質(zhì)量百分比組成為，鑰酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%。所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯，于1.0% (w/w)硫酸溶液中浸泡，1kg壓力下保持15min，進(jìn)行汽爆處理，然后添加一定量的水分，使處理后的玉米芯固形物含量保持在10% (w/w)，浸泡2h，利用板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液；
c)木聚糖酶的提純:發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，所得過濾液用膜分子量為10000道爾頓的有機(jī)膜進(jìn)行超濾，濃縮至所需倍數(shù)；然后加入防腐劑，其組分配比為氯化鈉10g，苯甲酸鈉0.3g，得液體木聚糖酶產(chǎn)品；
d)發(fā)酵液殘渣的處理:將經(jīng)過板框壓濾機(jī)所得的發(fā)酵液殘渣進(jìn)行烘干，使之含水量在15% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
[0027]經(jīng)測定，本實施例所得木聚糖酶的酶活力為3485.65U/mL，單罐單批發(fā)酵液總量97.6噸；與現(xiàn)有的木聚糖酶液態(tài)深層發(fā)酵工藝相比，木聚糖酶的酶活力提高了 70%，出產(chǎn)率提高50%，單位酶活力發(fā)酵成本降低7.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，以玉米芯為主要原料，采用黑曲霉液態(tài)深層發(fā)酵法，其特征在于，它具體包括以下步驟: a)菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng):將黑曲霉菌株nigerCGMCC N0.5833轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，300C，培養(yǎng)4天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入于12f 124°C，滅菌30min的三角瓶種子培養(yǎng)基中，于18(T220r/min，28?32°C條件下，培養(yǎng)18?24h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.3^0.5% (v/v)的接種量接入所述一級種子罐中，于28?32°C，通氣比1:0.6^0.8的條件下，培養(yǎng)18?20h，得到一級種子液；將所述一級種子液以8?10% (v/v)的接種量接入二級種子罐，于28?32°C，通氣比1:0.6^0.8的條件下，培養(yǎng)8?12h，得到二級種子液； b)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng):在發(fā)酵罐中加入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為5(Γ60%(ν/ν)，調(diào)節(jié)pH值為4.5^5.0,12Γ124°0，滅菌30min ;待培養(yǎng)基溫度降至30°C，在無菌條件下，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1(Γ?5%(ν/ν)的接種量接入所述二級種子液，接種后(TlOh，通氣比為1:0.6?1.5，攪拌轉(zhuǎn)速為15(T200r/min，培養(yǎng)溫度為3(T32°C;接種1h以后，通氣比1:0.5?1.0，攪拌轉(zhuǎn)速10(T200r/min，培養(yǎng)溫度28?30°C;當(dāng)還原糖含量在0.1% (w/w)以下時，開始加入補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為每小時補(bǔ)料量為發(fā)酵培養(yǎng)基1.2^1.6%(w/w)，控制還原糖的含量在0.2% (w/w)以下；當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐體積的80%時進(jìn)行排料，至發(fā)酵液體積達(dá)發(fā)酵罐體積的70%時停止排料，一個發(fā)酵周期內(nèi)重復(fù)排料操作，發(fā)酵周期為5?7天； c)木聚糖酶的提純:發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，所得過濾液用有機(jī)膜進(jìn)行超濾，濃縮至所需倍數(shù)；加入防腐劑，得液體木聚糖酶產(chǎn)品； d)發(fā)酵液殘渣的處理:將經(jīng)過板框壓濾機(jī)所得的發(fā)酵液殘渣進(jìn)行烘干，使之含水量在10?15% (w/w)，作為飼料添加劑使用。
2.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，其特征在于:步驟a)中所述三角瓶種子培養(yǎng)基、一級種子罐及二級種子罐的質(zhì)量百分比組成均為，1.5%葡萄糖，4%麩皮，1%玉米漿，0.5%酵母粉，余量為水。
3.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，其特征在于:步驟b)中所述發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比組成為，玉米芯5.(Γ7.0%，麩皮1.(Γ2.0%，玉米漿1.5^3.0%，硫酸銨0.4?0.6%，磷酸二氫鉀0.2?0.4%，硫酸鎂0.1?0.3%，氯化鈣0.05?0.15%，微量元素0.05?0.2%，余量為水。
4.如權(quán)利要求3所述的木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，其特征在于:所述玉米芯的粒度小于0.5mmο
5.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，其特征在于:步驟b)中所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比組成為，葡萄糖3.(Γ5.0%，玉米漿2.(Γ3.0%，硫酸銨0.6^0.8%，磷酸二氫鉀0.4?0.8%，硫酸鎂0.2?0.4%，氯化鈣0.1?0.3%，微量元素0.05?0.1%，其余為玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
6.如權(quán)利要求5所述的木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，其特征在于:所述微量元素的質(zhì)量百分比組成為，鑰酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%。
7.如權(quán)利要求5所述的木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，其特征在于:所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通過如下制備方法獲得的:將粒度小于1mm的玉米芯,于0.5"?.0% (w/w)硫酸溶液中浸泡，6?10kg壓力下保持l(Tl5min，進(jìn)行汽爆處理，然后添加一定量的水分，使處理后的玉米芯固形物含量保持在6?10% (w/w)，浸泡f2h，利用板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，SP得玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
8.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，其特征在于:步驟c)中所述有機(jī)膜為膜分子量為10000道爾頓的有機(jī)膜。
9.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法，其特征在于:步驟c)中所述防腐劑的組分配比為:氯化鈉7g?10g，苯甲酸鈉0.lg^0.3g。
【文檔編號】C12R1/685GK104357428SQ201410638530
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】王林風(fēng), 趙子高, 閆德冉, 楊付偉, 王蕊 申請人:河南天冠纖維乙醇有限公司