一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化獲得內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，首先用條件培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化毛細(xì)胞前體細(xì)胞；然后利用誘導(dǎo)培養(yǎng)液與滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)合的方法誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化成熟內(nèi)耳毛細(xì)胞；本發(fā)明所述方法能夠有效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟內(nèi)耳毛細(xì)胞，分化比率高，分化所得細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞特異基因和蛋白，并具備一定毛細(xì)胞電生理功能。
【專利說明】一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種內(nèi)耳毛細(xì)胞的分化方法，特別涉及一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化 獲得內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 聽力損失是嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的世界性頑疾之一，目前尚無根治方法。哺乳 動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞的不可修復(fù)損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致聽力損失的最主要原因之一。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn) 為，人類內(nèi)耳聽覺毛細(xì)胞為特化終末細(xì)胞，不再具有再生修復(fù)能力，其損傷是不可逆的。近 年來研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物胚胎期或早期毛細(xì)胞有可能再生，并且通過轉(zhuǎn)染促毛細(xì)胞分化發(fā)育 相關(guān)基因在成年耳蝸中發(fā)現(xiàn)不成熟毛細(xì)胞的異位發(fā)生，提示了哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞在一定誘導(dǎo) 條件下實(shí)現(xiàn)再生的可能性，但對(duì)于病變過程中毛細(xì)胞的修復(fù)再生仍存在很大挑戰(zhàn)。因此尋 找毛細(xì)胞再生的前體細(xì)胞來源，以便開發(fā)毛細(xì)胞損傷修復(fù)干預(yù)策略是聽力損失治療的當(dāng)務(wù) 之急。
[0003] 干細(xì)胞以其全能或多能性以及高度的自我增殖能力等諸多優(yōu)點(diǎn)而成為組織工程 和細(xì)胞治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。近年來越來越多研究展示了胚胎干細(xì)胞和各種來源的成體 干細(xì)胞在組織損傷修復(fù)和疾病治療研究中的極大優(yōu)勢和應(yīng)用潛能，以干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為基 礎(chǔ)，利用干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)，探討聽覺系統(tǒng)損傷修復(fù)特別是毛細(xì)胞的損傷和再生已成為可能。 同時(shí)，由于毛細(xì)胞數(shù)量稀少，對(duì)于毛細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制研究仍然非常有限。因此，探索建 立有效的干細(xì)胞分化毛細(xì)胞誘導(dǎo)體系，不僅能為毛細(xì)胞再生治療提供有效細(xì)胞來源，而且 將為探討毛細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)分子和信號(hào)機(jī)制提供研究模型。胚胎干細(xì)胞具有體外培養(yǎng)無 限增殖、自我更新和分化全能性等優(yōu)點(diǎn)，是干細(xì)胞分化領(lǐng)域的重點(diǎn)。本發(fā)明利用胚胎干細(xì) 胞，建立了一種條件培養(yǎng)液、細(xì)胞因子和滋養(yǎng)層細(xì)胞相結(jié)合有效誘導(dǎo)分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方 法。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化獲得內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，本發(fā)明 方法首先用條件培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化毛細(xì)胞前體細(xì)胞；然后利用誘導(dǎo) 培養(yǎng)液與滋養(yǎng)層細(xì)胞（即雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞）結(jié)合的方法誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化成熟內(nèi)耳毛 細(xì)胞，通過本方法誘導(dǎo)，能夠得到高比例的毛細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟內(nèi)耳毛細(xì)胞。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，所述的方法為：（1) 將小鼠胚胎干細(xì)胞接種至條件培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)4-5天，形成細(xì)胞團(tuán)；取 細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)液I中，在37°C、5% CO2條件誘導(dǎo)培養(yǎng)12-14天，獲得胚胎干細(xì)胞分化 的毛細(xì)胞前體細(xì)胞；所述條件培養(yǎng)液終濃度組成為：體積濃度30-50% HepG2條件培養(yǎng)液、 ImM非必需氨基酸、5 μ Μβ-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、體積濃度10% FBS(胎牛血清）， 溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；所述H印G2條件培養(yǎng)液按如下方法制備：將H印G2細(xì)胞以 5X 104cellS/cm2密度接種于培養(yǎng)皿中，按I. 75X 105cellS/mL培養(yǎng)液的量加入含體積終濃 度10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)4-5天后收集上層培養(yǎng)液，離心除 去細(xì)胞碎片，獲得上層清液和下層沉淀，棄去下層沉淀，取上層清液經(jīng)抽濾（優(yōu)選〇. 22 μ m 濾膜抽濾），濾液即為HepG2條件培養(yǎng)液；所述誘導(dǎo)液I終濃度組成為：體積濃度5 % FBS、 5-15ng/ml IGF-I (胰島素樣生長因子-l)、20-30ng/ml EGF(表皮細(xì)胞生長因子）、1XN2、 lXB27、45-55ng/mL FGF3(成纖維細(xì)胞生長因子3)、45-55ng/mL FGFlO(成纖維細(xì)胞生長因 子10)、45-55ng/mL肝素鈉，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；
[0007] (2)將雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞（優(yōu)選生長至90%匯合度的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞）用 含終濃度2 μ g/ml絲裂霉素 C的DMEM培養(yǎng)液浸泡，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)， 棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用pH值為7. 4的PBS緩沖液洗滌，即為預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞；
[0008] (3)將步驟⑴獲得的毛細(xì)胞前體細(xì)胞進(jìn)行消化處理，靜置沉淀，棄沉淀，將細(xì)胞 懸液接種（優(yōu)選將細(xì)胞懸液以IO 5個(gè)/cm2的密度接種）至預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞 上，加入誘導(dǎo)液II，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)3-4周，獲得含內(nèi)耳毛細(xì)胞的培養(yǎng)液， 收集內(nèi)耳毛細(xì)胞；所述誘導(dǎo)液II終濃度組成：體積濃度5% FBS、20-30ng/ml EGF、1XN2、 1ΧΒ27、5-15μΜ RA(全反式維甲酸）、5μΜ氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰）-1^-丙氨酰]-5-苯 基甘氨酸丁酯（DAPT)，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0009] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述條件培養(yǎng)液終濃度組成為：體積濃度40% HepG2條件培養(yǎng)液、 ImM非必需氨基酸、5 μ Μβ -巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、體積濃度10% FBS，溶劑為DMEM/ F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0010] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述誘導(dǎo)液I終濃度組成為：體積濃度5% FBS、10ng/mlIGF-l、 25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、50ng/mL FGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL肝素鈉，溶劑為DMEM/ F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0011] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞即為滋養(yǎng)層細(xì)胞，制備方法主要通過消 化和傳代方法從受精18天雞胚中分離培養(yǎng)橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞，第3-5代細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素 C 處理后，作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，具體所述雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞按如下方法制備：從受精18天雞 胚中分離橢圓囊，0. 25%胰酶，37°C消化15-20分鐘后，用體積終濃度10% FBS+DMEM培養(yǎng) 液中止，過200目篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，lOOOrpm/min離心6-8分鐘，細(xì)胞用體積終濃度10% FBS+DMEM培養(yǎng)液懸浮，接種于培養(yǎng)瓶中，置37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48小時(shí)后首次換液， 棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁繼續(xù)培養(yǎng)至90%匯合度，用0. 25%胰酶/EDTA消化并接種至細(xì)胞培 養(yǎng)瓶培養(yǎng)，記為Pl代細(xì)胞，通過如此傳代培養(yǎng)，至P3代，即得到形雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞。
[0012] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述毛細(xì)胞前體細(xì)胞用accutase進(jìn)行消化處理。
[0013] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述誘導(dǎo)液II終濃度組成：體積濃度5% FBS、25ng/mlEGF、lXN2、 1ΧΒ27、10μΜ RA、5yM DAPT，溶劑為 DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0014] 更進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法推薦按如下步驟進(jìn) 行：（1)將小鼠胚胎干細(xì)胞ES-D3接種至含質(zhì)量濃度1%瓊脂（即瓊脂用水溶解制成質(zhì)量 濃度1%瓊脂溶液，然后倒平板）的培養(yǎng)板上，加入條件培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2條件下培 養(yǎng)4-5天，每天換液；取細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)孔板內(nèi)，加入誘導(dǎo)液I，在37°C、5% CO2條件誘 導(dǎo)培養(yǎng)12-14天，每天換液，獲得胚胎干細(xì)胞分化的毛細(xì)胞前體細(xì)胞；所述條件培養(yǎng)液終 濃度組成為：體積濃度40% !fepG2條件培養(yǎng)液、ImM非必需氨基酸、5 μ Μβ -巰基乙醇、2mM GlutaMAX、10% FBS，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；所述H印G2條件培養(yǎng)液按如下方法制 備：將H印G2細(xì)胞以5X104cells/cm2密度接種于培養(yǎng)皿中，按I. 75X 105cells/mL培養(yǎng)液 的量加入含體積終濃度10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)4-5天后 收集上層培養(yǎng)液，離心除去細(xì)胞碎片，上層清液經(jīng)0. 22 μ m濾膜抽濾，濾液即為HepG2條 件培養(yǎng)液；所述誘導(dǎo)液I終濃度組成為：體積濃度5% FBS、10ng/ml IGF-l、25ng/ml EGF、 lXN2、lXB27、50ng/mL FGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL 肝素鈉，溶劑為 DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng) 液；
[0015] (2)將生長至90%匯合度的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞用含終濃度2 μ g/ml絲裂霉素 C 的DMEM培養(yǎng)液浸泡，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用pH值為7. 4 的PBS緩沖液洗滌，即為預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞；
[0016] (3)用accutase消化步驟（1)獲得的毛細(xì)胞前體細(xì)胞,靜置沉淀除去未分散的 細(xì)胞團(tuán)塊，棄沉淀，將細(xì)胞懸液接種至預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞上，加入誘導(dǎo)液Π ， 在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)3-4周，獲得含內(nèi)耳毛細(xì)胞的培養(yǎng)液，收集內(nèi)耳毛細(xì)胞； 所述誘導(dǎo)液II終濃度組成：體積濃度5% FBS、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、10yM RA、5yM DAPT，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0017] 本發(fā)明中所述培養(yǎng)液及誘導(dǎo)液中的因子均可通過市購方式獲得，DMEM/F12基礎(chǔ)培 養(yǎng)液優(yōu)選購自Corning公司，I XN2和I XB27均購自Invitrogen，所述受精18天雞胚購自 杭州天源養(yǎng)殖有限公司。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明所述方法能夠有效誘導(dǎo) 胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟內(nèi)耳毛細(xì)胞，分化所得細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞特異 基因和蛋白，并具備一定毛細(xì)胞電生理功能。且通過本方法誘導(dǎo)能夠獲得更高比例的內(nèi)耳 毛細(xì)胞前體細(xì)胞核成熟內(nèi)耳毛細(xì)胞。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1毛細(xì)胞前體細(xì)胞標(biāo)志基因檢測圖；圖1中ES表示未誘導(dǎo)分化的胚胎干細(xì)胞， progenitor表示胚胎干細(xì)胞分化所得毛細(xì)胞前體細(xì)胞，β -actin作為內(nèi)參。
[0020] 圖2毛細(xì)胞前體細(xì)胞蛋白免疫熒光檢測圖；Al為Pax2表達(dá)，A2為Pax8表達(dá)，A3為 細(xì)胞核（DAPI染色），A4為A1、A2和A3三幅圖的疊加；Bl為Atohl表達(dá)，B2為Pax2表達(dá)， B3為細(xì)胞核（DAPI染色），B4為B1、B2和B3三幅圖的疊加；Cl為Atohl表達(dá)，C2為Brn3C 表達(dá)，C3為細(xì)胞核（DAPI染色），C4為Cl、C2和C3三幅圖的疊加。
[0021] 圖3成熟毛細(xì)胞蛋白免疫熒光檢測圖；Al為Espin和細(xì)胞核C23表達(dá)，A2為 F-actin和細(xì)胞核C23表達(dá)，A3為Al和A2兩幅圖的疊加；Bl為Espin和細(xì)胞核C23表達(dá)， B2為Myosin W a和細(xì)胞核C23表達(dá)，B3為Bl和B2兩幅圖的疊加；Cl為FM1-43FX染色和 細(xì)胞核C23表達(dá)，C2為Myosin W a和細(xì)胞核C23表達(dá)，C3為Cl和C2兩幅圖的疊加。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0023] 實(shí)施例1 :條件培養(yǎng)液和因子組合的方法誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化毛細(xì)胞前體細(xì)胞
[0024] 將小鼠胚胎干細(xì)胞ES-D3 (購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞 生物學(xué)研究所）傳代后接于預(yù)鋪質(zhì)量濃度1 %瓊脂的培養(yǎng)板上，加入條件培養(yǎng)液在37°C、 5% CO2條件培養(yǎng)4-5天，每天換液。然后將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至12孔板內(nèi)，每孔約30個(gè)，換誘導(dǎo) 液I，在37°C、5% CO2條件誘導(dǎo)培養(yǎng)12-14天，每天換液，獲得胚胎干細(xì)胞分化的毛細(xì)胞前 體細(xì)胞。
[0025] 條件培養(yǎng)液終濃度組成：體積濃度40 % H印G2條件培養(yǎng)液、ImM非必需氨基酸（購 自Gibco公司，編號(hào)：11140-050)、5μ Mβ-巰基乙醇（購自Gibco公司）、2mM L-谷氨酰胺 (購自Gibco公司）、體積濃度10% FBS，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液（購自Corning公 司）。
[0026] HepG2條件培養(yǎng)液的制備：將HepG2細(xì)胞（購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué) 研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）以5X10 4cellS/cm2密度接種于培養(yǎng)皿中，按 I. 75X 105cells/mL培養(yǎng)液的量加入含體積終濃度10% FBS(購自Gibco公司）的DMEM培 養(yǎng)液（購自Corning公司），置于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)4-5天后收集上層培養(yǎng)液，離心 除去細(xì)胞碎片，上層清液經(jīng)〇. 22 μ m濾膜抽濾，濾液即為HepG2條件培養(yǎng)液。
[0027] 誘導(dǎo)液I終濃度組成：體積濃度5 % FBS、10ng/ml IGF-I (購自P印rotech公 司）、25ng/ml EGF(購自 Peprotech 公司）、1XN2(購自 Invitrogen)、lXB27(購自 Invitrogen)、50ng/mL FGF3 (購自 R&D 公司）、50ng/mL FGFlO (購自 R&D 公司）、50ng/mL 肝 素鈉（購自Sigma公司），溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液（購自Corning公司）。
[0028] 實(shí)施例2 :雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞的分離
[0029] 從受精18天雞胚（購自杭州天源養(yǎng)殖有限公司）中分離橢圓囊，0· 25%胰酶（購 自Corning公司），37°C消化15-20分鐘后，用DMEM培養(yǎng)液（添加體積終濃度10% FBS)中 止，過200目篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，lOOOrpm/min離心6-8分鐘，細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液（添加體 積終濃度10% FBS)懸浮，接種于培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48小時(shí)后首次換 液，棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁繼續(xù)培養(yǎng)至90%匯合度，用0. 25%胰酶/EDTA(購自Corning公 司）消化并接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，記為Pl代細(xì)胞，通過如此傳代培養(yǎng)，至P3代，即得到形 態(tài)單一的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞。
[0030] 實(shí)施例3 :因子組合與滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)合的方法誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化成熟內(nèi)耳毛細(xì)胞
[0031] 首先將實(shí)施例2制備的生長至90 %匯合度的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞用含終濃度 2 μ g/ml絲裂霉素 C (購自Sigma公司）的DMEM培養(yǎng)液浸泡，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用pH值為7. 4的PBS緩沖液（購自生工生物公司）洗滌，除去洗 滌液，即為預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞。
[0032] 用accutase (購自Gibco公司）消化實(shí)施例1誘導(dǎo)分化的毛細(xì)胞前體細(xì)胞，稍靜 置沉淀除去未分散的細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液以IO5個(gè)/cm 2的密度接種至預(yù)處理后的雞胚橢 圓囊間質(zhì)細(xì)胞上，加入誘導(dǎo)液II，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)3-4周，收集誘導(dǎo)細(xì)胞 進(jìn)行鑒定，獲得成熟內(nèi)耳毛細(xì)胞。
[0033] 誘導(dǎo)液II終濃度組成：體積濃度 5% FBS、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、10yM RA、 5 μ M DAPT (購自Sigma公司），溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0034] 實(shí)施例4 :分化細(xì)胞的鑒定
[0035] (1)毛細(xì)胞前體細(xì)胞特異基因檢測：取實(shí)施例1獲得的前體細(xì)胞用TRizol (購自 Invetigen)提取總RNA，提取方法按說明書進(jìn)行，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR kit(AMV) Ver3. O (購自TaKaRa公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別在引物Pax2、 Pax8、Dlx5、Eyal、Sixl、Atohl 和 Brn3c 作用下進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，檢測 Pax2、Pax8、Dlx5、Eyal、 SixUAtohl和fcn3c基因表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。PCR程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，94°C變 性308,501：?651：退火308,721：延伸308，共30?40個(gè)循環(huán)，721：延伸101^11，退火溫度 和循環(huán)數(shù)根據(jù)引物的具體情況進(jìn)行選擇。分別將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析， 同時(shí)以小鼠胚胎干細(xì)胞ES-D3作為對(duì)照，結(jié)果見圖1所示。
[0036] 所用引物（均由上海捷瑞生物公司合成）如下：
[0037] Pax2(5,-CGAATACAAGCGACAGAACC-3,，5,-GGGACAGAGCCCTCAGACA-3'）；
[0038] Pax8 (5,-GCAGAAGGCGTTTGTGAC-3'，5'-GAGCCCGTTGATAGAGTAGG-3'）；
[0039] Dlx5 (5,-GCCAAGGCTTATGCCGACTA-3,，5,-TTCTGGCAGGGCGAGGTAC-3'）；
[0040] Eyal (5,-GTCCACCAATGCCACTTA-3'，5'-AGGTCCCAGATGAACACT-3'）；
[0041] Sixl(5,-CCTCCTCCAACAAGCAGAATC-3'，5'-GGAACCCAAGTCCACCAA-3'）；
[0042] Atohl (5,-GCTCCCTGAAAACTGAGACAACCAA-3'，5'-ATGAAGTGCGTGTATTCTGGGTCC G-3,）；
[0043] Brn3c (5,-AGCCTACACTCCGGCTCTGAG-3,，5,-TGACTCCACATCGCTGAGACACG-3,）；
[0044] β -actin (5,-ACACCTTCTACAATGAGCTG-3'，
[0045] 5'-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3'）。
[0046] (2)毛細(xì)胞前體細(xì)胞免疫熒光檢測：取實(shí)施例I獲得的前體細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛 室溫固定15min后，用pH值7. 4的PBS漂洗除去多聚甲醛，再用0.05% Triton X-100 (購 自Sigma公司）室溫（25°C)孵育lOmin，然后用5%山羊血清（購自生工生物）在室溫封閉 lh，PBS清洗兩次，將細(xì)胞分成3組，分別加入一抗，組1為抗Pax2和Pax8、組2為抗Atohl 和Pax2、組3為Atohl和Brn3c，一抗均購自Santa cruz公司，4°C濕盒孵育過夜；PBS浸洗三 次，每次IOmin ;依次加入二抗，組1加入Alexa488和Dylight649標(biāo)記、組2加入Alexa488 和Alexa647標(biāo)記、組3加入Alexa488和Dylight649標(biāo)記，二抗均購自聯(lián)科生物公司，37°C 孵育lh，PBS浸洗三次；DAPI (購自Sigma公司）染核，激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss)觀 察拍照。結(jié)果見圖2所示。
[0047] (3)成熟毛細(xì)胞特異蛋白免疫熒光檢測：取實(shí)施例3獲得的誘導(dǎo)細(xì)胞，經(jīng)4%多 聚甲醛室溫固定15min后，用pH值7. 4的PBS漂洗除去多聚甲醛，再用0.05% Triton X-100(購自Sigma公司）室溫（25°C )孵育lOmin，然后用5%山羊血清（購自生工生物） 在室溫封閉lh，PBS清洗兩次，分成3組，分別加入一抗，組1為抗Espin和C23,組2為抗 Espin、組3為Myosin7a和C23, 一抗均購自Santa cruz公司，4°C濕盒孵育過夜；PBS浸洗三 次，每次IOmin ;依次加入二抗，組1加入Alexa488和Dylight405標(biāo)記，組2加入Alexa488、 組3加入Dylight649和Dylight405標(biāo)記，二抗均購自聯(lián)科生物公司，37°C孵育lh，PBS浸 洗三次，激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss)觀察拍照。其中Espin和C23檢測組二抗孵育完 成并PBS浸洗后，用TRITC偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽（購自Invitrogen公司）標(biāo)記F-actin，而后進(jìn) 行激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。在二抗之后37°C孵育Ih直接標(biāo)記。結(jié)果見圖3所示。
[0048] 毛細(xì)胞電生理功能檢測：利用FM1-43FX (購自Invitrogen公司）染色實(shí)驗(yàn)檢測誘 導(dǎo)細(xì)胞電生理功能，誘導(dǎo)細(xì)胞用HBSS(購自生工生物公司）清洗后，加入5μΜ FM1-43FX室 溫孵育30s，立即用HBSS清洗，再用HBSS浸洗20min后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測Myosin7a， 步驟和抗體如實(shí)施例4-(3)中所述。結(jié)果見圖3所示。
[0049] 結(jié)果表明，誘導(dǎo)所得分化細(xì)胞能夠表達(dá)毛細(xì)胞前體細(xì)胞特異基因、前體細(xì)胞和成 熟毛細(xì)胞特異性蛋白，并具有一定的毛細(xì)胞電生理功能，表明本發(fā)明方法能夠有效誘導(dǎo)胚 胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞。
[0050] 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，其特征在于所述的方法為：（1) 將小鼠胚胎干細(xì)胞接種至條件培養(yǎng)液，在37°C、5 % C02條件下培養(yǎng)4-5天，形成細(xì)胞團(tuán)；取 細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)液I中，在37°C、5% C02條件誘導(dǎo)培養(yǎng)12-14天，獲得胚胎干細(xì)胞分化的 毛細(xì)胞前體細(xì)胞；所述條件培養(yǎng)液終濃度組成為：體積濃度30-50 % H印G2條件培養(yǎng)液、ImM 非必需氨基酸、5uMP -巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、體積濃度10 % FBS，溶劑為DMEM/F12基 礎(chǔ)培養(yǎng)液；所述H印G2條件培養(yǎng)液按如下方法制備：將H印G2細(xì)胞以5X 104cellS/cm2密度 接種于培養(yǎng)皿中，按1. 75X 105cellS/mL培養(yǎng)液的量加入含體積濃度10% FBS的DMEM培養(yǎng) 液，置于37°C、5% C02條件下培養(yǎng)4-5天后收集上層培養(yǎng)液，離心，取上層清液經(jīng)抽濾，濾液 即為H印G2條件培養(yǎng)液；所述誘導(dǎo)液I終濃度組成為：體積濃度5%FBS、5-15ng/ml IGF-1、 20-30ng/ml EGF、lXN2、lXB27、45-55ng/mL FGF3、45-55ng/mL FGF10、45-55ng/mL 肝素 鈉，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液； (2) 將雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞用含終濃度2 y g/ml絲裂霉素C的DMEM培養(yǎng)液浸泡，在 37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用pH值為7. 4的PBS緩沖液洗滌，即 為預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞； (3) 將步驟（1)獲得的毛細(xì)胞前體細(xì)胞進(jìn)行消化處理，靜置沉淀，棄沉淀，將細(xì)胞懸液 接種至預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞上，加入誘導(dǎo)液II，在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù) 誘導(dǎo)3-4周，獲得分化成熟的內(nèi)耳毛細(xì)胞；所述誘導(dǎo)液II終濃度組成：體積濃度5% FBS、 20-30ng/ml EGF、lXN2、lXB27、5-15iiM RA、5iiM DAPT，溶劑為 DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
2. 如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，其特征在于所述條 件培養(yǎng)液終濃度組成為：體積濃度40% IfepG2條件培養(yǎng)液、ImM非必需氨基酸、5 y MP -巰 基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、體積濃度10% FBS，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
3. 如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，其特征在于所述 誘導(dǎo)液 I 終濃度組成為：體積濃度 5% FBS、10ng/ml IGF-l、25ng/mlEGF、lXN2、lXB27、 50ng/mL FGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL 肝素鈉，溶劑為 DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
4. 如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，其特征在于所述 雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞按如下方法制備：從受精18天雞胚中分離橢圓囊，0.25%胰酶，37°C 消化15-20分鐘后，用體積終濃度10% FBS+DMEM培養(yǎng)液中止，過200目篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸 液，1000rpm/min離心6-8分鐘，細(xì)胞用體積終濃度10% FBS+DMEM培養(yǎng)液懸浮，接種于培養(yǎng) 瓶中，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48小時(shí)后首次換液，棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁繼續(xù)培養(yǎng)至 90%匯合度，用0. 25%胰酶/EDTA消化并接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，記為P1代細(xì)胞，通過如 此傳代培養(yǎng)，至P3代，即得到雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞。
5. 如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，其特征在于所述毛 細(xì)胞前體細(xì)胞用accutase進(jìn)行消化處理。
6. 如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，其特征在于所述誘 導(dǎo)液II終濃度組成：體積濃度 5%FBS、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、10iiM RA、5iiM DAPT， 溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
7. 如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，其特征在于步驟 (3)所述細(xì)胞懸液以105個(gè)/cm2的密度接種至預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞上。
8. 如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，其特征在于所述的 方法按如下步驟進(jìn)行：（1)將小鼠胚胎干細(xì)胞ES-D3接種至含質(zhì)量濃度1%瓊脂的培養(yǎng)板 上，加入條件培養(yǎng)液，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)4-5天，每天換液；取細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至培養(yǎng) 孔板內(nèi)，加入誘導(dǎo)液I，在37°C、5% C02條件誘導(dǎo)培養(yǎng)12-14天，每天換液，獲得胚胎干細(xì)胞 分化的毛細(xì)胞前體細(xì)胞；所述條件培養(yǎng)液終濃度組成為：體積濃度40 % H印G2條件培養(yǎng)液、 ImM非必需氨基酸、5 y MP -巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、體積濃度10% FBS，溶劑為DMEM/ F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；所述H印G2條件培養(yǎng)液按如下方法制備：將H印G2細(xì)胞以5X 104Cells/ cm2密度接種于培養(yǎng)皿中，按1.75X 105cells/mL培養(yǎng)液的量加入含體積終濃度10% FBS 的DMEM培養(yǎng)液，置于37°C、5% C02條件下培養(yǎng)4-5天后收集上層培養(yǎng)液，離心除去細(xì)胞碎 片，上層清液經(jīng)0. 22 y m濾膜抽濾，濾液即為H印G2條件培養(yǎng)液；所述誘導(dǎo)液I終濃度組成 為：體積濃度 5%FBS、10ng/ml IGF-l、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、50ng/mLFGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL肝素鈉，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液； (2) 將生長至90 %匯合度的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞用含終濃度2 y g/ml絲裂霉素C的 DMEM培養(yǎng)液浸泡，在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用pH值為7. 4的 PBS緩沖液洗滌，即為預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞； (3) 用accutase消化步驟（1)獲得的毛細(xì)胞前體細(xì)胞，靜置沉淀，棄去沉淀，將細(xì)胞懸 液以1〇5個(gè)/cm2的密度接種至預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞上，加入誘導(dǎo)液II，在37°C， 5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)3-4周，獲得含內(nèi)耳毛細(xì)胞的培養(yǎng)液，收集內(nèi)耳毛細(xì)胞；所述誘導(dǎo) 液II終濃度組成：體積濃度 5%FBS、25ng/ml EGF、lXN2、lXB27、10iiM RA、5iiM DAPT，溶 劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104403988SQ201410607061
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】項(xiàng)黎新, 潘若浪, 邵建忠, 王萍, 劉小園 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)