長(zhǎng)鏈非編碼rnaloc401317的表達(dá)載體、抑瘤試劑及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOC401317的表達(dá)載體、抑瘤試劑及其應(yīng)用，即用于制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的制劑，根據(jù)該lncRNA序列，設(shè)計(jì)并合成了用于過(guò)表達(dá)LOC401317的真核表達(dá)載體，并將該載體負(fù)載到多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納米顆粒上制成納米球，成功地在鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)出LOC401317，抑制了鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明的多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納米顆粒，可保護(hù)LOC401317載體免受核酸酶降解，延長(zhǎng)作用時(shí)間，有更高的轉(zhuǎn)染效率，有利于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】長(zhǎng)鏈非編碼RNAL0C401317的表達(dá)載體、抑瘤試劑及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及長(zhǎng)鏈非編碼RNAL0C401317的表達(dá)載 體、抑瘤試劑及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鼻咽癌是常見(jiàn)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。研究 表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，其中抑癌基因的失 活與癌基因的激活發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。
[0003] TP53基因（編碼P53蛋白）自1979年被克隆以來(lái)，一直是腫瘤分子生物學(xué)研究領(lǐng) 域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的證據(jù)表明，TP53基因通過(guò)調(diào)控一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路廣泛參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在細(xì)胞受到各種致癌因素的刺激時(shí)，P53蛋白 激活并通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游關(guān)鍵靶基因的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、啟動(dòng)細(xì)胞衰老 及凋亡、參與DNA損傷修復(fù)維持基因組的穩(wěn)定、調(diào)節(jié)能量代謝和抑制腫瘤血管生成，從而阻 止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有的研究發(fā)現(xiàn)，TP53基因是包括鼻咽癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中最常 見(jiàn)的突變基因之一，33%?76%的患者存在TP53基因異常。因此，恢復(fù)鼻咽癌中TP53基因 功能或逆轉(zhuǎn)其下游信號(hào)通路，對(duì)鼻咽癌的治療具有重要的意義。
[0004]長(zhǎng)鏈非編碼 RNAs (long non-coding RNAs, IncRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò) 200nt、缺少 特異完整的開(kāi)放閱讀框、無(wú)或很少有蛋白編碼功能的RNAs分子。最近的研究表明，IncRNAs 通過(guò)在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平廣泛調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，它們參與了生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、 衰老及死亡等重要生命活動(dòng)的調(diào)控。越來(lái)越多的研究表明IncRNAs的異常表達(dá)或功能缺失 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一些IncRNAs分子在腫瘤的診斷和治療方面具有重要的意 義，且可以作為腫瘤預(yù)后判斷新的分子標(biāo)記。目前，已經(jīng)克隆的人類(lèi)IncRNAs基因已超過(guò)4 萬(wàn)多個(gè)，但絕大部分IncRNA的功能未知。
[0005] 為了尋找鼻咽癌中TP53基因調(diào)控的下游IncRNAs及其在鼻咽癌中的應(yīng)用價(jià)值，我 們?cè)诒茄拾┘?xì)胞系中轉(zhuǎn)染TP53基因，收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞用新一代IncRNAs芯片檢測(cè)了 已知IncRNA的表達(dá)水平。芯片檢測(cè)的結(jié)果顯示，IncRNA L0C401317的表達(dá)差異最顯著，其 表達(dá)明顯上調(diào)，提示L0C401317可能具有抑瘤基因的作用。
[0006] 我們構(gòu)建了表達(dá)L0C401317的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到鼻咽癌細(xì)胞株中，在體外培 養(yǎng)系統(tǒng)和裸鼠移殖瘤體內(nèi)模型中均證實(shí)IncRNA L0C401317可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖， 抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此L0C401317是一個(gè)新的抑瘤性IncRNA。將L0C401317真核表達(dá) 載體負(fù)載到多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納米顆粒上制成納米基因轉(zhuǎn)運(yùn)體，多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納 米顆粒，可保護(hù)L0C401317載體免受核酸酶降解，延長(zhǎng)作用時(shí)間，且有更高的轉(zhuǎn)染效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供長(zhǎng)鏈非編碼RNAL0C401317的表達(dá)載體、抑瘤試劑及其應(yīng)用。 利用L0C401317序列得到的載體可以制備抑制鼻咽癌細(xì)胞的制劑。
[0008] 長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的應(yīng)用方法，用于制備抑制鼻咽癌細(xì)胞的制劑，該長(zhǎng)鏈 非編碼RNA L0C401317的序列見(jiàn)SEQ N0:1。
[0009] 抑制鼻咽癌細(xì)胞的制劑為長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體?？梢詫⑺龅?表達(dá)載體負(fù)載到多聚賴(lài)氨酸修飾的娃納米顆粒上制成納米球。
[0010] 具體是選擇Nhe I和EcoR I酶切位點(diǎn)用于酶切PCDNA3. 1載體，并將L0C401317 序列插入該位點(diǎn)，得到長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體；將多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納 米顆粒與長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體混合靜置。
[0011] 構(gòu)建長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體步驟如下：
[0012] 1)以轉(zhuǎn)染TP53基因質(zhì)粒的HNE2細(xì)胞的cDNA為模板，利用TaKaRa LA Taq?酶進(jìn) 行PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)L0C401317序列；
[0013] L0C401317全長(zhǎng)序列擴(kuò)增引物如下：
[0014]上游引物：5' -atcgggggtgtgtgtttgcct-3，
[0015] 下游引物：5' -tgacgtaatggacctgtatcc-3 ^
[0016] 在上、下游引物的5'端分別加上限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I和EcoR I識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù) 堿基后，引物序列如下：
[0017]上游引物：5' -AGGAGCTAGCatcgggggtgtgtgtttgcc-3'
[0018]下游引物：5，-ATGCGAATTC tgacgtaatggacctgtatcc-3';
[0019] 2)PCR反應(yīng)條件如下：

【權(quán)利要求】
1. 長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的應(yīng)用方法，其特征在于，用于制備抑制鼻咽癌細(xì)胞的 制劑，該長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的序列見(jiàn)SEQ N0:1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，抑制鼻咽癌細(xì)胞的制劑為長(zhǎng)鏈非編 碼RNA L0C401317的表達(dá)載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，將所述的表達(dá)載體負(fù)載到多聚賴(lài)氨 酸修飾的娃納米顆粒上制成納米球。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于， 選擇Nhe I和EcoR I酶切位點(diǎn)用于酶切pcDNA3. 1載體，并將L0C401317序列插入該 位點(diǎn)，得到長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體；將多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納米顆粒與長(zhǎng) 鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體混合靜置。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征在于， 構(gòu)建長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體步驟如下： 1) 以轉(zhuǎn)染TP53基因質(zhì)粒的HNE2細(xì)胞的cDNA為模板，利用TaKaRa LA Taq?酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增全長(zhǎng)L0C401317序列； L0C401317全長(zhǎng)序列擴(kuò)增引物如下： 上游引物：5' -atcgggggtgtgtgtttgcct-3' 下游引物：5, -tgacgtaatggacctgtatcc-3' 在上、下游引物的5'端分別加上限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I和EcoR I識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基 后，引物序列如下： 上游引物：5' -AGGAGCTAGC atcgggggtgtgtgtttgcc-3' 下游引物：5，-ATGCGAATTC tgacgtaatggacctgtatcc-3' ; 2. PCR反應(yīng)條件如下： PCR反應(yīng)步驟：
5返回到第2步，共進(jìn)行39次反應(yīng)循環(huán) 3) 將PCR產(chǎn)物電泳、膠回收目的片段后經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切后電泳，再次膠回收； 4. pcDNA3. 1質(zhì)粒經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切后電泳膠回收目的片段； 5) 以T4DNA連接酶連接4)和5)步膠回收產(chǎn)物，即可得到用于真核表達(dá) lncRNAL0C401317 的載體質(zhì)粒； 6) 將第5)步得到的包含L0C401317全長(zhǎng)序列的pcDNA3. 1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大 腸桿菌，以擴(kuò)增質(zhì)粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征在于， 多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納米顆粒是運(yùn)用0P-10、環(huán)己烷、氨水的微乳液自組裝技術(shù)進(jìn)行硅 納米顆粒的合成，并利用硅納米顆粒的表面能和離子靜電作用進(jìn)行多聚賴(lài)氨酸表面修飾， 制備得到。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法，其特征在于，制備多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納米顆粒： 1) 將0P-10、環(huán)己烷和氨水混合，室溫?cái)嚢杈鶆蚝蠹尤胝杷岙愼?，繼續(xù)攪拌至聚合完 成，加入等體積丙酮，超聲分散，離心，雙蒸水洗滌三次，離心收集沉淀于80°C干燥，研細(xì)得 粒徑范圍10-50nm的硅納米顆粒；其中H 2O與0P-10及H2O與正硅酸異酯的摩爾比為2? 10、氨水濃度為1. 6?28%、正硅酸異酯在環(huán)己烷中的摩爾濃度為0. 1?3mol/L ; 2) 將硅納米顆粒按0. 1?10mg/ml重懸于0. 6M NaCO3溶液中，超聲分散，離心，棄上 清，再將沉淀物按〇. 1?l〇mg/ml重懸于pH 7. 4的PBS中，超聲分散，加多聚賴(lài)氨酸，終濃 度為4?15nmol/mL，充分混勻，室溫混搖；離心，棄上清，沉淀按0. 1?10mg/ml重懸于雙 蒸水中，得到多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納米顆粒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述的應(yīng)用方法，其特征在于，將多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納 米顆粒超聲分散，每毫升納米顆粒懸液加入10?50ug長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá) 載體，混合，室溫靜置使其結(jié)合。
9. 長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體，其特征在于， 構(gòu)建長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體步驟如下： 1) 以轉(zhuǎn)染TP53基因質(zhì)粒的HNE2細(xì)胞的cDNA為模板，利用TaKaRa LA Taq?酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增全長(zhǎng)L0C401317序列； L0C401317全長(zhǎng)序列擴(kuò)增引物如下： 上游引物：5' -atcgggggtgtgtgtttgcct-3' 下游引物：5, -tgacgtaatggacctgtatcc-3' 在上、下游引物的5'端分別加上限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I和EcoR I識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基 后，引物序列如下： 上游引物：5' -AGGAGCTAGC atcgggggtgtgtgtttgcc-3' 下游引物：5，-ATGCGAATTC tgacgtaatggacctgtatcc-3' ; 2. PCR反應(yīng)條件如下： PCR反應(yīng)步驟：
3) 將PCR產(chǎn)物電泳、膠回收目的片段后經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切后電泳，再次膠回收； 4. pcDNA3. 1質(zhì)粒經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切后電泳膠回收目的片段； 5) 以T4DNA連接酶連接4)和5)步膠回收產(chǎn)物，即可得到用于真核表達(dá) lncRNAL0C401317 的載體質(zhì)粒； 6) 將第5)步得到的包含L0C401317全長(zhǎng)序列的pcDNA3. 1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大 腸桿菌，以擴(kuò)增質(zhì)粒。
10.基于長(zhǎng)鏈非編碼RNAL0C401317的抑瘤試劑，其特征在于，將權(quán)利要求9所述的長(zhǎng)鏈 非編碼RNA L0C401317的表達(dá)載體與多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納米顆?；旌响o置得到； 多聚賴(lài)氨酸修飾的硅納米顆粒是運(yùn)用0P-10、環(huán)己烷、氨水的微乳液自組裝技術(shù)進(jìn)行硅 納米顆粒的合成，并利用硅納米顆粒的表面能和離子靜電作用進(jìn)行多聚賴(lài)氨酸表面修飾， 制備得到。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104383559SQ201410584336
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】熊煒, 李桂源, 曾朝陽(yáng), 龔朝建, 李小玲, 廖前進(jìn), 陳攀, 曾勇, 張姍姍, 向娟娟, 周艷宏, 李征 申請(qǐng)人:中南大學(xué)