一種檢測血漿中長鏈非編碼rna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測血漿中l(wèi)ncRNA的方法，通過對血漿TrizolLS預(yù)處理后、氯仿和異戊醇混合液提取、異丙醇沉淀、乙醇洗滌、RNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR檢測等步驟，TrizolLS試劑可以較好去除了血中多糖、粘蛋白等雜質(zhì)，RNA降解較少，氯仿和異戊醇混合液有效解決了TrizolLS強酸條件下三氯甲烷易乳化現(xiàn)象，實現(xiàn)了對血漿中RNA進行高質(zhì)量、高含量提取，對lncRNA的質(zhì)量進行熒光定量RT-PCR檢測，同時可以檢驗總RNA（即cDNA）質(zhì)量的參考Ct值。
【專利說明】—種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及血漿中RNA提取及檢測方法，具體涉及一種檢測血漿中長鏈非編碼的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著高通量全基因組測序技術(shù)的普遍應(yīng)用，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞中約98%的轉(zhuǎn)錄物為非編碼RNA分子(noncoding RNA，ncRNA)。在這些非編碼RNA分子中包括目前人們所熟知的看家(houseke印ing)非編碼RNA (如tRNA和rRNA等)、小非編碼RNA (如microRNA和piRNA等),而更多的則是尚待深入研究的長鏈非編碼RNA(long noncodingRNA, IncRNA)分子。
[0003]IncRNA是指一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸(nucleotide, nt)并且不具備編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子。這類分子一般具有高度保守的序列元件、特定的空間二級結(jié)構(gòu)、剪切形式和亞細胞定位，特別是它們中的許多成員被發(fā)現(xiàn)具有組織或細胞特異性。這種保守性和特異性決定了 IncRNA具有廣泛的生物學(xué)功能，涉及染色體結(jié)構(gòu)動態(tài)變化、端粒維持、亞細胞結(jié)構(gòu)組成、基因組印跡和劑量補償效應(yīng)等生命過程。正因為如此，IncRNA不再被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”和RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，而是一類具有重要生物學(xué)功能的新型非編碼RNA分子。
[0004]對于IncRNA的研究，尤其是涉及IncRNA作為腫瘤標志物的研究，離不開各類體液(如血清、血漿)中總RNA的提取、RNA質(zhì)量鑒定與目標IncRNA的定量檢測。目前血漿/血清IncRNA的提取與檢測方法如中國專利申請?zhí)枮镃N201010220261.6，名稱為“從人血清/血漿樣本中分離RNA方法及其PCR驗證法”就公開了操作步驟，具體包括血液加熱、蛋白酶預(yù)處理，加Trizol試劑混勻靜置，氯仿抽提，異丙醇沉淀，靜置離心，75%乙醇洗滌，離心棄上清，晾干加入焦碳酸二乙酯處理水溶解，得到純化后的血清/血漿RNA樣本。但血漿中含有粘多糖、粘蛋白等物質(zhì)，在用該Trizol法提取總RNA的過程中，由于多糖的理化性質(zhì)和RNA非常相似，導(dǎo)致多糖和RNA可以同時沉淀下來，產(chǎn)生富集多糖的透明膠狀沉淀，不利于后續(xù)的cDNA合成和PCR檢測。此外，血漿中總RNA含量低，提取和檢測難度大，Trizol法提取血漿中總RNA存在操作步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低、RNA易降解。截至目前仍沒有提取、檢測血漿/血清中IncRNA的完善技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測血漿中IncRNA的方法，該方法能去除血漿中多糖和粘蛋白等雜質(zhì)的干擾，有效解決Trizol LS中三氯甲烷乳化現(xiàn)象，對血漿中RNA進行高質(zhì)量、高含量提取，并對提取的IncRNA進行熒光定量RT-PCR檢測。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法，其步驟如下:
[0007]I).取血衆(zhòng)300 μ I置于第一離心管中，加入Trizol LS試劑(Trizol LS與Trizol成分相同，但濃度更高，呈強酸性，適合各種體液的總RNA提取，RNA降解較少，多糖和粘蛋白等雜質(zhì)去除較多)900 μ 1，漩渦振蕩10s，室溫靜置5分鐘，4°C下，12000rpm離心10鐘，將上層液體轉(zhuǎn)移到第二離心管中；離心后樣品將分為兩層，上層為粉紅色均質(zhì)化液體，下層是顏色更深的粘稠狀雜質(zhì)層(多糖和粘蛋白等雜質(zhì))；
[0008]2).在第二離心管中加入0.2ml三氯甲烷/異戊醇混合液(三氯甲烷:異戊醇體積比為24:2)，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘后，4°C下12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相移入第三離心管中；三氯甲烷在強酸條件下極易發(fā)生乳化現(xiàn)象，一般操作乳化發(fā)生率約為45%，但三氯甲烷/異戊醇混合液的乳化現(xiàn)象約5% ；
[0009]3).在第三離心管中加入與該上層水相等體積的異丙醇，混勻后，4°C條件下靜置20分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘，棄上清得沉淀；
[0010]4).在上述沉淀中加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇lml，顛倒洗滌，4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清，再用質(zhì)量百分濃度75%的乙醇重復(fù)顛倒洗滌一次，4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清，再在4°C下12000rpm離心1分鐘，用移液器緩慢吸盡離心管中的液體，得到白色RNA沉淀，室溫條件下干燥1分鐘,加10 μ I無RNase水溶解，反復(fù)吹打，得到RNA提取液，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> [0011]5).用GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對上述RNA提取液進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到cDNA溶液，置-20°C保存?zhèn)溆?，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)具體操作依該試劑盒說明書進行；
[0012]6).用GoTaq? qPCR Master Mix檢測試劑盒對上述cDNA溶液進行熒光定量PCR
檢測，得到擴增曲線和解鏈曲線，PCR擴增的上、下游引物分別為RMRP特異性擴增引物、AAl74084特異性擴增引物、BM709340特異性擴增弓丨物、LINCOO152特異性擴增引物或GAPDH特異性擴增引物，PCR具體操作依檢測試劑盒和熒光定量PCR儀說明書進行。
[0013]由于經(jīng)過大量實踐驗證，當樣本cDNA的CteAPDH值≤32，目標IncRNA能得到較好擴增，因此，用本技術(shù)方法提取RNA(即cDNA)質(zhì)量合格的參考標準是:CteAPDH值≤32。
[0014]RMRP特異性擴增引物購于上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5’ ACTCCAAAGTCCGCCAAGA3’ 和 5’ TGCGTAACTAGAGGGAGCTGAC3 ’。
[0015]AA174084特異性擴增引物購于上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5’ CTGGTTCTTCATCCCTGCTATG3’ 和 5’ CCTGCTCCTCTTTGTGTTCTCT3’。
[0016]BM709340特異性擴增引物購于上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5’ TGGATGCTTACAAAGGACTGG3’ 和 5’ CTGCAATTACGGAAAGAGCTG3’。
[0017]LINC00152特異性擴增引物購于上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5’ CTCCAGCACCTCTACCTGTTG3’ 和 5’ GGACAAGGGATTAAGACACACA3 ’。
[0018]GAPDH特異性擴增引物購于上海生工生物工程股份有限公司，具體序列為5’ ACCCACTCCTCCACCTTTGAC3’ 和 5’ TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT3’。
[0019]在第二離心管中再吸取乳化層置于第四離心管中，在第四離心管中加入TrizolLS補足至1ml，混勻后并入第三離心管中。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于一種檢測血漿中IncRNA的方法，通過對血漿Trizol LS預(yù)處理后、氯仿和異戊醇混合液提取、異丙醇沉淀、乙醇洗滌、RNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR檢測等步驟，Trizol LS 試劑可以較好去除了血中多糖、粘蛋白等雜質(zhì)，RNA降解較少，氯仿和異戊醇混合液有效解決了 Trizol LS強酸條件下三氯甲烷易乳化現(xiàn)象，實現(xiàn)了對血漿中RNA進行高質(zhì)量、高含量提取，對IncRNA的質(zhì)量進行熒光定量RT-PCR檢測，同時可以檢驗總RNA(即cDNA)質(zhì)量的參考Ct值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1為實施例1的兩個血漿/血清標本中的RMRP擴增曲線圖；
[0022]圖2為實施例1的兩個血漿/血清標本中的RMRP解鏈曲線圖。
【具體實施方式】
[0023]實施例1
[0024]一種檢測血漿中IncRNA的方法，步驟如下:
[0025]1.全血EDTA抗凝后，室溫下3000rpm離心10分鐘，取上層血漿300 μ I轉(zhuǎn)移到第一無RNase離心管中，加入Trizol LS試劑900 μ 1，漩渦振蕩10s，室溫靜置5分鐘；4°C下，12000rpm離心10鐘，樣品分為兩層，上層為粉紅色均質(zhì)化液體，下層是顏色更深的粘稠狀雜質(zhì)層，將上層液體(約ΙΟΟΟμΙ)轉(zhuǎn)移到第二無RNase離心管中，丟棄沉淀，以去除多糖和粘蛋白等雜質(zhì)；
[0026]2.第二無RNase離心管中加入0.2ml三氯甲烷，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘后，4°C下，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相(寧少勿濫原則，一般可取到400 μ I)移入第三無RNase離心管中；
[0027]3.第三無RNase離心管中加入與上層水相等體積的異丙醇，混勻，4°C條件下靜置20分鐘后，4°C下12000rpm離心10分鐘，棄上清得沉淀；
[0028]4.在沉淀中加入質(zhì)量分數(shù)為75%的乙醇Iml (-20度預(yù)冷)，顛倒數(shù)次洗滌，4°C下12000rpm離心5分鐘,棄上清,再用75%乙醇重復(fù)洗漆一次,4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清；再次4°C下12000rpm離心I分鐘，可見管壁殘余液體匯集于管底，用100 μ I移液器緩慢吸除殘余液體后，見一針尖大小半透明白色RNA沉淀，室溫條件下干燥I分鐘，加10 μ I無RNase水溶解，反復(fù)吹打，得到RNA提取液，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> [0029]5.用 GoScript 逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription, RT)試劑盒(購于美國 Promega公司)對RNA提取液進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA溶液，置-20°C保存?zhèn)溆?；具體操作依該試劑盒說明書進行:在0.5ml離心管中加入9.5 μ I RNA提取液、ΙμL Oligo Primers> I μ IRandom Primers>I μ I PCR Nucleotide Mix>2 μ I MgC12>I μ I Reverse Transcriptase、4 μ I Reaction Buffer 和 0.5μ1 Ribonuclease Inhibitor ;然后在 25 °C 保溫 5 分鐘，42°C I小時，再在70°C保溫15分鐘，加入80 μ I無RNase水，就得到cDNA溶液；
[0030]6.用GoTaq? qPCR Master Mix檢測試劑盒(購于美國Promega公司)對上步的cDNA溶液進行熒光定量PCR(儀器購于美國Stratagene公司)，擴增的上、下游引物為RMRP特異性擴增引物，具體操作依檢測試劑盒和熒光定量PCR儀說明書進行:在薄壁透明熒光定量PCR反應(yīng)管中分別加入上、下游RMRP特異性擴增引物各I μ 1，12.5 μ I GoTaq?:qPCR Master Mix, 5.5 μ I 無 RNase 水和 5 μ I cDNA ；PCR 反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 5 分鐘；然后94°C變性15秒，55°C退火30秒，70°C延伸30秒，共45個循環(huán)；解鏈曲線分析:95°C I分鐘，55°C 30秒；然 后緩慢升溫至95°C，升溫速率為0.2°C /秒。最后得到如附圖1所示的RMRP擴增曲線和如附圖2所示的RMRP解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為27.94和31.38，從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的RMRP均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。
[0031]實施例2
[0032]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟9中，擴增的上下游引物由AA174084特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中AA174084表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為34.21和34.91 ;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的AA174084均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。
[0033]實施例3[0034]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟9中，擴增的上下游引物由BM709340特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中BM709340表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為27.87和30.46 ;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的BM709340均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。
[0035]實施例4
[0036]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟9中，擴增的上下游引物由LINC001520特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中LINC00152表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為29.43和26.15 ;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的LINC00152均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。
[0037]實施例5
[0038]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在步驟9中，擴增的上下游引物由GAPDH特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中GAPDH表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為29.93和26.15 ;從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的GAPDH均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。本例樣本cDNA的CteAPDH值≤32, RNA (即cDNA)質(zhì)量合格。
[0039]實施例6
[0040]利用同一個體血漿標本中IncRNA和GAPDH的Ct值，就可根據(jù)公式Λ Ct =CtincENA-CtGAPDH計算出該IncRNA的Δ Ct值,根據(jù)Δ Ct值的大小就可判斷該IncRNA的相對表達水平；Λ Ct值小者，其對應(yīng)IncRNA的表達水平高；而Λ Ct值大者，其對應(yīng)IncRNA的表達水平低。
[0041]實施例7
[0042]與實施例1方法基本相同，所不同的只是在第二離心管中發(fā)生乳化，采取補救操作，即:將白色乳化層轉(zhuǎn)移到一新無RNase離心管中，再加入Trizol LS補足至lml，混勻后并入第三離心管中，擴增的上下游引物由GAPDH特異性擴增引物代替RMRP特異性擴增引物，檢測得到血漿中GAPDH表達水平的擴增曲線和解鏈曲線，從擴增曲線可以得到所檢測的二個血漿標本的Ct值分別為29.17和30.84。從GAPDH的Ct值可以看出上述乳化補救操作并不影響RNA質(zhì)量和產(chǎn)率。從解鏈曲線中可以了解到該曲線為較窄的單一峰，可以看出每個血漿標本的GAPDH均被特異性擴增，沒有引物二聚體和雜帶的干擾。本例樣本cDNA的CteAPDH值≤32，RNA (即cDNA)質(zhì)量合格。
[0043]上述實施例中 RMRP、AA174084、BM709340 和 LINC001520 也可以用其它 IncRNA 特異性擴增引物代替，在此不一一列舉；本發(fā)明建立了檢測血漿或血清中IncRNA水平的方法，為研究IncRNA功能提 供了依據(jù)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法，其特征在于步驟如下: 0.取血漿300 μ I置于第一離心管中，加入Trizol LS試劑900 μ 1，漩渦振蕩10s，室溫靜置5分鐘，4°C下，12000rpm離心10鐘，將上層液體轉(zhuǎn)移到第二離心管中； 2).在第二離心管中加入0.2ml三氯甲烷/異戊醇混合液，所述三氯甲烷/異戊醇混合液中三氯甲烷:異戊醇體積比為24:2，漩渦振蕩10秒，室溫下靜置5分鐘后，4°C下12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相移入第三離心管中； 3).在第三離心管中加入與該上層水相等體積的異丙醇，混勻后，4°C條件下靜置20分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘，棄上清得沉淀； 4).在上述沉淀中加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇1ml，顛倒洗滌，4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清，再用質(zhì)量百分濃度75%的乙醇重復(fù)顛倒洗滌一次，4°C下12000rpm離心5分鐘，棄上清，再在4°C下12000rpm離心I分鐘，用移液器緩慢吸盡離心管中的液體，得到白色RNA沉淀，室溫條件下干燥I分鐘，加10 μ I無RNase水溶解，反復(fù)吹打，得到RNA提取液，_80°C保存?zhèn)溆茫? 5).用GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對上述RNA提取液進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到cDNA溶液，置-20°C保存?zhèn)溆?，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)具體操作依該試劑盒說明書進行； 6).用GoTaq?qPCRMaster Mix檢測試劑盒對上述cDNA溶液進行熒光定量PCR檢測，得到擴增曲線和解鏈曲線，PC R擴增的上、下游弓丨物分別為RMRP特異性擴增引物、AA174084特異性擴增引物、BM709340特異性擴增引物、LINCOO152特異性擴增引物或GAPDH特異性擴增引物，PCR具體操作依檢測試劑盒和熒光定量PCR儀說明書進行。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法，其特征在于所述的RMRP特異性擴增引物的核苷酸序列為ACTCCAAAGT CCGCCAAGA和TGCGTAACTA GAGGGAGCTGAC ； AA174084特異性擴增引物的核苷酸序列為CTGGTTCTTC ATCCCTGCTA TG和CCTGCTCCTCTTTGTGTTCT CT ； BM709340特異性擴增引物的核苷酸序列為TGGATGCTTA CAAAGGACTG G和CTGCAATTACGGAAAGAGCT G ； LINC00152特異性擴增引物的核苷酸序列為CTCCAGCACC TCTACCTGTT G和GGACAAGGGATTAAGACACA CA ； GAPDH特異性擴增引物的核苷酸序列為ACCCACTCCT CCACCTTTGA C和TGTTGCTGTAGCCAAATTCG TT。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測血漿中長鏈非編碼RNA的方法，其特征在于在第二離心管中再吸取乳化層置于第四離心管中，在第四離心管中加入Trizol LS補足至1ml，混勻后并入第三離心管中。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966311SQ201410075943
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】郭俊明, 邵永富, 肖丙秀 申請人:寧波大學(xué)