Wdr63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方法，通過細胞培養(yǎng)、染色質免疫沉淀反應及數據分析、質粒構建與病毒轉染、蛋白質印跡分析、細胞增殖能力測定、堿性磷酸酶和茜素紅染色、裸鼠皮下進行細胞回植；發(fā)現WDR63基因在間充質干細胞骨向/牙向分化過程中的調控作用，以及在促進牙組織再生中的作用。本發(fā)明采用涉及組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化對間充質干細胞的基因活化和功能的調節(jié)作用、WDR63基因在間充質干細胞骨向/牙向分化過程中的調控作用、涉及WDR63基因在促進牙組織再生中的作用，得到WDR63可能在根尖牙乳頭干細胞成骨分化中起促進作用。
【專利說明】WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控 方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，尤其涉及一種WDR63基因在間充質干細胞骨向和 牙向分化過程中的調控方法。

【背景技術】
[0002] 牙病是人類最常見的疾病之一，而牙齒的缺失極大的影響了人們的健康和生活質 量?，F有的義齒修復手段雖已成熟，但由于其不具備生物活性，難以與天然牙齒相媲美，無 法實現人類擁有"第三副牙"的愿景。為此，各國試圖利用干細胞和組織工程技術來實現牙 齒的重建。如何研制出一種具有生物學活性與功能并且能夠在頜骨中重建牙周關系的牙齒 修復缺失牙，是臨床牙科醫(yī)生和科研工作者共同期望解決的重大課題。隨著口腔發(fā)育生物 學以及組織工程技術的進展，牙齒再生研究各個層面的工作均已展開，而全牙組織工程的 最佳策略是采用自體細胞，將牙齒及其周圍組織（包括牙齒、牙周膜、牙槽骨等）同時進行 構建，然后植入頜骨缺損區(qū)，以獲得具有一定活力的牙齒。在牙再生研究領域中，干細胞是 其重要的組成部分，干細胞是一類未分化的細胞，具有自我復制能力及向多分化潛能。目前 主要用于牙齒組織工程的牙源性干細胞有成人牙髓干細胞、乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細 胞、根尖乳頭干細胞、牙囊細胞。其中根尖牙乳頭干細胞（SCAP)存在于牙齒根尖孔的牙乳 頭組織中，具有多向分化潛能，在體外可以誘導分化為成牙本質細胞、脂肪細胞及軟骨細胞 等，在體內可以形成牙髓-牙本質復合體樣結構，SCAP在根部牙本質形成過程中發(fā)揮重要 作用，是一種較好的牙齒組織工程種子細胞，可用于牙髓牙本質和生物學牙根的再生，具有 良好且廣闊的臨床應用前景。同時牙髓中存在牙髓干細胞（DPSC)，牙髓干細胞能再生出牙 髓牙本質樣復合體，其中的礦化基質與其中的牙本質小管及包含血管的纖維組織按照正 常人體的牙髓-牙本質復合體層次排列。并且細胞具有顯著自我更新能力和多方向分化能 力，能在體內異位形成牙本質，還可分化成脂肪樣細胞和神經樣細胞。2003年Miura等首次 發(fā)現并報道了從人的脫落乳牙中分離到的一種具有多分化潛能的干細胞。并將該干細胞命 名為乳牙牙髓干細胞（SHED)。這類細胞同樣具有高度增殖能力、一定的多向分化潛能和自 我更新能力等生物學特性，可以向成牙本質細胞、成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等方向分 化。牙周膜干細胞是來源于牙周膜的成體干細胞，能產生不同種類的具有特定表型和功能 的成熟細胞，能夠維持牙周膜功能的穩(wěn)定，發(fā)揮生理性細胞更新和修復組織損傷的作用，牙 周膜干細胞不僅能分化為成牙骨質細胞樣細胞和成骨細胞樣細胞，形成牙骨質樣和骨樣組 織；而且還可分化為成纖維樣細胞，形成類似天然牙周膜樣的結締組織，能形成組織形態(tài)、 空間排列上類似于天然牙周膜牙骨質復合體的結構，提示這是一種可用于牙再生醫(yī)學的有 效骨再生的自體干細胞。牙囊是包繞成釉器周圍的疏松結締組織，起源于外胚間充質，在牙 齒萌出過程中發(fā)揮著重要的作用。牙根形成時期，牙周組織（如牙骨質、牙周膜和牙槽骨） 由牙囊前體細胞形成，牙囊干細胞可以分化為成骨細胞、成牙骨質細胞、脂肪細胞。在找到 可能的種子細胞之后，間充質干細胞定向分化的分子機制仍不清楚，這也限制了間充質干 細胞的潛在應用。
[0003] 在干細胞分化過程中建立特殊的基因表達模式可以詳盡描述控制其過程的大量 基因的表達與沉默。組蛋白共價修飾在調節(jié)染色質動力及功能方面起重要作用。甲基化， 一種組蛋白的修飾類型，同時發(fā)生在賴氨酸和精氨酸殘基上。這種類型的組蛋白修飾涉及 各種生物進程，以及轉錄調節(jié)。目前，干細胞分化過程中與基因表達模式緊密聯(lián)系的組蛋白 修飾的圖譜，仍未被廣泛的研究。目前，一種體內組蛋白修飾的基因組作圖的技術方法正 發(fā)展起來，使得研究者關于組蛋白修飾的分布可以遵循一個廣泛觀點。這種方法是"CHIP on chip"，基于染色質免疫沉淀試驗，利用感興趣的基因組區(qū)域相一致的探針通過基因芯 片雜交識別富DNA片段。
[0004] 最近，研究者發(fā)現三甲基化H3K4與間充質干細胞的基因活化和功能有關，尤其是 骨向分化。研究的目的是通過使用CHIP-on-chip的方法研究間充質干細胞骨向分化過程 中基因啟動子區(qū)域三甲基化H3K4修飾對基因組的改變。在的研究中，通過比較分化與未分 化根尖牙乳頭干細胞（SCAP)基因啟動子區(qū)域三甲基化H3K4圖譜，來研究三甲基化H3K4在 根尖牙乳頭干細胞骨向分化潛能中的功能。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明實施例的目的在于提供一種WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化 過程中的調控方法，旨在解決現有技術沒有涉及TOR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分 化過程中調控的問題。
[0006] 本發(fā)明實施例是這樣實現的，一種WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過 程中的調控方法，該WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方法包括：
[0007] 步驟一，細胞培養(yǎng)，智齒在用75%酒精消毒后再用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，分離和培 養(yǎng)鑒定根尖牙乳頭干細胞；
[0008] 步驟二，染色質免疫沉淀反應及數據分析，細胞于1 %甲醛溶液中孵育15分鐘， 2X 106個細胞以及抗組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化抗體用于此染色質免疫沉淀反應， 所有產生的沉淀DNA樣本采用實時定量per進行量化，數據表示為DNA的百分比；
[0009] 步驟三，質粒構建與病毒轉染，標準方法進行質粒的構建，設計TOR63的SiRNA，將 其插入慢病毒的shRNA載體上，測序鑒定，最終構建成WDR63shRNA的質粒；設計WDR63基因 全長的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全長將其連接到逆轉錄病毒的表達載體上，測 序鑒定，最終構建成質粒；然后進行病毒包裝、收集，病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰 箱；病毒轉染，對根尖牙乳頭干細胞進行電鍍過夜，然后感染逆轉錄病毒或慢的聚凝胺達 6個小時，48小時后，用不同的抗生素篩選被轉染的細胞；
[0010] 步驟四，蛋白質印跡分析，RIPA裂解液溶解細胞，樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠 分離并利用半干轉移膜裝置轉移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5%脫水牛奶放置2h， 然后用一抗孵育一夜；免疫復合物與兔或小鼠免疫球蛋白G抗體一同孵育并用化學發(fā)光底 物試劑使其可視化；針對WDR63是抗WDR63多克隆抗體；
[0011] 步驟五，細胞增殖能力測定，根尖牙乳頭干細胞密1.0X104個細胞密度鋪板于 60nm培養(yǎng)皿；并在細胞培養(yǎng)3、5、7天進行計數，細胞計數采用自動細胞計數儀并在細胞懸 液中加入臺盼藍排除死細胞；進行3個獨立實驗取平均值；
[0012] 步驟六，堿性磷酸酶和茜素紅染色，礦化誘導液誘導根尖牙乳頭干細胞，堿性磷酸 酶活性檢測根據堿性磷酸酶活性檢測試劑盒說明進行分析，為檢測礦化能力，細胞誘導2-3 周后，用70%乙醇固定，2%茜素紅染色；定量測定鈣離子濃度，用10%的氯化十六烷吡啶 溶于磷酸鈉在室溫下使茜素紅退色30分鐘；鈣離子濃度是通過測量562nm的吸光度決定， 并用標準曲線換算；
[0013] 步驟七，裸鼠皮下進行細胞回植，將4. OX 106個細胞與40毫克的羥基磷灰石/磷 酸三鈣陶瓷顆粒混合，然后移植到5只10周齡裸鼠背部皮下，在每一個裸鼠，空白根尖牙乳 頭干細胞移植到左側背表面皮下，而WDR63根尖牙乳頭細胞移植到右側背表面皮下；依照 動物協(xié)議批準規(guī)范進行；移植后第八周，獲取移植細胞用10%福爾馬林固定，10% EDTA脫 鈣，pH值8. 0,石蠟包埋，HE染色，定性測量組織礦化量。
[0014] 進一步，步驟一的具體方法：輕輕剝離根尖牙乳頭組織，用磷酸鹽緩沖鹽水反復清 洗，剪碎，置于含I型膠原酶3g/L和分散酶4g/L的消化液，37°C下消化1小時，過70 i! m細 胞篩收集細胞，l〇〇〇rpm離心lOmin，用培養(yǎng)液重新懸浮成單細胞懸液；將細胞接種于25cm2 細胞培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)基含15%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 y g/ml 鏈霉素中37°C、5% C02培養(yǎng)，每2?3天換液1次；每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀 況；當細胞生長至80%匯合狀態(tài)時，用0. 25%胰蛋白酶按1 : 2消化傳代；2-4代的干細胞 被用于之后的實驗。
[0015] 進一步，在步驟二中，信號必須標準化以進行對比實驗；L0WESS程序被用來衡量 不同染色質免疫沉淀反應數組之間的可變性，為了確定組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化， 不同條件下的根尖牙乳頭干細胞存在差異甲基化，因此定義2倍變化為組蛋白3第4位賴 氨酸的三甲基化顯著變化的閾值；同樣，假定值閾值〇. 05也用來區(qū)分基因改變；雙通道圖 像數據比使用L0WESS方法規(guī)范化，并假定值計算是使用相同的方法實現的表達分析。
[0016] 進一步，在步驟三中，shRNA的目標序列為：
[0017] WDR63shRNA:5， -AAACCCAGGGCTGCCTTGGAAAAG-3，。
[0018] 進一步，該TOR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方法中 WDR63增強其堿性磷酸酶活性及礦化能力，WDR63能夠激活兩個關鍵轉錄因子0SX和RUNX2 的表達；WDR63是成骨分化的一個關鍵的增強劑；WDR63促進體外細胞增殖能力支持WDR63 具有增強組織再生的潛能；WDR63啟動子的組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化能夠增強根 尖牙乳頭干細胞的成骨分化潛能。
[0019] 本發(fā)明實施例提供的WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控 方法，通過一系列試驗發(fā)現WDR63基因在間充質干細胞骨向/牙向分化過程中的調控作用， 以及在促進牙組織再生中的作用。本發(fā)明采用涉及組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化對間 充質干細胞的基因活化和功能的調節(jié)作用、WDR63基因在間充質干細胞骨向/牙向分化過 程中的調控作用、涉及WDR63基因在促進牙組織再生中的作用，得到WDR63可能在根尖牙乳 頭干細胞成骨分化中起促進作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是本發(fā)明實施例提供的成骨培養(yǎng)在WDR63，TREX1，F0X024，ARNT這些啟動子中 促進組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化，誘導WDR63及ARNTL表達；并且在F0XP4, TMEM106B 這些啟動子中抑制組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化，抑制F0XP4表達示意圖；
[0021] 圖2是本發(fā)明實施例提供的WDR63的過表達增強根尖牙乳頭干細胞的骨向分化能 力示意圖；
[0022] 圖3是本發(fā)明實施例提供的WDR63的過表達增加體內礦化組織形成量示意圖；
[0023] 圖4是本發(fā)明實施例提供的WDR63的低表達可抑制根尖牙乳頭干細胞增殖和骨向 分化能力示意圖；
[0024] 圖5是本發(fā)明實施例提供的WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的 調控方法流程圖。

【具體實施方式】
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0026] 如圖5所示，本發(fā)明實施例的WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中 的調控方法包括以下步驟：
[0027] S501 :細胞培養(yǎng)，智齒在用75%酒精消毒后再用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，分離和培 養(yǎng)鑒定根尖牙乳頭干細胞；
[0028] S502:染色質免疫沉淀反應及數據分析，細胞于1 %甲醒溶液中孵育15分鐘， 2X 106個細胞以及抗組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化抗體用于此染色質免疫沉淀反應， 所有產生的沉淀DNA樣本采用實時定量per進行量化，數據表示為DNA的百分比；
[0029] S503:設計WDR63的SiRNA，將其插入慢病毒的shRNA載體上，測序鑒定，最終構 建成WDR63shRNA的質粒；設計WDR63基因全長的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全 長將其連接到逆轉錄病毒的表達載體上，測序鑒定，最終構建成質粒；
[0030] S504 :然后進行病毒包裝、收集，病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰箱；病毒轉 染，對根尖牙乳頭干細胞進行電鍍過夜，然后感染逆轉錄病毒或慢的聚凝胺達6個小時，48 小時后，用不同的抗生素篩選被轉染的細胞；
[0031] S505 :RIPA裂解液溶解細胞，樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠分離并利用半干轉 移膜裝置轉移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5%脫水牛奶放置2h，然后用一抗孵育一 夜；免疫復合物與兔或小鼠免疫球蛋白G抗體一同孵育并用化學發(fā)光底物試劑使其可視 化；
[0032] S506:細胞增殖能力測定，根尖牙乳頭干細胞密1.OX104個細胞密度鋪板于60nm 培養(yǎng)皿；并在細胞培養(yǎng)3、5、7天進行計數，細胞計數采用自動細胞計數儀并在細胞懸液中 加入臺盼藍排除死細胞；進行3個獨立實驗取其平均值；
[0033] S507:礦化誘導液誘導根尖牙乳頭干細胞，堿性磷酸酶活性檢測根據堿性磷酸酶 活性檢測試劑盒說明進行分析，細胞誘導2-3周后，用70%乙醇固定，2%茜素紅染色；定量 測定鈣離子濃度，用10%的氯化十六烷吡啶溶于磷酸鈉在室溫下使茜素紅退色30分鐘；鈣 離子濃度是通過測量562nm的吸光度決定，并用標準曲線換算；
[0034] S508:將4.OX106個細胞與40毫克的羥基磷灰石/磷酸三鈣陶瓷顆?；旌?，然 后將其移植到5只10周齡裸鼠背部皮下，在每一個裸鼠，空白根尖牙乳頭干細胞移植到左 側背表面皮下，而WDR63根尖牙乳頭細胞移植到右側背表面皮下；這些程序依照動物協(xié)議 批準規(guī)范進行；移植后第八周，獲取移植細胞用10%福爾馬林固定，10% EDTA脫鈣（pH值 8. 0)，石蠟包埋，HE染色，定性測量組織礦化量。
[0035] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明；
[0036] 一、細胞培養(yǎng)
[0037] 本發(fā)明所涉及的所有干細胞均遵守人類胚胎干細胞研究的行為指南，人體組織 的利用得到首都醫(yī)科大學倫理委員會的批準，志愿者均知情同意術前簽訂知情同意書；智 齒在用75%酒精消毒后再用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，分離和培養(yǎng)鑒定根尖牙乳頭干細胞，簡 述如下：輕輕剝離根尖牙乳頭組織，用磷酸鹽緩沖鹽水反復清洗，剪碎，置于含I型膠原酶 (3g/L)和分散酶（4g/L)的消化液，37°C下消化1小時，過70iim細胞篩收集細胞，lOOOrpm 離心lOmin，用培養(yǎng)液重新懸浮成單細胞懸液；將細胞接種于25cm 2細胞培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng) 基（含15%胎牛血清、2111111〇1/1谷氨酰胺、10(^/1111青霉素和10011 §/1111鏈霉素）中371：、 5% C02培養(yǎng)，每2?3天換液1次；每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況；當細胞生長至 80%匯合狀態(tài)時，用0. 25%胰蛋白酶按1 : 2消化傳代；2-4代的干細胞被用于之后的實 驗；
[0038] 二、染色質免疫沉淀反應及數據分析：
[0039] 染色質免疫沉淀反應按照制造商的產品說明進行并使用人類啟動子1. OR陣列分 析；細胞于1 %甲醛溶液中孵育15分鐘，2X 106個細胞以及抗組蛋白3第4位賴氨酸的三 甲基化抗體用于此染色質免疫沉淀反應，所有產生的沉淀DNA樣本采用實時定量per進行 量化，數據表示為DNA的百分比；引物如補充表1所示；由于實驗和技術變化，信號必須標 準化以進行適當的對比實驗；L0WESS程序被用來衡量不同染色質免疫沉淀反應數組之間 的可變性，為了確定組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化，不同條件下的根尖牙乳頭干細胞存 在差異甲基化，因此定義2倍變化為組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化顯著變化的閾值；同 樣，假定值閾值〇. 05也用來區(qū)分基因改變；簡略的，雙通道圖像數據比使用L0WESS方法規(guī) 范化，并假定值計算是使用相同的方法實現的表達分析；
[0040] 三、質粒構建與病毒轉染：
[0041] 標準方法進行質粒的構建；所有結構都通過適當的限制消化和/或測序加以 驗證；設計WDR63的SiRNA，將其插入慢病毒的shRNA載體上，測序鑒定，最終構建成 WDR63shRNA的質粒；設計WDR63基因全長的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全長將 其連接到逆轉錄病毒的表達載體上，測序鑒定，最終構建成質粒；然后進行病毒包裝、收集， 病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰箱；病毒轉染，對根尖牙乳頭干細胞進行電鍍過夜， 然后感染逆轉錄病毒或慢的聚凝胺達6個小時，48小時后，用不同的抗生素篩選被轉染的 細胞；
[0042] shRNA的目標序列為：
[0043] WDR63shRNA:5， -AAACCCAGGGCTGCCTTGGAAAAG-3，；
[0044] 四、蛋白質印跡分析：
[0045] RIPA裂解液溶解細胞，樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠分離并利用半干轉移膜 裝置轉移到聚乙二烯二氟化物（PVDF)中，膜上涂抹5%脫水牛奶放置2h，然后用一抗孵育 一夜；免疫復合物與兔或小鼠免疫球蛋白G抗體一同孵育并用化學發(fā)光底物試劑使其可視 化；主要針對WDR63是抗WDR63多克隆抗體；
[0046] 五、細胞增殖能力測定：
[0047] 根尖牙乳頭干細胞密1. OX 104個細胞密度鋪板于60nm培養(yǎng)皿；并在細胞培養(yǎng)3、 5、7天進行計數，細胞計數采用自動細胞計數儀并在細胞懸液中加入臺盼藍排除死細胞； 進行3個獨立實驗取其平均值；
[0048] 六、堿性磷酸酶和茜素紅染色：
[0049] 礦化誘導液誘導根尖牙乳頭干細胞，堿性磷酸酶活性檢測根據堿性磷酸酶活性檢 測試劑盒說明進行分析，為檢測其礦化能力，細胞誘導2-3周后，用70%乙醇固定，2%茜素 紅染色；定量測定鈣離子濃度，用10%的氯化十六烷吡啶溶于磷酸鈉在室溫下使茜素紅退 色30分鐘；鈣離子濃度是通過測量562nm的吸光度決定，并用標準曲線換算；
[0050] 七、裸鼠皮下進行細胞回植：
[0051] 本發(fā)明通過首都醫(yī)科大學北京口腔醫(yī)院動物關懷和使用委員會允許；將約 4. 0 X 106個細胞與40毫克的羥基磷灰石/磷酸三鈣陶瓷顆?；旌希缓蟀聪惹八鰧⑵湟?植到5只10周齡裸鼠背部皮下，在每一個裸鼠，空白根尖牙乳頭干細胞移植到左側背表面 皮下，而WDR63根尖牙乳頭細胞移植到右側背表面皮下；這些程序依照動物協(xié)議批準規(guī)范 進行；移植后第八周，獲取移植細胞用10%福爾馬林固定，10% EDTA脫鈣（pH值8.0)，石蠟 包埋，HE染色，定性測量組織礦化量；
[0052] 八、實驗結果：
[0053] 使用染色質免疫沉淀反應生成基因啟動子區(qū)域組蛋白修飾基因圖譜：
[0054] 試圖檢測根尖牙乳頭干細胞成骨分化時啟動子區(qū)域分布的組蛋白3第4位賴氨 酸的三甲基化的全基因組基因；分別用成骨培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)根尖牙乳頭干細胞7 天，使用抗組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化抗體與差異標記的濃縮芯片共雜交進行染色 質免疫沉淀反應；染色質免疫沉淀反應數據顯示，在成骨誘導后基因啟動子富含三甲基化 的組蛋白3第4位賴氨酸；此外，在比較未分化和分化根尖牙乳頭干細胞基因啟動子區(qū)域三 甲基化的組蛋白3第4位賴氨酸基因圖譜發(fā)現，119個基因啟動子展現出在三甲基化的組 蛋白3第4位賴氨酸大于兩倍的增長，21個基因啟動子展現出在三甲基化的組蛋白3第4 位賴氨酸大于兩倍的降低；為了證實染色質免疫沉淀反應實驗數據，WDR63，TREX1，F0X024， ARNTL，F0XP4, TMEM106B這些基因驗證芯片分析；結果表明相對于普通培養(yǎng)基，成骨誘導時 在WDR63, TREX1，F0X024, ARNTL這些啟動子中三甲基化的組蛋白3第4位賴氨酸顯著增 力口，而在F0XP4，TMEM106B這些啟動子中三甲基化的組蛋白3第4位賴氨酸顯著降低（圖片 la-f);另外，實時定量PCR結果顯示在根尖牙乳頭干細胞分化過程中，WDR63，ARNTL呈現大 于兩倍的高表達，而F0XP4則為地表達（圖片lg-i);然而TREX1，F0X024，TMEM106B在分化 與未分化根尖牙乳頭干細胞中的表達無明顯差異；總的來說，這些數據讓推測WDR63可能 在根尖牙乳頭干細胞成骨分化中起促進作用；
[0055] WDR63過表達增強根尖牙乳頭干細胞的成骨分化潛能
[0056] 進一步證實WDR63在根尖牙乳頭干細胞中的功能，將WDR63序列插入一個逆轉錄 病毒載體；這種構造通過逆轉錄病毒感染結合到根尖牙乳頭干細胞時過量表達WDR63 ;也 通過蛋白質印跡實驗驗證WDR63的過量表達（圖片2a);接下來，結合后的根尖牙乳頭干細 胞進行成骨誘導以檢測其成骨分化潛能，結果表明，WDR63的過度表達增加了堿性磷酸酶活 性（圖片2b);因此，通過茜素紅染色和鈣離子定量測量，過量表達WDR63的根尖牙乳頭干 細胞相對于空白載體的根尖牙乳頭干細胞其礦化能力增強（圖片2c-d);實時定量PCR結 果也顯示，在過量表達WDR63的根尖牙乳頭干細胞誘導的第7天和第14天，骨涎蛋白的表 達顯著增高（圖片2e);接下來，檢測了調節(jié)成骨分化的關鍵轉錄因子的表達，包括RUNX2 和OSX ;RUNX2和OSX的RNA水平顯著增高在過量表達WDR63的根尖牙乳頭干細胞中相對 于空白載體的根尖牙乳頭干細胞（圖片2f-g);接下來，研究是否添加WDR63會影響根尖牙 乳頭干細胞在體內的骨生成；SCA空載根尖牙乳頭干細胞和載WDR63根尖牙乳頭干細胞移 植到裸鼠皮下；在移植后第8周，HE染色顯示，在獲取的載WDR63根尖牙乳頭干細胞移植體 中有更多的骨樣礦化組織相比空白組（圖片3a);定性測量礦化組織顯示骨樣礦化組織量 在載WDR63根尖牙乳頭干細胞移植體中要高于空白組（圖片3b);因此，體內移植實驗表明 載WDR63根尖牙乳頭干細胞產生更多的骨樣礦化組織相比空載根尖牙乳頭干細胞；綜上所 述，這些結果表明，WDR63表達大大觸發(fā)的根尖牙乳頭干細胞成骨分化；
[0057] WDR63的減少抑制根尖牙乳頭干細胞的骨向分化
[0058] 為了進一步闡明WDR63在根尖牙乳頭干細胞中的功能，設計了一個短發(fā)卡RNA目 標在于抑制WDR63表達式并將其通過慢病毒轉染引入根尖牙乳頭干細胞；選擇后，用免疫 印跡分析檢測減低的效能（圖片4a);接下來，檢測是否WDR63在本質上影響了根尖牙乳頭 干細胞的成骨能力；根尖牙乳頭干細胞在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現抑制WDR63的根尖牙乳 頭干細胞其堿性磷酸酶活性顯著低于空白根尖牙乳頭干細胞（圖片4b);成骨誘導后通過 茜素紅染色和鈣離子定量測量，抑制WDR63的根尖牙乳頭干細胞相對于空白根尖牙乳頭干 細胞其礦化能力明顯降低（圖片4c-d);此外，在細胞培養(yǎng)7天后進行細胞增殖能力檢測 顯示，抑制WDR63的根尖牙乳頭干細胞相對于空白根尖牙乳頭干細胞其增殖能力明顯降低 (圖片4e);
[0059] 九、結論
[0060] TOR63是一種未知功能的WD重復蛋白，研究在根尖牙乳頭干細胞分化過程中 WDR63的功能，發(fā)現在根尖牙乳頭干細胞體內外分化過程中，WDR63增強其堿性磷酸酶活性 及礦化能力，這表明WDR63可能是控制間充質干細胞成骨分化潛能的一個關鍵因素；間充 質干細胞向成骨細胞系分化要求其他細胞系分化間的協(xié)調與抑制，多個轉錄因子的激活與 間充質干細胞分化有關，兩個關鍵的轉錄因子，RUNX2和0SX是成骨分化所必需的；研究結 果表明，WDR63能夠激活兩個關鍵轉錄因子0SX和RUNX2的表達；接下來，檢測了骨涎蛋白 的mRNA水平，其為骨基質的主要結構蛋白；研究結果顯示，WDR63誘導骨涎蛋白基因的表 達；這些結果表明WDR63是成骨分化的一個關鍵的增強劑；此外，細胞生長曲線表明抑制 WDR63會抑制根尖牙乳頭干細胞的增殖；間充質干細胞的生長、增殖和生存能力的體外檢 測能夠準確預測體內間充質干細胞功能；這些發(fā)現顯著表明增強間充質干細胞的生長，增 殖，生存能力可能提高他們的血管和組織再生潛力；在目前的研究中，研究結果對于WDR63 促進體外細胞增殖能力支持WDR63具有增強組織再生的潛能；
[0061] 總之，結果代表著國際性觀點即三甲基化的組蛋白3第4位賴氨酸的修飾與根尖 牙乳頭干細胞骨向分化的功能性聯(lián)系，并表明通過改變三甲基化的組蛋白3第4位賴氨酸 控制基因激活和沉默對間充質干細胞的成骨分化至關重要；還發(fā)現了一個關鍵的成骨分化 增強劑-WDR63, WDR63啟動子的組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化能夠增強根尖牙乳頭干 細胞的成骨分化潛能。
[0062] 補充圖表1 :進行染色質免疫沉淀反應實時定量PCR的引物
[0063]

【權利要求】
1. 一種WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方法，其特征在于， 該WDR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方法包括： 步驟一，細胞培養(yǎng)，智齒在用75%酒精消毒后再用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，分離和培養(yǎng)鑒 定根尖牙乳頭干細胞； 步驟二，染色質免疫沉淀反應及數據分析，細胞于1 %甲醛溶液中孵育15分鐘，2 X 106個細胞以及抗組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化抗體用于此染色質免疫沉淀反應，所有產 生的沉淀DNA樣本采用實時定量per進行量化，數據表示為DNA的百分比； 步驟三，質粒構建與病毒轉染，標準方法進行質粒的構建，設計TOR63的SiRNA，將其插 入慢病毒的shRNA載體上，測序鑒定，最終構建成WDR63shRNA的質粒；設計WDR63基因全 長的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全長將其連接到逆轉錄病毒的表達載體上，測 序鑒定，最終構建成質粒；然后進行病毒包裝、收集，病毒滴度鑒定，分裝后保存在-80度冰 箱；病毒轉染，對根尖牙乳頭干細胞進行電鍍過夜，然后感染逆轉錄病毒或慢的聚凝胺達6 個小時,48小時后，用不同的抗生素篩選被轉染的細胞； 步驟四，蛋白質印跡分析，RIPA裂解液溶解細胞，樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠分離 并利用半干轉移膜裝置轉移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5 %脫水牛奶放置2h，然后 用一抗孵育一夜；免疫復合物與兔或小鼠免疫球蛋白G抗體一同孵育并用化學發(fā)光底物試 劑使其可視化；針對WDR63是抗WDR63多克隆抗體； 步驟五，細胞增殖能力測定，根尖牙乳頭干細胞密1. 0 X 104個細胞密度鋪板于60nm培 養(yǎng)皿；并在細胞培養(yǎng)3、5、7天進行計數，細胞計數采用自動細胞計數儀并在細胞懸液中加 入臺盼藍排除死細胞；進行3個獨立實驗取平均值； 步驟六，堿性磷酸酶和茜素紅染色，礦化誘導液誘導根尖牙乳頭干細胞，堿性磷酸酶活 性檢測根據堿性磷酸酶活性檢測試劑盒說明進行分析，為檢測礦化能力，細胞誘導2-3周 后，用70%乙醇固定，2%茜素紅染色；定量測定鈣離子濃度，用10%的氯化十六烷吡啶溶 于磷酸鈉在室溫下使茜素紅退色30分鐘；鈣離子濃度是通過測量562nm的吸光度決定，并 用標準曲線換算； 步驟七，裸鼠皮下進行細胞回植，將4. 0 X 106個細胞與40毫克的羥基磷灰石/磷酸三 鈣陶瓷顆?；旌希缓笠浦驳?只10周齡裸鼠背部皮下，在每一個裸鼠，空白根尖牙乳頭干 細胞移植到左側背表面皮下，而WDR63根尖牙乳頭細胞移植到右側背表面皮下；依照動物 協(xié)議批準規(guī)范進行；移植后第八周，獲取移植細胞用10%福爾馬林固定，10% EDTA脫鈣，pH 值8. 0,石蠟包埋，HE染色，定性測量組織礦化量。
2. 如權利要求1所述的TOR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方 法，其特征在于，步驟一的具體方法：輕輕剝離根尖牙乳頭組織，用磷酸鹽緩沖鹽水反復清 洗，剪碎，置于含I型膠原酶3g/L和分散酶4g/L的消化液，37°C下消化1小時，過70 y m細 胞篩收集細胞，l〇〇〇rpm離心lOmin，用培養(yǎng)液重新懸浮成單細胞懸液；將細胞接種于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)基含15%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 y g/ml 鏈霉素中37°C、5% C02培養(yǎng)，每2?3天換液1次；每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀 況；當細胞生長至80%匯合狀態(tài)時，用0. 25%胰蛋白酶按1 : 2消化傳代；2-4代的干細胞 被用于之后的實驗。
3. 如權利要求1所述的TOR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方 法，其特征在于，在步驟二中，信號必須標準化以進行對比實驗；LOWESS程序被用來衡量不 同染色質免疫沉淀反應數組之間的可變性，為了確定組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化，不 同條件下的根尖牙乳頭干細胞存在差異甲基化，因此定義2倍變化為組蛋白3第4位賴氨 酸的三甲基化顯著變化的閾值；同樣，假定值閾值〇. 05也用來區(qū)分基因改變；雙通道圖像 數據比使用LOWESS方法規(guī)范化，并假定值計算是使用相同的方法實現的表達分析。
4. 如權利要求1所述的TOR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方 法，其特征在于，在步驟三中，shRNA的目標序列為： WDR63shRNA:5, -AAACCCAGGGCTGCCTTGGAAAAG-3,。
5. 如權利要求1所述的TOR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方 法，其特征在于，該TOR63基因在間充質干細胞骨向和牙向分化過程中的調控方法中WDR63 增強其堿性磷酸酶活性及礦化能力，WDR63能夠激活兩個關鍵轉錄因子0SX和RUNX2的表 達；WDR63是成骨分化的一個關鍵的增強劑；WDR63促進體外細胞增殖能力支持WDR63具有 增強組織再生的潛能；WDR63啟動子的組蛋白3第4位賴氨酸的三甲基化能夠增強根尖牙 乳頭干細胞的成骨分化潛能。
【文檔編號】C12N15/867GK104450621SQ201410550443
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權日:2014年9月30日
【發(fā)明者】范志朋, 刁樹, 楊東梅, 王松靈 申請人:首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院