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CemGPDH基因及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:490770閱讀:389來源:國知局
CemGPDH基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種CemGPDH基因及其在提高細(xì)胞脂肪酸含量方面的用途,所述CemGPDH基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。該基因來源于橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea),編碼甘油-3-磷酸脫氫酶。甘油-3-磷酸脫氫酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDH)催化合成的甘油-3-磷酸(Glycerol-3-phosphate,G3P)是合成三酰甘油(TAG)的重要原料,該酶參與了線粒體G3P穿梭,為呼吸鏈提供電子,是G3P合成的關(guān)鍵酶,也是連接糖代謝和脂代謝的關(guān)鍵酶之一,對植物體內(nèi)油脂合成和能量代謝有重要作用。利用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和微藻細(xì)胞能顯著提高細(xì)胞的總脂肪酸含量。
【專利說明】CemGPDH基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甘油-3-磯酸脫氨酶基因GPDH及其應(yīng)用。具體地,涉及該基因序 列的獲得和酵母表達(dá)載體的構(gòu)建,W及其顯著提高酵母脂肪酸含量方面的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前,隨著傳統(tǒng)能源的過度消耗和日益增長的能源需求,能源問題日益嚴(yán)峻,可替 代能源的研究和開發(fā)成為全球?qū)W者關(guān)注的熱點。生物柴油主要W大豆、麻瘋樹等油料作物、 廢棄的廚余油脂、動物性脂肪W(wǎng)及基因工程改造過的微藻作為原材料加工成液體燃料,是 可W替代傳統(tǒng)石油燃料的優(yōu)質(zhì)新型可再生能源。而微藻由于含油量高,易于培養(yǎng),單位±地 油脂產(chǎn)量遠(yuǎn)高于其他油料作物,被認(rèn)為是最有潛力的能源資源之一。
[0003] 微藻繁殖能力強,對生長環(huán)境要求低,易于培養(yǎng),光合作用效率高,含油量高,但目 前微藻油脂代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的研究還相對較少小球藻(化Iorella)是微藻中 的一類,屬于綠藻口小球藻屬,是光合自養(yǎng)型球形單細(xì)胞綠藻,直徑大約3-8微米。小球藻 繁殖能力很強,含有豐富的營養(yǎng)元素,例如蛋白質(zhì)、油脂、多不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、 食物纖維、核酸及葉綠素等,還含有多種生物活性物質(zhì),例如糖蛋白、多糖。小球藻是少數(shù)幾 個可用于大規(guī)模培養(yǎng)的微藻。
[0004] 真核生物(例如小球藻)中,油脂的主要儲存形式是H醜甘油(TAG),由甘 油-3-磯酸(G3巧和脂醜輔酶A為前體合成。甘油-3-磯酸脫氨酶(Glycero^3-phosphate dehy化Ogenase,GPD巧催化糖酵解過程中產(chǎn)生的磯酸二輕丙麗(Dihy^oxyacetone phosphate, DHAP)與G3P之間的相互轉(zhuǎn)變,產(chǎn)物G3P是合成TAG的重要原料,因此,GPDH是 連接糖代謝和脂代謝的關(guān)鍵酶。
[0005] G3P是由甘油磯酸化而來,在植物中,淀粉通常作為光合作用的終產(chǎn)物被儲存起 來,甘油的主要來源是通過將淀粉分解的葡萄糖送入糖酵解過程,將糖酵解中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 為甘油。而在微藻中,有些種類的微藻在積累淀粉的同時會產(chǎn)生大量的甘油,作為光合作 用的終產(chǎn)物儲存起來W。因此,在微藻中,主要有兩條不同的甘油合成途徑,其一是利用光 合作用直接合成甘油,另一條是通過分解儲藏物質(zhì),將淀粉及藏糖分解成為6-磯酸果糖, 后轉(zhuǎn)變?yōu)镈HAP,再由甘油-3-磯酸脫氨酶催化,生成G3P,最后通過去磯酸化作用生成甘油 。從微藻GPDH在油脂合成代謝中的位置上來看,GPDH所催化的由DHAP轉(zhuǎn)變?yōu)镚3P的 反應(yīng)是甘油合成途徑的關(guān)鍵步驟,GPDH參與了線粒體G3P穿梭,為呼吸鏈提供電子,是G3P 合成的關(guān)鍵酶之一,而G3P是TAG和磯脂合成的重要原料,并且GPDH連接了糖代謝和脂代 謝,對植物體內(nèi)油脂合成和能量代謝有重要作用。
[0006] 根據(jù)GPDH在細(xì)胞內(nèi)位置不同,將其分為S種類型同工酶一細(xì)胞質(zhì)型 GPDH(CtGPDH),葉綠體型GPDH (cpGPDH)和線粒體型GPDH (mGPDH)。每種同工酶在細(xì)胞內(nèi)偏 好催化DHAP與G3P之間相互轉(zhuǎn)變的正反應(yīng)或逆反應(yīng),輔酶類型不同(W FAD或NADH/NADPH 作為輔酶),受不同條件誘導(dǎo)表達(dá)(滲透脅迫、熱激、油酸脅迫等),并且在不同物種中目前 已發(fā)現(xiàn)的GPDH同工酶數(shù)量不同?。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將來源于楠圓小球藻的CemGP畑基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母INVSCl后,可顯著 提高其主要脂肪酸組分的含量。在INVScI主要的四種脂肪酸組分中,蹤擱酸(C16:0)和 硬脂酸佑18:0)含量變化不顯著,蹤擱油酸((:16:1)提高了15.57%,油酸((:18:1)提高了 13. 53%。酵母細(xì)胞總脂肪酸的含量也提高了約10.07%。已有物種GPDH基因的研究基本 都選擇了酵母GPDH突變體來對其進(jìn)行互補功能驗證,甚少有用野生型酵母的。本發(fā)明選擇 野生型酵母在對楠圓小球藻GPDH基因進(jìn)行功能驗證的同時還發(fā)現(xiàn)了其對油脂合成的顯著 作用。在酵母中研究表明,CemGPDH基因轉(zhuǎn)酵母株與對照組(轉(zhuǎn)空載)相比,總脂肪酸含量 提高了約10. 07%,且其部分主要脂肪酸組分的含量也有明顯提高,其中蹤擱酸(C16:0)和 硬脂酸佑18:0)含量變化不顯著,蹤擱油酸((:16:1)提高了15.57%,油酸((:18:1)提高了 13. 53%。酵母細(xì)胞總脂肪酸的含量也提高了約10. 07%。單個基因使得總脂肪酸及各不同 脂肪酸的含量達(dá)到該種程度的實屬少見。
[0008] 本發(fā)明提供了一個GPDH基因,其CDNA核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示,該個基因 來源于楠圓小球藻,該基因CDNA全長為1857bp。
[0009] 本發(fā)明還提供了含本發(fā)明所述基因(CemGPDH)的酵母表達(dá)載體。
[0010] 本發(fā)明在一個方面提供了包含本發(fā)明所述基因的酵母、植物或藻類,其選自酵 母,藻類,擬南芥、煙草、油菜、向日葵、大豆、當(dāng)麻、棉花、橄攬、和紅花等。優(yōu)選地,所述藻 類選自小球藻。更具體地,所述酵母選自釀酒酵母,小球藻選自楠圓小球藻(化Iorella ellipsoidea)。
[0011] 本發(fā)明提供的楠圓小球藻GPDH基因,可應(yīng)用于利用基因工程方法提高酵母、植物 或藻類油脂等方面。
[0012] 更具體地,本發(fā)明提供W下各項:
[001引 1. CemGPDH蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014] 2.編碼根據(jù)1所述的CemGPDH蛋白的基因。
[0015] 3.根據(jù)2所述的基因,其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0016] 4.載體,其包含根據(jù)2或3所述的基因,所述載體可W通過將根據(jù)2或3所述的基 因轉(zhuǎn)入到 PYES2. 0(可購自 Invitrogen 公司),pBIN19、地I121、pBI221(可購自 Clontech), pCambial300(可購自 Gambia 公司)或 pGreen(可購自 the John Innes Centre)中來制 備。
[0017] 5.宿主細(xì)胞,其包含根據(jù)1所述的CemGPDH蛋白、根據(jù)2或3所述的基因或根據(jù)4 所述的載體。
[0018] 6. -種制備具有高蹤擱油酸和/或油酸含量,或具有高總脂肪酸含量的酵母、植 物或藻類的細(xì)胞的方法,所述方法包括將根據(jù)2或3所述的基因或根據(jù)4所述的載體轉(zhuǎn)入 所述酵母、植物或藻類的細(xì)胞中,所述酵母優(yōu)選是釀酒酵母,更優(yōu)選是尿嚼巧缺陷型釀酒酵 母INVSCl ;所述藻類優(yōu)選是小球藻,更優(yōu)選是楠圓小球藻煙ilorella ellipsoidea);所述 植物優(yōu)選選自擬南芥、煙草、油菜、向日葵、大豆、番茄、當(dāng)麻、棉花、芝麻或花生。
[0019] 7.根據(jù)1所述的CemGPDH蛋白、根據(jù)2或3所述的基因或根據(jù)4所述的載體在 制備具有高總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的細(xì)胞中的用途,所述酵母優(yōu)選是釀酒酵母, 更優(yōu)選是尿嚼巧缺陷型釀酒酵母INVSCl ;所述藻類優(yōu)選是小球藻,更優(yōu)選是楠圓小球藻 煙ilorella ellipsoidea);所述植物優(yōu)選選自擬南芥、煙草、油菜、向日葵、大豆、番茄、當(dāng) 麻、棉花、芝麻或花生,所述具有高總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的細(xì)胞優(yōu)選是具有高 蹤擱油酸和/或油酸含量的酵母、植物或藻類的細(xì)胞。
[0020] 8.根據(jù)1所述的CemGPDH蛋白、根據(jù)2或3所述的基因或根據(jù)4所述的載體在提 高酵母、植物或藻類的細(xì)胞中蹤擱油酸和/或油酸含量,或總脂肪酸含量中的用途,所述酵 母優(yōu)選是釀酒酵母,更優(yōu)選是尿嚼巧缺陷型釀酒酵母INVSCl ;所述藻類優(yōu)選是小球藻,更 優(yōu)選是楠圓小球藻煙ilorella ellipsoidea);所述植物優(yōu)選選自擬南芥、煙草、油菜、向日 葵、大豆、番茄、當(dāng)麻、棉花、芝麻或花生。
[0021] 9.利用根據(jù)6所述的方法制備的具有高蹤擱油酸和/或油酸含量,或具有高總脂 肪酸含量的酵母、植物或藻類的細(xì)胞。
[0022] 10.根據(jù)9所述的酵母、植物或藻類的細(xì)胞在生產(chǎn)生物柴油中的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1.含楠圓小球藻CemGPDH基因的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0024] 圖2. GC-MS法測定的酵母各脂肪酸組分含量W及總脂肪酸含量(CK為對照, pYES-GPDH為轉(zhuǎn)CemGPDH基因的酵母脂肪酸測定)。

【具體實施方式】
[0025] 下面參考實施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W理解的是, 下述實施例是舉例說明的目的,其不應(yīng)W任何方式解釋為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù) 范圍由后附的所限定。
[0026] 實施例1.楠圓小球藻CemGPDH基因CDNA全長的獲得
[0027] 取培養(yǎng)3-4天的對數(shù)生長期楠圓小球藻(來自于中國科學(xué)院水生生物研究所)藻 液,離也收集藻體后置于液氮中充分研磨。參照艾德萊EASYspin RNA提取試劑盒說明書及 Takara面ase I說明書進(jìn)行總RNA提取和純化。W帶POlyT的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 并進(jìn)行RT-PCR (具體操作見TOYOBO ReverTra Ace- a試劑盒)。
[002引 cDNA的合成反應(yīng)條件如下:
[0029]

【權(quán)利要求】
1. CemGPDH蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2. 編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的CemGPDH蛋白的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因,其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
4. 載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因。
5. 宿主細(xì)胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的CemGPDH蛋白、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的 基因或根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體。
6. -種制備具有高棕櫚油酸和/或油酸含量,或具有高總脂肪酸含量的酵母、植物 或藻類的細(xì)胞的方法,所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因或根據(jù)權(quán)利要求4 所述的載體轉(zhuǎn)入所述酵母、植物或藻類的細(xì)胞中,所述酵母優(yōu)選是釀酒酵母,更優(yōu)選是尿 嘧啶缺陷型釀酒酵母INVSC1 ;所述藻類優(yōu)選是小球藻,更優(yōu)選是橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea);所述植物優(yōu)選選自擬南芥、煙草、油菜、向日葵、大豆、番爺、菌麻、棉花、芝麻 或花生。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CemGPDH蛋白、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因或根據(jù)權(quán)利 要求4所述的載體在制備具有高總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的細(xì)胞中的用途,所述 酵母優(yōu)選是釀酒酵母,更優(yōu)選是尿嘧啶缺陷型釀酒酵母INVSC1 ;所述藻類優(yōu)選是小球藻, 更優(yōu)選是橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea);所述植物優(yōu)選選自擬南芥、煙草、油菜、向 日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生,所述具有高總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的 細(xì)胞優(yōu)選是具有高棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸和/或油酸含量的酵母、植物或藻類的細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CemGPDH蛋白、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因或根據(jù)權(quán)利 要求4所述的載體在提高酵母、植物或藻類的細(xì)胞中棕櫚油酸和/或油酸含量,或總脂肪酸 含量中的用途,所述酵母優(yōu)選是釀酒酵母,更優(yōu)選是尿嘧啶缺陷型釀酒酵母INVSC1 ;所述 藻類優(yōu)選是小球藻,更優(yōu)選是橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea);所述植物優(yōu)選選自擬 南芥、煙草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生。
9. 利用根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法制備的具有高棕櫚油酸和/或油酸含量,或具有高 總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的酵母、植物或藻類的細(xì)胞在生產(chǎn)生物柴油中的用途。
【文檔編號】C12N1/13GK104357415SQ201410547380
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】胡贊民, 張丹, 李帥, 范成明, 陳宇紅 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
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