一種操縱子bacABC拷貝數(shù)倍增和敲除recA基因的地衣芽孢桿菌及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種操縱子 bacABC 拷貝數(shù)倍增和敲除 recA 基因的地衣芽孢桿菌DW2△ recA / bacABCs ，該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO：M2014251，保藏日期為2014年6月12日。該菌株的基因組同時(shí)具有操縱子 bacABC 拷貝數(shù)倍增和敲除 recA 基因雙重特性，并且，該菌株操縱子 bacABC 拷貝數(shù)倍增和敲除 recA 基因的地衣芽孢桿菌應(yīng)用于桿菌肽生產(chǎn)中，可使桿菌肽產(chǎn)量提高11.5%。
CCTCC NO：M2011344
2011.10.12

CCTCC NO：M2014251
2014.06.12
【專利說明】—種操縱子1330八80拷貝數(shù)倍增和敲除「60八基因的地衣芽孢桿菌及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001〕 本發(fā)明涉及一種操縱子鏡貝數(shù)倍增和敲除基因的地衣芽孢桿菌工程菌株。

【背景技術(shù)】
[0002]桿菌肽為淡黃色或類白色粉末，無嗅，味苦，是由10種氨基酸、12個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽類抗生素，可有效抑制革蘭氏陽性病原菌和部分革蘭氏陰性菌。桿菌肽擁有在腸道內(nèi)幾乎不吸收，排泄迅速，體內(nèi)不殘留等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛添加于飼料中。
[0003]目前，桿菌肽主要生產(chǎn)菌株為地衣芽孢桿菌1101261118)和枯草芽孢桿菌{83(3111118，其通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。
[0004]桿菌肽是通過硫模板機(jī)理縮合氨基酸而成的，而操縱子…^為編碼桿菌肽合成過程中三個(gè)關(guān)鍵酶的基因。理論上來說，操縱子&^編碼的肽合成酶的增多將有利于桿菌肽的合成，根據(jù)中心法則，即0嫩的信息通過轉(zhuǎn)錄和翻譯最終表現(xiàn)在蛋白質(zhì)上，增加操縱子在菌體的拷貝數(shù)，從而提高的表達(dá)。但是，由于操縱子基因序列過長，約42吐，故無法構(gòu)建含有如此大基因片段的質(zhì)粒表達(dá)載體，也就無法以構(gòu)建游離型或整合型質(zhì)粒表達(dá)載體的方式來實(shí)現(xiàn)操縱子&拷貝數(shù)的倍增，因此，操縱子&^…^的拷貝數(shù)增加變得極為困難。另外，基因?yàn)榫幋a細(xì)菌0嫩重組蛋白的基因，染色體上存在的同源序列在細(xì)菌0嫩重組蛋白的作用下會(huì)進(jìn)行交換重組，對(duì)菌株保持拷貝數(shù)的穩(wěn)定性不利。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種能夠高產(chǎn)桿菌肽的地衣芽孢桿菌及其構(gòu)建方法，此地衣芽孢桿菌的基因組同時(shí)具有操縱子如拷貝數(shù)倍增和敲除基因的雙重特性。
一種操縱子八80拷貝數(shù)倍增和敲除一基因的地衣芽孢桿菌，所述菌株為地衣芽抱桿菌1)^0/1808 (簡稱為徹。1111)8 1101161111~01~11118 012 [/ 6^0/1808),該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)⑶了⑶勵(lì):12014251，保藏日期為2014年6月12日。此菌株的基因組同時(shí)具有操縱子如拷貝數(shù)倍增和敲除基因雙重特性，生產(chǎn)桿菌肽的能力強(qiáng)。
[0006]一種操縱子如拷貝數(shù)倍增和敲除基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
(1)質(zhì)粒12(2) -01-！經(jīng)過限制性0嫩內(nèi)切酶I取8應(yīng)!I /雙酶切得到線性的丁2
(2)-01^1質(zhì)粒，并回收線性12 (2)-01^1質(zhì)粒；
(2)以地衣芽孢桿菌012的基因組0嫩為模板，分別擴(kuò)增出淀粉酶終止子、啟動(dòng)子和如上、下游同源臂基因片段，同時(shí)，以載體？冊(cè)300為模板擴(kuò)增出四環(huán)素抗性基因片段，并回收淀粉酶終止子、啟動(dòng)子、四環(huán)素抗性和&^…^上、下游同源臂5個(gè)基因片段； (3)將這5個(gè)基因片段融合，得到融合0嫩片段，具體操作為:以上游同源臂和淀粉酶終止子為模板，通過8064(? (即重疊延伸？00得到第一融合片段，同時(shí)，以1^八80下游同源臂和啟動(dòng)子為模板，通過8064(?得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四環(huán)素抗性基因片段為模板，通過806-9(?得到融合0嫩片段，融合0嫩片段的正確排列順序?yàn)槿鐏V說'上游同源臂一淀粉酶終止子一四環(huán)素抗性基因一啟動(dòng)子一如乂說'下游同源臂；
(4)采用限制性0嫩內(nèi)切酶I和及麗71對(duì)融合0嫩片段進(jìn)行雙酶切，得到酶切后的融合片段；
(5)將酶切后的融合片段與步驟(1)得到的線性！'2(2)-04質(zhì)粒連接，得到整合質(zhì)粒！'2 (2)-04-如466?，將整合質(zhì)粒！'2 (2)-01-1-如466?通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入地衣芽孢桿菌012中，以卡那霉素抗性作為篩選標(biāo)記，篩選得到具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子再經(jīng)過451和卡那霉素抗性雙重篩選，篩選到整合菌株，經(jīng)卩⑶驗(yàn)證，得到具有正確排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正確排列序列為:啟動(dòng)子一如乂沒廣開放閱讀框(簡稱:
1)30/1800^)-1)30/180終止子一如乂沒廣上游同源臂一淀粉酶終止子一四環(huán)素抗性基因一啟動(dòng)子一“。胤下游同源臂；
(6)采用四環(huán)素濃度梯度升高的培養(yǎng)基對(duì)整合菌株進(jìn)行如的誘導(dǎo)倍增，得到^30拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株；
(7)質(zhì)粒12(2)-04經(jīng)過限制性0嫩內(nèi)切酶5^ I和5^ I雙酶切得到線性的丁2(2)-01^1質(zhì)粒，并回收線性12 (2)-01^1質(zhì)粒；
(8)以地衣芽孢桿菌012的基因組0嫩為模板，？⑶擴(kuò)增出作4同源臂，作4同源臂經(jīng)過限制性0嫩內(nèi)切酶5^ I和5^ I雙酶切，并將酶切后的作4同源臂與步驟(7)得到的線性！'2 (2)-01^1質(zhì)粒連接，得到敲除質(zhì)粒12 (2)-01^1-/^4:
(9)將質(zhì)粒12(2)-04-作4通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入步驟(6)得到的如乂說'拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株中，經(jīng)卡那霉素篩選得到具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子再經(jīng)451和卡那霉素抗性雙重篩選，驗(yàn)證得到作4基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢桿菌
012 ^ 1-00^ /1)30^808 0
[0007]本發(fā)明的有益技術(shù)效果為:
(1)本發(fā)明的整合質(zhì)粒并不含有操縱子如〃的開放閱讀框，即并不能僅僅通過將整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株內(nèi)實(shí)現(xiàn)操縱子如的倍增，但是，本發(fā)明的整合質(zhì)粒中含有啟動(dòng)子基因片段，本發(fā)明通過將此含有啟動(dòng)子基因片段的整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株內(nèi)，以啟動(dòng)子基因片段為同源區(qū)域，利用菌株本身的同源重組交換功能，成功得到了&閱讀框倍增(即操縱子如'拷貝數(shù)倍增)的地衣芽孢桿菌菌株；
(2)本發(fā)明的融合0嫩片段中還含有四環(huán)素抗性基因片段，此四環(huán)素抗性基因片段同啟動(dòng)子一起整合進(jìn)入菌株的基因組內(nèi)，隨著1^八80開放閱讀框的倍增而倍增，這為1^八80拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株的篩選提供了有利的條件；
(3)本發(fā)明的采用質(zhì)粒12(2)-04作為載體，由于質(zhì)粒12 (2)-04含有一個(gè)溫敏型復(fù)制子，在371時(shí)質(zhì)粒可正常復(fù)制，451質(zhì)粒無法進(jìn)行復(fù)制，故，它也為如拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株以及地衣芽孢桿菌012 1X1-60^/^0^808的篩選提供了有利的條件；
(4)在對(duì)淀粉酶終止子、啟動(dòng)子、四環(huán)素抗性和如上、下游同源臂5個(gè)基因片段進(jìn)行整合時(shí)，本 申請(qǐng)人:將這5個(gè)基因片段同時(shí)進(jìn)行806？0？時(shí)，反復(fù)多次均得不到所需排列順序的融合0嫩片段，為了克服此問題，本 申請(qǐng)人:經(jīng)過無數(shù)次試驗(yàn)，最終確定采用分段整合(即上游同源臂與淀粉酶終止子相連，下游同源臂與啟動(dòng)子相連，得到的兩個(gè)片段再與四環(huán)素基因片段相連)的方式，最終成功得到了所需排列順序的融合0嫩片段；
(5)在菌株基因組中的如4沒⑶即后僅插入如'上游同源臂一四環(huán)素基因——啟動(dòng)子一如下游同源臂基因片段時(shí)，由于所獲得的如拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株基因組中如乂及刀即與下一個(gè)如乂及:0即相距過于接近，會(huì)破壞1^八80終止子區(qū)，從而對(duì)菌株的操縱子如4說'造成結(jié)構(gòu)上的影響，為了克服此問題，本 申請(qǐng)人:在構(gòu)建整合？⑶片段時(shí)，加入了淀粉酶終止子基因片段；
(6)與現(xiàn)有技術(shù)中的地衣芽孢桿菌012相比，本發(fā)明的菌株使菌體桿菌肽效價(jià)提高了11.5%。
[0008]進(jìn)一步的，為了提高上述步驟(3)中融合0嫩片段的成功率，上述步驟(3)的中融合0嫩片段對(duì)應(yīng)的806？0？體系的反應(yīng)條件均為:
15111111 ；
2)第1階段融合:
變性:951 3086。，退火:501 3086。，延伸:721 6086。，循環(huán)8次；再延伸:725111111 ；
3)第2階段融合:
變性:951 3086。，退火:551 3086。，延伸:721 90 860 循環(huán)30次；再延伸:721 5111111 ；
4)終止:10151111110
[0009]本發(fā)明的融合0嫩片段對(duì)應(yīng)的806？0？體系分2個(gè)階段進(jìn)行融合，且，第1、2階段融合對(duì)應(yīng)的退火溫度分別為50、551，避免了淀粉酶終止子、啟動(dòng)子、四環(huán)素抗性和如上、下游同源臂5個(gè)基因片段在整合時(shí)，由于各個(gè)基因片段長短不一、所需退火溫度不同，造成融合0嫩片段成功率低的問題。
[0010]本發(fā)明的操縱子1^八80拷貝數(shù)倍增和敲除“基因的地衣芽孢桿菌的應(yīng)用，其應(yīng)用于桿菌肽生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為質(zhì)粒12 (2)-0^1的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，圖1中的1^11為卡那霉素抗性基因，^ I取8應(yīng)!11分別為限制性0嫩內(nèi)切酶I取細(xì)III的酶切位點(diǎn)；
圖2為整合質(zhì)粒12 (2)的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，圖2中的[為如'上游同源臂，八1117七6:0111的1:01'為淀粉酶終止子，161:抗性基因?yàn)樗沫h(huán)素抗性基因片段，1380^80 ？1~011101:61'為啟動(dòng)子，1351(^801？為如'下游同源臂，1(5111為卡那霉素抗性基因；
圖3為！'敲除質(zhì)粒12 (2) -0^1-1-60/1的結(jié)構(gòu)示意圖,其中，圖3中的為！'
同源臂，1(811為卡那霉素抗性基因，5口6 I和5^ I分別為限制性0嫩內(nèi)切酶分6 I和5^I的酶切位點(diǎn)；
圖4為酬—?:3的實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定結(jié)果圖； 圖5為現(xiàn)有技術(shù)中的地衣芽孢桿菌012與本發(fā)明的地衣芽孢桿菌012的桿菌肽效價(jià)對(duì)比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0012]一種操縱子1^八80拷貝數(shù)倍增和敲除作4基因的地衣芽孢桿菌，所述菌株為地衣芽抱桿菌 012 八/'￠4/ 1)30/1808 (簡稱為:^3(^7705 1101161111~01~11118 012 ^ 1-60/1/—想:8 \該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)勵(lì):12014251，保藏日期為2014年6月12日。此菌株的基因組同時(shí)具有操縱子如拷貝數(shù)倍增和敲除基因雙重特性，生產(chǎn)桿菌肽的能力強(qiáng)。
[0013]一種操縱子1^八80拷貝數(shù)倍增和敲除“基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
(1)質(zhì)粒12 (2)-01-1 (其結(jié)構(gòu)示意圖，如圖1所示)經(jīng)過限制性0嫩內(nèi)切酶I和 /雙酶切得到線性的12 (2)-04質(zhì)粒，并回收線性12 (2)-04質(zhì)粒。
[0014](2)以地衣芽孢桿菌012的基因組0嫩為模板，分別擴(kuò)增出淀粉酶終止子、啟動(dòng)子和如上、下游同源臂基因片段，同時(shí)，以載體？冊(cè)300為模板擴(kuò)增出四環(huán)素抗性基因片段，并回收淀粉酶終止子、啟動(dòng)子、四環(huán)素抗性和^^…^上、下游同源臂5個(gè)基因片段；
其中，如上游同源臂的擴(kuò)增引物為:
上游引物(口?-？ ): 06066^X00^6^1X6^00660^6，
下游引物⑶?-806-10:
01010160101101^1011^66^1600611116110 ；
淀粉酶終止子的擴(kuò)增引物為:
上游引物(八！117-806-？):
6八織編哪?:八丁IX！'丁處八！'艦“ ?:“八6，
下游引物(八1117-806-10:
10^10600110110166^10^000606^1^00610 ；
四環(huán)素抗性基因片段的擴(kuò)增引物為:
上游引物(了6七-806-？):
6^0661^106066616^100^6^6^6606^1116^,
下游引物(了61^-806-10:
啟動(dòng)子的擴(kuò)增引物為:
上游引物(1^510-806-17):
6^1001111111^1^0^660^00166^01^16^6^,
下游引物(1^510-806-10:
0^^660^00016^^61101^10^1100011106 ；
如下游同源臂的擴(kuò)增引物為:
上游引物(00顆-806-5):
06^666^16^1^6^011110^666160011116,
下游引物(00顆-1？): 01^6101^0010^60^16601116^1。
[0015]所述的的擴(kuò)增體系均為:
811 打 61~: 5111 ；^1？: 2.5111: 0.591；引物 1: 1口1；弓丨物 2:
1“；0嫩:仏。水:14^匕引物1和引物2為分別對(duì)應(yīng)為待擴(kuò)增基因片段的上、下游引物。
[0016]所述的的擴(kuò)增條件均為:
15111111
2)^^:9513086。，退火:55。0 3086。，延伸:72。0 60 860 循環(huán)30次
3)再延伸:7215111111
4)終止:10151111110
[0017](3)將這5個(gè)基因片段融合，得到融合0嫩片段，具體操作為:以上游同源臂和淀粉酶終止子為模板，通過8064(? (即重疊延伸？00得到第一融合片段，同時(shí)，以如下游同源臂和啟動(dòng)子為模板，通過8064(?得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四環(huán)素抗性基因片段為模板，通過806-？0？得到融合0嫩片段，融合0嫩片段的正確排列順序?yàn)?如^…^上游同源臂一淀粉酶終止子一四環(huán)素抗性基因一啟動(dòng)子一如4及^下游同源臂；
其中，第一融合片段的擴(kuò)增引物為:
詘-？: 06066^X00^6^1X6^00660^6，
八III又一806—尺:
10^10600110110166^10^000606^1^00610 ；
第二融合片段的擴(kuò)增引物為:
？1380~806~？:
00顆-1？: 01^6101^0010^60^16601116^1 ；
融合0嫩片段的擴(kuò)增引物為:
詘-？: 06066^X00^6^1X6^00660^6，
00顆-1？: 01^6101^0010^60^16601116^1。
[0018]所述的第一、二融合片段對(duì)應(yīng)的806？^？的擴(kuò)增條件均為:
15111111 ；
2)^^:9513086。，退火:50。0 3086。，延伸:72。0 60860 循環(huán)8次；
3)再延伸:7215111111 ；
4)終止:10151111110
[0019]所述的融合0嫩片段對(duì)應(yīng)的806？0？的擴(kuò)增條件為:
15111111 ；
2)第1階段融合:
變性:951 3086。，退火:501 3086。，延伸:721 6086。，循環(huán)8次；再延伸:725111111 ；
3)第2階段融合: 變性:951 3086。，退火:551 3086。，延伸:721 90 860 循環(huán)30次；再延伸:721 5111111 ；
4)終止:101 51111110
[0020](4)采用限制性0嫩內(nèi)切酶I和及麗71對(duì)融合0嫩片段進(jìn)行雙酶切，得到酶切后的融合片段；
其中，X如I取8遞III雙酶切體系為:
加 1:3^11
3311111 I:3 9 1
10X1: 6 卩 I
0嫩片段或質(zhì)粒:0嫩片段40 0 I或者質(zhì)粒20 0 I
水:補(bǔ)水至總體積60 0 I ；
I取細(xì)III雙酶切條件為:371，8小時(shí)尬3 I和及麗71均為限制性0嫩內(nèi)切酶，10X1 1x1打61~為配套的限制性內(nèi)切酶緩沖液。尬3 I和及麗71以及10X1 1x1打61'均購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0021](5)將酶切后的融合片段與步驟(1)得到的線性12 (2)-04質(zhì)粒連接，得到整合質(zhì)粒12 (2) -01-1-^^6? (其結(jié)構(gòu)示意圖，如圖2所示)，將整合質(zhì)粒12 (2)-01-1-^808通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入地衣芽孢桿菌012中，以卡那霉素抗性作為篩選標(biāo)記，篩選得到具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子再經(jīng)過451和卡那霉素抗性雙重篩選，篩選到整合菌株，經(jīng)驗(yàn)證，得到具有正確排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正確排列序列為:啟動(dòng)子一如4說' 開放閱讀框(簡稱一如4說'終止子一如4說'上游同源臂一淀粉酶終止子一四環(huán)素抗性基因一啟動(dòng)子一&^下游同源臂；此步驟中所涉及到的酶切后融合片段與線性！'2 (2)-04質(zhì)粒的連接、整合質(zhì)粒！'2 (2)-04-如466?轉(zhuǎn)入地衣芽孢桿菌012、卡那霉素篩選的【具體實(shí)施方式】均為本領(lǐng)域的公知常識(shí)，在此不做贅述。
[0022]45和卡那霉素抗性雙重篩的具體操作為:
1)將實(shí)施例2所得菌株012(12 (2)混合接種于501液體⑶培養(yǎng)基中，451振蕩培養(yǎng)12卜，再轉(zhuǎn)接與51111液體18培養(yǎng)基中，451振蕩培養(yǎng)12卜；取上述菌液進(jìn)行稀釋，然后涂布與固體⑶平板上，371培養(yǎng)16匕使其長出單菌落；
2)將上述單菌落用無菌牙簽挑起，分別點(diǎn)種到卡納霉素抗性平板和⑶平板上的對(duì)應(yīng)位置，371培養(yǎng)1611 ；
3)挑取在18平板上生長，而在卡納霉素抗性平板上不生長的菌落，然后以引物:
驗(yàn)-漢:06^116110^1066^606,進(jìn)行？邙驗(yàn)證。
[0023]反應(yīng)條件為:
①預(yù)變性:95。。10111111；
②變性:95130 86。，退火:551 50 86。，延伸:721 4 111111,
30個(gè)循環(huán)；
③再延伸:72。〇10111111 ；
能擴(kuò)增出4.5^左右條帶的菌落即為大片段整合成功的菌株，即具有正確排列序列的整合菌株，命名為地衣芽孢桿菌謂
[0024](6)采用四環(huán)素濃度梯度升高的培養(yǎng)基對(duì)整合菌株進(jìn)行1^八80的誘導(dǎo)倍增，得到如'拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株。例如，如'開放閱讀框的拷貝數(shù)增加1次，所對(duì)應(yīng)的整合菌株的染色體排序?yàn)?啟動(dòng)子一6%仙⑶冊(cè)一如乂見終止子一如乂沒廣上游同源臂一淀粉酶終止子一四環(huán)素抗性基因一啟動(dòng)子一仙⑶取一仙0終止子一如乂沒廣上游同源臂一淀粉酶終止子一四環(huán)素抗性基因一啟動(dòng)子一下游同源臂；
具體步驟為:將上述整合菌株單菌落接至5此18 (含有201^/此四環(huán)素)培養(yǎng)基中，371,180 1-/111111振蕩培養(yǎng)12 11后，取100 111菌液轉(zhuǎn)接至5齓[8(含有301111四環(huán)素)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述步驟，每次轉(zhuǎn)接時(shí)增加四環(huán)素的濃度10直至四環(huán)素濃度為80時(shí)結(jié)束誘導(dǎo)倍增操作，并以誘導(dǎo)后的菌株基因組為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量？(? (簡稱驢00確定其拷貝數(shù)(如圖4所示),如拷貝數(shù)增加的菌株命名為謂2細(xì)。就3,從圖4可知，實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定的— 就拷貝數(shù)相對(duì)定量值(即)為5，而現(xiàn)有技術(shù)中的地衣芽孢桿菌012僅為1，即，相對(duì)于地衣芽孢桿菌012來說，此菌株徽的基因組中如4說'開放閱讀框的拷貝數(shù)增加了 4次。
[0025]其中，驢⑶的擴(kuò)增引物為:
8八0町-？: 00X60X^6066^6^0、
8 八 01^-1？: 1^000601X60X^000、
I 尺-町-？: 160^1^00116000^1001、
I尺-尺I'-尺:101100116010^1660610 ；
驢⑶的反應(yīng)體系為:
引物？+尺0.5 9 1、
模板0嫩1 1^ 1?
水3.5卩I ；
驢⑶反應(yīng)條件:
15111111，
2)^^:951 20 86。，退火:58。0 15 86。，延伸:72。0 30 86。，
40個(gè)循環(huán)；
驢⑶反應(yīng)中使用的I叫1111x^111-6來自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司的3181？ 821201嫩312 1?試劑盒，反應(yīng)的進(jìn)行與結(jié)果的檢測(cè)分析使用的是八81 96孔實(shí)時(shí)熒光定量？⑶儀。
[0026](7)質(zhì)粒丁2 (2) -01*1經(jīng)過限制性0應(yīng)內(nèi)切酶5口6 I和5狀I(lǐng)雙酶切得到線性的12 (2)-04質(zhì)粒，并回收線性！'2 (2)-04質(zhì)粒；其酶切體系和酶切條件均與步驟(4)相同，X如I取8應(yīng)！II也是限制性0嫩內(nèi)切酶，X如I取8應(yīng)！II均購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0027](8)以地衣芽孢桿菌012的基因組0應(yīng)為模板，擴(kuò)增出八^同源臂，八^同源臂經(jīng)過限制性0嫩內(nèi)切酶分6 I和5^ I雙酶切，并將酶切后的八同源臂與步驟(7)得到的線性12 (2)-0^1質(zhì)粒連接，得到敲除質(zhì)粒12 (2)-01-1-/-^ (其結(jié)構(gòu)示意圖，如圖3所示)；
其中，作4同源臂的擴(kuò)增引物為: 上游引物(尺6。八-？ ): 66^0X^6X0X600^X^0660X600^X01 下游引物(06(^-10:006^60X0X6X006000X60X601 ；
酶切后的同源臂與步驟(7)得到的線性！'2 (2)-01^1質(zhì)粒的具體連接步驟均為本領(lǐng)域的公知常識(shí)，在此不做贅述。
[0028](9)將質(zhì)粒12 (2) -01-1- /'通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入步驟(6)得到的如4說'拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株中，經(jīng)卡那霉素篩選，得到具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子再經(jīng)451和卡那霉素抗性雙重篩選，驗(yàn)證得到基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢桿菌012八/'地衣芽抱桿菌012八/'的染色體排序?yàn)?/'部分基因一作4同源臂一 12 (2) —1-00/1同源臂一剩余的作4部分基因(其中，12(2)指！'2
(2)-01-1- 除/'同源臂外的其余部分基因),從而致使/'基因插入失活。
[0029]其中，質(zhì)粒12 (2)-0^1-/^4轉(zhuǎn)入步驟(6)得到的如'拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株中的【具體實(shí)施方式】為本領(lǐng)域的公知常識(shí)，篩選具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，利用下述引物:
12-1:^1616^1^01066061^,
丁2-1？:60^60^60^11^060,進(jìn)行？邙擴(kuò)增驗(yàn)證。
[0030]？邙反應(yīng)條件:
1)預(yù)變性:95。。，5111111 ；
2)^^:95130 86。，退火:55。0 50 86。，延伸:72。0 45 86。，
30個(gè)循環(huán)；
3)再延伸:72。。，10―。
[0031]選取能擴(kuò)增出75恥左右條帶的菌株，命名為地衣芽孢桿菌(12
(2))[簡稱 ^3乂7?5 1101161111~01~11118 ^2/1)30/1808 (12 (2)-011-/^4)%
[0032]按照步驟(5)中451和卡那霉素抗性雙重篩的具體操作的步驟
1)4^3)中的方法進(jìn)行培養(yǎng)，挑取在⑶平板上生長，而在卡納霉素抗性平板上不生長的菌落，然后以引物:
1-60/1 驗(yàn)-？:10160661606^606,
1-60/1 驗(yàn)-1？:006^60X0X6X006000X60X601,進(jìn)行？邙驗(yàn)證。
[0033]？邙反應(yīng)條件:
1 10111111 ；
2)^^:95130 86。，退火:55。0 50 86。，延伸:72。0 45 86。，
30個(gè)循環(huán)；
3)再延伸:72。〇10 111111 ；
能擴(kuò)增出770恥左右條帶的菌落即為基因成功敲除的菌株，命名為地衣芽孢桿菌而2 八/'{830111118 110116111 ^01~11118 012 ^ 1-00^/1)30^808 ) 0
[0034]當(dāng)然，本發(fā)明的構(gòu)建方法中步驟(3)的融合0嫩片段所對(duì)應(yīng)的806？0？也可采用單段融合和單一退火溫度的方式來進(jìn)行，但是，得到正確排列序列的融合0嫩片段的時(shí)間較長，成功率較低。
[0035]本發(fā)明所涉及到的0嫩回收均采用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的？⑶產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒(樹脂型)進(jìn)行回收。
[0036]所述的地衣芽孢桿菌012(簡稱:也?^77^5 110)16111 ￡01-11118 012),該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)勵(lì):12011344，保藏日期為2011年10月12日。
[0037]本發(fā)明的操縱子拷貝數(shù)倍增和敲除“基因的地衣芽孢桿菌的應(yīng)用，其應(yīng)用于桿菌肽生產(chǎn)。
[0038]衣芽孢桿菌012 ^60^^808在桿菌肽發(fā)酵中的應(yīng)用步驟包括:八菌種活化，8搖瓶發(fā)酵。
[0039]所述步驟八菌種活化的菌種活化培養(yǎng)基配方為(8/1):酵母粉0.5%，蛋白胨1%，^01 1%，邱 7.0-7.4。
[0040]所述步驟八菌種活化的培養(yǎng)條件為從甘油管以體積百分比1%接種于裝有5“液體18培養(yǎng)基的？八瓶中，180?300卬III，37。。，10?1處。
[0041]所述步驟8搖瓶發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(8/1):豆柏100、玉米淀粉45、0^036.0、(^?) 2804 1.0。
[0042]所述步驟8發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為250此三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為20III[，將經(jīng)步驟八菌種活化后的菌液以體積百分比2%接種后180培養(yǎng)48匕。采用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液桿菌肽效價(jià)(如圖5所示),從圖5可看出，地衣芽孢桿菌012相對(duì)應(yīng)的桿菌肽效價(jià)為935[，本發(fā)明的地衣芽孢桿菌012 ^ ^60^^808對(duì)應(yīng)的桿菌肽效價(jià)為1013口，即，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的地衣芽孢桿菌012來說，本發(fā)明的地衣芽孢桿菌012 1^1-60^3^808經(jīng)發(fā)酵后的桿菌肽效價(jià)提高了 11.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種操縱子如拷貝數(shù)倍增和敲除red基因的地衣芽孢桿菌，所述菌株為地衣芽孢桿菌DW2 ArecA/如MSCs，該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO:M2014251，保藏日期為2014年6月12日。
2.—種權(quán)利要求1所述的一種操縱子如拷貝數(shù)倍增和敲除red基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟: (1)質(zhì)粒T2(2)-ori經(jīng)過限制性DNA內(nèi)切酶油a I和J雙酶切得到線性的T2(2)-ori質(zhì)粒，并回收線性T2 (2)-ori質(zhì)粒； (2)以地衣芽孢桿菌DW2的基因組DNA為模板，PCR分別擴(kuò)增出淀粉酶終止子、啟動(dòng)子和如上、下游同源臂基因片段，同時(shí)，以載體pHY300為模板擴(kuò)增出四環(huán)素抗性基因片段，并回收淀粉酶終止子、啟動(dòng)子、四環(huán)素抗性和如上、下游同源臂5個(gè)基因片段； (3)將這5個(gè)基因片段融合，得到融合DNA片段，具體操作為:以如上游同源臂和淀粉酶終止子為模板，通過soe-PCR (即重疊延伸PCR)得到第一融合片段，同時(shí)，以bacABC下游同源臂和啟動(dòng)子為模板，通過soe-PCR得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四環(huán)素抗性基因片段為模板，通過soe-PCR得到融合DNA片段，融合DNA片段的正確排列順序?yàn)槿鏜l上游同源臂一淀粉酶終止子一四環(huán)素抗性基因一啟動(dòng)子一如Ml下游同源臂； (4)采用限制性DNA內(nèi)切酶油aI取BernH I對(duì)融合DNA片段進(jìn)行雙酶切，得到酶切后的融合片段； (5)將酶切后的融合片段與步驟(1)得到的線性T2(2)-ori質(zhì)粒連接，得到整合質(zhì)粒T2 (2)-or1-如，將整合質(zhì)粒T2 (2)-or1-如通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入地衣芽孢桿菌DW2中，以卡那霉素抗性作為篩選標(biāo)記，篩選得到具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子再經(jīng)過45°C和卡那霉素抗性雙重篩選，篩選到整合菌株，經(jīng)PCR驗(yàn)證，得到具有正確排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正確排列序列為:啟動(dòng)子一如MAC開放閱讀框一如MAC終止子一如上游同源臂一淀粉酶終止子一四環(huán)素抗性基因一啟動(dòng)子一如下游同源臂； (6)采用四環(huán)素濃度梯度升高的培養(yǎng)基對(duì)整合菌株進(jìn)行如的誘導(dǎo)倍增，得到bacABC拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株； (7)質(zhì)粒T2(2)-ori經(jīng)過限制性DNA內(nèi)切酶I和fee I雙酶切得到線性的T2(2)-ori質(zhì)粒，并回收線性T2 (2)-ori質(zhì)粒； (8)以地衣芽孢桿菌DW2的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出red同源臂，red同源臂經(jīng)過限制性DNA內(nèi)切酶分e I和fee I雙酶切，并將酶切后的red同源臂與步驟(7)得到的線性T2 (2)-ori質(zhì)粒連接，得到red敲除質(zhì)粒T2 (2) ~ori~recA ； (9)將質(zhì)粒T2(2) -or1- red通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入步驟(6)得到的如d說'拷貝數(shù)擴(kuò)增的整合菌株中，經(jīng)卡那霉素篩選得到具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子再經(jīng)45°C和卡那霉素抗性雙重篩選，PCR驗(yàn)證得到red基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢桿菌DW2 Δ recA /bacABCs 0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種操縱子如拷貝數(shù)倍增和敲除red基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(3)的中融合DNA片段對(duì)應(yīng)的soePCR體系的反應(yīng)條件均為: 1)預(yù)變性:95°C5min ； 2)第I階段融合: 變性:95°C 30sec，退火:50°C 30sec，延伸:72 °C 60sec，循環(huán) 8 次；再延伸:72 °C5min ； 3)第2階段融合: 變性:95°C 30sec，退火:55°C 30sec，延伸:72°C 90 sec 循環(huán)30次；再延伸:72°C 5min ； 4)終止:10°C5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種操縱子如拷貝數(shù)倍增和敲除red基因的地衣芽孢桿菌菌株，其特征在于:其應(yīng)用于桿菌肽生產(chǎn)中。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104293723SQ201410480828
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】陳守文, 彭炳, 王冬, 李陽, 祁高富, 孔素芬, 陳惠超, 陳曉斌 申請(qǐng)人:綠康生化股份有限公司