調(diào)控FABP6基因的兩個microRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與綿羊脂肪相關(guān)的分子標(biāo)記的篩選及應(yīng)用，具體涉及調(diào)控FABP6基因的兩個microRNA及其應(yīng)用。發(fā)明通過高通量測序和物信息學(xué)分析，篩選到調(diào)控FABP6基因的兩個microRNA，所述的microRNA為miR-29692和ssc-miR-28-3p。進(jìn)一步進(jìn)行了分子生物學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示miR-29692和ssc-miR-28-3p能有效抑制FABP6基因的表達(dá)。本發(fā)明公開的兩個microRNA可以作為綿羊脂肪相關(guān)的分子標(biāo)記，在遺傳輔助育種中具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。
【專利說明】調(diào)控FABP6基因的兩個microRNA及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種與綿羊脂肪酸相關(guān)的分子 標(biāo)記的篩選及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 綿羊育種中，伴隨產(chǎn)肉效率的提高，肉產(chǎn)品的食用品質(zhì)受到影響，降低了消費(fèi)者對 肉品質(zhì)的滿意度。嫩度及風(fēng)味是主要的肉質(zhì)性狀，與肌肉的脂肪酸含量和組成有關(guān)，由微效 多基因控制，遺傳機(jī)理復(fù)雜；因性狀之間的關(guān)聯(lián)性，以傳統(tǒng)的表型選擇難以改善肌肉脂肪酸 特性，而利用與綿羊肌肉脂肪酸相關(guān)的分子標(biāo)記，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇是有效改善肉質(zhì) 的育種方法。參與脂肪酸代謝的基因常用于肉質(zhì)性狀標(biāo)記的候選基因。
[0003] 脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding protein, FABPs)參與胞內(nèi)脂肪酸運(yùn)輸， 將脂肪酸從細(xì)胞膜上運(yùn)送至脂肪酸氧化和甘油三醋，磷脂的合成位點(diǎn)。按基因所表達(dá)的組 織或細(xì)胞劃分，F(xiàn)ABPs至少有9種不同的類型，大部分已經(jīng)成為綿羊肉質(zhì)性狀的主要候選基 因。
[0004] miRNA是一類大小約21-23個核苷酸的RNA分子，一般來源于染色體的非編碼區(qū) 域，由大約70nt大小的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體加工而來，其作用是在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因 表達(dá)產(chǎn)生抑制性作用。通過不斷探索，人們逐漸揭示了 miRNA的生物功能：調(diào)節(jié)生物體內(nèi)與 機(jī)體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，人類對于 miRNA在各種生理病理過程中的功能和調(diào)控將會有進(jìn)一步的認(rèn)識。然而到目前為止，通過各 種不同的實(shí)驗(yàn)方法和生物信息學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的miRNA和靶標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到飽和 程度。因此還有很多潛在的miRNA有待我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)驗(yàn)證，并揭示作用的靶標(biāo)，從而弄清這些 非編碼RNA的生物功能。
[0005] 綿羊?qū)r(nóng)業(yè)方面以及生物學(xué)研究來說極其重要，目前對肉用綿羊的遺傳育種研究 還略顯滯后，尋找與綿羊肌肉脂肪酸品質(zhì)相關(guān)的miRNA分子標(biāo)記對于遺傳標(biāo)記輔助育種、 改善肉用綿羊的品質(zhì)具有重要作用。小尾寒羊（HanShe?。┦羌健Ⅳ?、預(yù)、蘇、皖交界地區(qū)的 一個優(yōu)良綿羊品種，是當(dāng)?shù)貏趧尤嗣耖L期選育的地方良種，具有適應(yīng)性強(qiáng)，耐粗飼料，肌肉 不發(fā)達(dá)，生長較緩慢，肌內(nèi)脂肪含量高等特點(diǎn)。道賽特羊（Dorset)是在澳大利亞和新西蘭 的肉用型羊，具有生長發(fā)育快、瘦肉率高、肌內(nèi)脂肪含量低等特點(diǎn)，但肉質(zhì)欠佳。
[0006] 本發(fā)明通過對上述兩種綿羊的脂肪組織進(jìn)行高通量miRNA測序，篩選與綿羊肌肉 脂肪酸相關(guān)的分子標(biāo)記，經(jīng)過生物信息學(xué)差異基因表達(dá)分析初步選定了調(diào)控FABP6基因的 兩個microRNA,命名為miR-29692和ssc-miR-28_3p。進(jìn)一步進(jìn)行了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié) 果顯示本發(fā)明所述的兩個microRNA可以作為綿羊肌肉脂肪酸相關(guān)的microRNA分子標(biāo)記。 本發(fā)明還公開了用于檢測所述分子標(biāo)記的檢測試劑盒，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種綿羊育種分子標(biāo)記miRNA，所述miRNA的靶標(biāo)基因是 FABP6。
[0008] 進(jìn)一步，所述miRNA在優(yōu)良肉用綿羊品種的脂肪組織中低表達(dá)；在普通肉用綿羊 品種的脂肪組織中高表達(dá)調(diào)控靶基因 FABP6低表達(dá)。
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種與綿羊肌肉品質(zhì)相關(guān)的microRNA標(biāo)志物。所述 microRNA 為綿羊 miR-29692。
[0010] 本發(fā)明的目的是提供綿羊miR-29692序列SEQ IDNO 1 :
[0011] UGGACCUGGGGCUCUGC。
[0012] 本發(fā)明的目的是提供綿羊miR-29692的靶標(biāo)基因，所述靶標(biāo)基因?yàn)镕ABP6。
[0013] 本發(fā)明的目的是提供miR-29692標(biāo)志物的引物。
[0014] 進(jìn)一步，使用莖環(huán)法檢測miR-29692標(biāo)志物時，所用的反轉(zhuǎn)錄引物（RT primer)的 序列為序列表中SEQ ID NO 2 ;上游引物（Forward primer)為序列表中SEQ ID NO 3 ;下游 引物（Reverse primer)為序列表中 SEQ ID NO 4。
[0015] 進(jìn)一步，使用莖環(huán)法檢測miR-29692標(biāo)志物時，可以采用探針法或染料法。
[0016] 進(jìn)一步，使用加尾法檢測miR-29692標(biāo)志物時，所用的上游引物（Forward primer)為序列表中 SEQ ID NO 5。
[0017] 本發(fā)明制備的一種檢測miR-29692表達(dá)水平的熒光定量PCR試劑盒組分包括：反 轉(zhuǎn)錄試劑、反轉(zhuǎn)錄引物、特異性引物、內(nèi)參引物、熒光定量PCR反應(yīng)液。優(yōu)選的還包括特異性 探針。其中所述的反轉(zhuǎn)錄引物序列為SEQ ID NO 2;特異性引物包括上游引物和下游引物， 上游引物序列為SEQ ID NO 3,下游引物序列為SEQ ID NO 4。
[0018] 本發(fā)明制備的一種檢測miR-29692表達(dá)水平的熒光定量PCR試劑盒組分包括：反 轉(zhuǎn)錄試劑、反轉(zhuǎn)錄引物、特異性上游引物、通用下游引物、內(nèi)參引物、熒光定量PCR反應(yīng)液。 其中所述的特異性上游引物序列為SEQ ID NO 5。
[0019] 上述的試劑盒應(yīng)用于綿羊肌肉組織中miR-29692的定量檢測。
[0020] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種與綿羊肌肉品質(zhì)相關(guān)的microRNA標(biāo)志物。所述 microRNA 為綿羊 ssc-miR-28_3p。
[0021] 本發(fā)明的目的是提供綿羊ssc-miR-28-3p序列SEQ ID NO 8 :
[0022] CCU 腳 GAGCUCUAUGCAAGGG。
[0023] 本發(fā)明的目的是提供綿羊SSC-miR-28-3p的靶標(biāo)基因，所述靶標(biāo)基因?yàn)镕ABP6。
[0024] 本發(fā)明的目的是提供ssc-miR-28_3p標(biāo)志物的引物。
[0025] 進(jìn)一步，使用莖環(huán)法檢測ssc-miR-28_3p標(biāo)志物時，所用的反轉(zhuǎn)錄引物（RT primer)的序列為序列表中SEQ ID NO 9 ;上游引物（Forward primer)為序列表中SEQ ID NO 10 ;下游引物（Reverse primer)為序列表中 SEQ ID NO 11。
[0026] 進(jìn)一步，使用莖環(huán)法檢測ssc-miR-28_3p標(biāo)志物時，可以采用探針法或染料法。
[0027] 進(jìn)一步，使用加尾法檢測ssc-miR-28_3p標(biāo)志物時，所用的上游引物（Forward primer)為序列表中 SEQ ID NO 12。
[0028] 本發(fā)明的目的是提供ssc-miR-28_3p標(biāo)志物或其引物的應(yīng)用。
[0029] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先選取Dorset及HanShe印綿羊腹脂各5例，送往測序 公司進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，并對測序結(jié)果結(jié)合國際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異基因表達(dá)分 析，通過分析挑選出表達(dá)差異明顯的miR-29692和ssc-miR-28-3p，序列為SEQ ID NO 1和 SEQ ID NO 8,進(jìn)一步以miR-29692和ssc-miR-28-3p為研究對象，通過搜索RNAhybrid數(shù) 據(jù)庫，預(yù)測出miR-29692和ssc-miR-28-3p調(diào)控的靶基因--FABP6。
[0030] 根據(jù)上述的miRNA的序列和FABP6的序列設(shè)計(jì)引物序列。
[0031] 進(jìn)一步采用RT-PCR方法檢測45例Dorset綿羊、45例HanSheep綿羊脂肪組織 中miR-29692、ssc-miR-28-3p及FABP6的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Dorset綿羊脂肪組織中 miR-29692、ssc-miR-28-3p的表達(dá)明顯高于HanShe印綿羊脂肪組織，前者是后者的近3. 23 和3. 58倍。
[0032] 更進(jìn)一步的miRNA對FABP6基因表達(dá)的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)的miR-29692、 SSC-miR-28-3p就能很好的負(fù)調(diào)控基因 FABP6,二者聯(lián)合能更好的負(fù)調(diào)控基因 FABP6。表明 miR-29692、SSC-miR-28-3p可單獨(dú)也可聯(lián)合作為標(biāo)志物應(yīng)用于綿羊肌肉品質(zhì)相關(guān)的遺傳育 種中。
[0033] 本發(fā)明的目的是提供用于檢測上述microRNA標(biāo)志物和/或檢測上述靶標(biāo)基因 FABP6的檢測試劑盒。該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增 儀，靈敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0034] 本發(fā)明還公開了 miR-29692檢測方法。
[0035] miR-29692檢測可采用包括基于核苷酸雜交基礎(chǔ)上的方法（如RNA印跡技術(shù)、原 位雜交技術(shù)、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)和微陣列技術(shù)）、夾板連接法和基于PCR基礎(chǔ)上的方法 (RNA加尾法、小靶點(diǎn)定量PCR和莖環(huán)法）等多種檢測方法進(jìn)行檢測。
[0036] RNA印跡技術(shù)（Northern blot) -般是先用聚丙烯酰胺電泳（PAGE)分離出總RNA 中長度約200bp以內(nèi)的小RNA，然后轉(zhuǎn)移至印跡膜上與標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，經(jīng)洗膜顯 影后對條帶進(jìn)行分析。為了提高雜交反應(yīng)的親合性和檢測靈敏度，鎖核酸（locked nucleic acid，LNA)探針被應(yīng)用于microRNA的分析研究。實(shí)驗(yàn)表明，在寡核苷酸探針中每引入1個 LNA修飾堿基，其與相應(yīng)的DNA雜交時，解鏈溫度會提高1°C _8°C，而在與RNA雜交時解鏈溫 度會提高2°C -10°C，從而提高LNA探針與microRNAs分子的雜交特異性和靈敏度。
[0037] miRNAs原位雜交分析是用比色或熒光試劑等標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織 中的microRNAs進(jìn)行雜交，通過顯色或突光成像檢測microRNAs的表達(dá)，可直觀地展現(xiàn) microRNAs的時空表達(dá)模式。原位雜交技術(shù)能夠顯示miRNA表達(dá)的位置，甚至達(dá)到細(xì)胞定位 的水平，尤其適用于石蠟包埋或福爾馬林固定后的標(biāo)本。
[0038] 基于微球的流式細(xì)胞術(shù)（bead-based flow-cytometry)，即液相芯片技術(shù)，這種技 術(shù)將流式細(xì)胞檢測與芯片技術(shù)有機(jī)地結(jié)合在一起，使生物芯片反應(yīng)體系由液相--固相反 應(yīng)改變?yōu)榻咏锵到y(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的完全液相反應(yīng)體系。此法利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)載 體，不同的微球由不同的熒光編碼所標(biāo)記，可被相應(yīng)檢測系統(tǒng)所識別。微球上可連接核苷 酸探針或者蛋白質(zhì)，檢測miRNA時連接的是長約10-12nt的miRNA捕獲探針，此探針與靶 miRNA的3 '端互補(bǔ)配對，再加入8-10nt的報(bào)告探針與miRNA的5'端反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后， 在檢測系統(tǒng)中通過兩束激光逐一通過檢測流場的微球探針上的分類熒光和報(bào)告探針上的 標(biāo)一記熒光進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對靶miRNA的定性和定量檢測。
[0039] 微陣列技術(shù)（microarray)也稱生物芯片、DNA芯片或者基因芯片技術(shù)。一般 是在玻璃片等固體支持物上固定高密度已知序列的DNA探針，利用雜交原理，使多種 microRNAs目標(biāo)分子與微陣列雜交，通過檢測雜交信號強(qiáng)度及數(shù)據(jù)處理，獲得不同標(biāo)本中特 異microRNAs的表達(dá)譜，從而全面比較不同物種的不同器官或組織以及正常和患病組織中 microRNAs表達(dá)水平的差異。它的優(yōu)點(diǎn)是高通量，可以一次分析人的整個基因組，在10分鐘 內(nèi)定量獲得3萬多個基因的表達(dá)。
[0040] 夾板連接法需先設(shè)計(jì)一段與目標(biāo)miRNA互補(bǔ)的脫氧核苷酸（橋連片段），此片段 除了與目的miRNA互補(bǔ)段（3'端）外，其5'端還有一段14nt的外延片段。同時設(shè)計(jì)一段 與14m外延片段互補(bǔ)的脫氧核普酸（連接片段），在其5'端用32 p進(jìn)行標(biāo)記。退火時miRNA 與連接片段同時與橋連片段互補(bǔ)配對，就產(chǎn)生了 一個雜化雙鏈，其中一鏈中間有個缺口，即 miRNA與連接片段的交界處。用T4DNA連接酶將此缺口連上，就相當(dāng)于用32p對miRNA進(jìn)行 了標(biāo)記。用磷酸酶除去游離的32 p標(biāo)記的連接片段，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，對放射信 號的強(qiáng)弱進(jìn)行檢測，即可得到對應(yīng)的miRNA量的信息。據(jù)稱此方法比Northern blot簡便、 快速，也更敏感，可用來進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測。
[0041] 加尾法。miRNA的長度僅為22nt左右，幾乎只相當(dāng)于一個引物的長度，因此不能用 傳統(tǒng)的RT-PCR方法進(jìn)行檢測?？捎肦NA加尾和引物延伸RT-PCR法進(jìn)行miRNA檢測。首先 提取總RNA，繼提取小RNA，在小RNA3'末端由poly A聚合酶加上一段poly A尾巴，然后用 一個3'末端含有一段poly T的長引物將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，所得到的cDNA的長度比較 適合進(jìn)行熒光定量PCR。
[0042] 小靶點(diǎn)定量聚合酶鏈反應(yīng)包括三個反應(yīng)步驟：逆轉(zhuǎn)錄、DNA模板連接和連接產(chǎn)物 的PCR擴(kuò)增，每個反應(yīng)都被熱失活所隔開。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時，miRNA被特異引物逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA，因各個miRNA之間至少可達(dá)到一個堿基的差別，而差別處大多位于miRNA的3'端，因 此引物的末端應(yīng)盡量位于miRNA的3'端高變區(qū)或附近，引物長度應(yīng)盡量縮短。在第二步反 應(yīng)中，cDNA與兩個寡核苷酸互補(bǔ)配對，互補(bǔ)配對后，兩個寡核苷酸之間的缺口可達(dá)到7個核 苷酸的長度。每個寡核苷酸都部分與cDNA配對，其余超出cDNA長度的部分露出在外，稱為 M13+。缺口由T4DNA連接酶所填補(bǔ)，連接反應(yīng)對缺口兩端的堿基錯配非常敏感，尤其是3' 端，所以應(yīng)盡可能將缺口的3'端設(shè)置于miRNA高變區(qū)之外。在第三步反應(yīng)中，以連接產(chǎn)物 作為模板，以M13+的正、反向引物作為PCR通用引物，與特異的TaqMan探針一起，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。由于逆轉(zhuǎn)錄和連接反應(yīng)都以miRNA的中心和3 '末端即區(qū)分miRNA成員的主要區(qū)域 作為特異的靶標(biāo)，且T4DNA連接酶能夠?qū)A基錯配進(jìn)行辨別，因而這種方法具有較高的特 異性，交叉反應(yīng)率低，可作為定量檢測短核苷酸的敏感的檢測方法。
[0043] 莖環(huán)法的特征是應(yīng)用了一個單一的莖環(huán)狀的引物，避免對目的miRNA進(jìn)行加尾。 反應(yīng)過程分兩步。首先，莖環(huán)狀引物與目的miRNA分子的3'端結(jié)合，引物3'端與miRNA3' 端有6個互補(bǔ)配對的核苷酸，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶將之逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。其次是PCR反 應(yīng)。cDNA第一鏈的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開后鏈的長度增加了，以其為模板即可進(jìn)行傳統(tǒng)的熒光定 量PCR。莖環(huán)狀引物的莖部為雙鏈結(jié)構(gòu)，防止引物與pre-miRNA或其他長鏈RNA的雜交；莖 部的堿基堆積增強(qiáng)了miRNA和DNA異質(zhì)雙鏈的親合力，提高了逆轉(zhuǎn)錄的效率；且莖環(huán)狀結(jié)構(gòu) 展開后增加了 miRNA的長度，為隨后進(jìn)行的PCR反應(yīng)提供了合適的模板。
[0044] 優(yōu)選的，本發(fā)明公開了一種通過熒光定量檢測miR-29692和/或ssc-miR-28-3p 表達(dá)水平的方法。
[0045] 優(yōu)選的，本發(fā)明公開了一種通過RT-PCR中的加尾法檢測miR-29692表達(dá)水平的方 法。
[0046] 進(jìn)一步，所述加尾法檢測miR-29692表達(dá)水平的步驟：（1)提取綿羊肌肉組織中的 小RNA ; (2)通過poly (A)聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行miR-29692加尾和反轉(zhuǎn)錄；（3)采用SEQ ID NO 5及市售適用于加尾法的熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行miR-29692的擴(kuò)增。
[0047] 優(yōu)選的，加尾法檢測miR-29692表達(dá)水平的步驟：（1)提取綿羊肌肉組織中的 小 RNA ; (2)通過 Qiagen 的 miScript II Reverse Transcription Kit (貨號 218161) 進(jìn)行 miR-29692 加尾和反轉(zhuǎn)錄；（3)采用 SEQ ID NO 5 及 Qiagen 的 miScript SYBR GreenPCRKit (貨號 218073)進(jìn)行 miR-29692 的擴(kuò)增。
[0048] 進(jìn)一步，所述莖環(huán)法檢測miR-29692表達(dá)水平的步驟：（1)提取綿羊肌肉組織中的 總RNA ; (2)通過反轉(zhuǎn)錄引物SEQ ID NO 2在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行miR-29692反轉(zhuǎn)錄；（3) 采用引物SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4及市售適用于莖環(huán)法的熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行 miR-29692 的擴(kuò)增。
[0049] 優(yōu)選的，本發(fā)明公開了一種通過RT-PCR中的加尾法檢測ssc-miR-28-3p表達(dá)水平 的方法。
[0050] 進(jìn)一步，所述加尾法檢測SSc-miR-28-3p表達(dá)水平的步驟：（1)提取綿羊肌肉組織 中的小1?嫩 ；（2)通過口〇17(4)聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行88〇-11^1?-28-3口加尾和反轉(zhuǎn)錄；（3) 采用SEQ ID NO 12及市售適用于加尾法的熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行ssc-miR-28-3p的擴(kuò) 增。
[0051] 優(yōu)選的，加尾法檢測SSc-miR-28-3p表達(dá)水平的步驟：（1)提取綿羊肌肉組織中的 小 RNA ; (2)通過 Qiagen 的 miScript II Reverse Transcription Kit (貨號 218161)進(jìn)行 ssc-miR-28_3p 加尾和反轉(zhuǎn)錄；（3)米用 SEQ ID NO 12 及 Qiagen 的 miScript SYBR Green PCR Kit (貨號 218073)進(jìn)行 ssc-miR-28-3p 的擴(kuò)增。
[0052] 進(jìn)一步，所述莖環(huán)法檢測SSC-miR-28-3p表達(dá)水平的步驟：（1)提取綿羊肌肉組織 中的總RNA;(2)通過反轉(zhuǎn)錄引物SEQ ID NO 9在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行ssc-miR-28-3p反 轉(zhuǎn)錄；⑶采用引物SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11及市售適用于莖環(huán)法的熒光定量PCR試 劑盒進(jìn)行ssc-miR-28-3p的擴(kuò)增。
[0053] 本發(fā)明還提供了 miR-29692和/或ssc-miR-28-3p作為分子標(biāo)記在遺傳標(biāo)記輔助 育種、改善肉用綿羊的品質(zhì)中的應(yīng)用。
[0054] 進(jìn)一步，所述miR-29692和/或ssc-miR-28-3p輔助育種、改善肉用綿羊的品質(zhì)中 的應(yīng)用，在目標(biāo)肉用綿羊肌肉組織中miR-29692和/或ssc-miR-28-3p低表達(dá)，F(xiàn)ABP6高表 達(dá)。
[0055] miRNA及其前體定義
[0056] 本發(fā)明提供了一類涉及綿羊肉質(zhì)相關(guān)的miRNA。如本文所用，所述的"miRNA"是一 類長度約19?25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于植物、線蟲、果蠅和哺乳 動物等生物中，主要通過基本上互補(bǔ)的方式與編碼蛋白mRNA的3'-UTR區(qū)結(jié)合引起靶mRNA 的降解、活性降低或翻譯受抑，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控一類RNA分子。成熟 的miRNA通常具有19?25個核苷酸（nt)(更特別的約19-22nt)，也不排除具有其它數(shù)目 核苷酸的miRNA分子。
[0057] miRNA 可從前體 miRNA (Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而來，所述的前體 miRNA可折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)（發(fā)夾）結(jié)構(gòu)，所述的莖環(huán)結(jié)構(gòu)長度一般在50-100bp之間。 所述的前體miRNA可折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部兩側(cè)包含基本上互補(bǔ)的兩條 序列。所述的前體miRNA可以是天然的或是人工合成的。
[0058] 前體miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可與編碼基因的mRNA的至少一部 分序列基本上互補(bǔ)。如本文所用，"基本上互補(bǔ)"是指核苷酸的序列是足夠互補(bǔ)的，可以以一 種可預(yù)見的方式發(fā)生相互作用，如形成二級結(jié)構(gòu)（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)）。通常，兩條"基本上互補(bǔ)" 的核苷酸序列互相之間至少有70%的核苷酸是互補(bǔ)的；優(yōu)選的，至少有80%的核苷酸是互 補(bǔ)的；更優(yōu)選的，至少有90%的核苷酸是互補(bǔ)的；進(jìn)一步優(yōu)選的，至少有95%的核苷酸是互 補(bǔ)的；如98%、99%或100%。一般地，兩條足夠互補(bǔ)的分子之間可以具有最多40個不匹配 的核苷酸；優(yōu)選的，具有最多30個不匹配的核苷酸；更優(yōu)選的，具有最多20個不匹配的核 苷酸；進(jìn)一步優(yōu)選的，具有最多10個不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11個不匹配的 核苷酸。
[0059] 如本文所用，"莖環(huán)"結(jié)構(gòu)也被稱作"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，是指一種核苷酸分子，其可形成一 種包括雙鏈區(qū)域（莖部）的二級結(jié)構(gòu)，所述的雙鏈區(qū)域由該核苷酸分子的兩個區(qū)域（位于 同一分子上）形成，兩個區(qū)域分列雙鏈部分的兩側(cè)；其還包括至少一個"環(huán)"結(jié)構(gòu)，包括非互 補(bǔ)的核苷酸分子，即單鏈區(qū)域。即使該核苷酸分子的兩個區(qū)域不是完全互補(bǔ)的，核苷酸的雙 鏈部分也可保持雙鏈狀態(tài)。例如，插入、缺失、取代等可導(dǎo)致一個小區(qū)域的不互補(bǔ)或該小區(qū) 域自身形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或其它形式的二級結(jié)構(gòu)，然而，該兩個區(qū)域仍可基本上互補(bǔ)，并在可預(yù) 見的方式中發(fā)生相互作用，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈區(qū)域。莖環(huán)結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 的，通常在獲得了一條具有一級結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的核酸后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定該 核酸是否能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0060] 小RNA測序
[0061] 小RNA是一類重要的體內(nèi)調(diào)節(jié)分子，主要包括miRNA、piRNA和siRNA。它的功能 主要是誘導(dǎo)基因沉默，參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化，以及個體發(fā)育、生殖 等重要生物學(xué)過程。小RNA測序技術(shù)采用膠分離技術(shù)，收集樣品中18-30nt的RNA片段，利 用高通量測序技術(shù)，一次性獲得單堿基分辨率的數(shù)百萬條小RNA序列信息，依托強(qiáng)大的生 物信息分析平臺，鑒定已知小RNA，并預(yù)測新的小RNA及其靶標(biāo)基因。
[0062] 本發(fā)明還包括miRNA變體和衍生物。此外，廣義上的miRNA衍生物也可包括miRNA 變體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用通用的方法對miR-29692進(jìn)行修飾，修飾方式包括 (但不限于）：甲基化修飾、烴基修飾、糖基化修飾（如2-甲氧基-糖基修飾、烴基-糖基 修飾、糖環(huán)修飾等）、核酸化修飾、肽段修飾、脂類修飾、鹵素修飾、核酸修飾（如"TT"修飾） 等。
[0063] 多核苷酸構(gòu)建物
[0064] 根據(jù)本發(fā)明所提供的miRNA序列，可設(shè)計(jì)出在被導(dǎo)入后可被加工成可影響相應(yīng)的 mRNA表達(dá)的miRNA的多核苷酸構(gòu)建物，也即所述多核苷酸構(gòu)建物能夠在體內(nèi)上調(diào)相應(yīng)的 miRNA的量。所述的多核苷酸構(gòu)建物可被人細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可被 人細(xì)胞剪切且表達(dá)成所述的miRNA。
[0065] 通常，所述的多核苷酸構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括一種載體，它 含有所述的miRNA,或所述的多核苷酸構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有啟動子、復(fù)制起 點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。 這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地 包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉 素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。
[0066] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：
[0067] (a)本發(fā)明提供的miR-29692和/或ssc-miR-28-3p與綿羊肌肉品質(zhì)具有很好的 相關(guān)性，可用于綿羊肌肉品質(zhì)相關(guān)的輔助遺傳育種中。
[0068] (b)本發(fā)明提供的檢測miR-29692和/或ssc-miR-28-3p表達(dá)水平的熒光定量PCR 試劑盒包含了從RNA提取到熒光定量實(shí)驗(yàn)所用的整套試劑，既方便使用，又保證了結(jié)果的 一致性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0069] 圖I. Real-time PCR檢測綿羊脂肪組織中miR-29692的相對表達(dá)量。
[0070] 圖2. Real-time PCR檢測綿羊脂肪組織中ssc-miR-28-3p的相對表達(dá)量。

【具體實(shí)施方式】
[0071] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測。
[0072] 實(shí)施例1高通量轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ふ也煌贩N綿羊脂肪組織中表達(dá)譜差異的 microRNA
[0073] 選5例Dorset及5例HanSheep綿羊分別取他們的腹脂，組織標(biāo)本自取出后分成 小塊速凍于液氮30秒，然后儲存于-70°C冰箱。隨后低溫送往測序公司進(jìn)行小RNA測序。
[0074] 運(yùn)用 Fast-QC(http ：//www. bioinformatics, babraham. ac. uk/projects/ fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分 布，GC 含量，PCRduplication 含量，kmer 的 frequency 等。
[0075] 將成熟小RNA分析結(jié)果的counts數(shù)加和小于10的刪除，再采用結(jié)合國際公認(rèn)算 法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中IogFC > 1或LogFC < -1，F(xiàn)DR <0· 05。通過分析最終挑選 出表達(dá)差異明顯的miR-29692和ssc-miR-28-3p，序列為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 8,通 過搜RNAhybrid數(shù)據(jù)庫，預(yù)測出他們調(diào)控的靶基因?yàn)镕ABP6。
[0076] 實(shí)施例 2Real-time PCR檢測綿羊脂肪組織中 miR-29692、ssc-miR-28-3p 及FABP6 的表達(dá)
[0077] 試劑：
[0078] 反轉(zhuǎn)錄試劑盒：SG One-St印 miRNA RT Kit，#33_3〇12〇, SinoGene
[0079] PCR Mix :2XSG PCR MasterMix，#33-10201，SinoGene
[0080] qPCR 試劑：2 X SG Green qPCR Mix (with R0X)，#22-10102, SinoGene
[0081] 相關(guān)實(shí)驗(yàn)物品的去Rnase的處理：
[0082] ①將所有玻璃器皿應(yīng)用前均用DEPC沖洗侵泡，120°C高壓20min，180°C高溫烤干2 小時以上。
[0083] ②將塑料器皿（如：EP管/槍頭）使用前需用0· 1 % DEPC水侵泡過夜，后控干液 體，120°C高壓20min，烤箱烤干備用。
[0084] 選取45例Dorsetp綿羊脂肪組織、45例HanSheep綿羊脂肪組織，編碼后隨機(jī)選擇 提取RNA。
[0085] miRNA 提取：
[0086] (1)從液氮中分別取出凍存綿羊脂肪組織，稱重，分別放入離心管中，按50-100mg 組織/ml Trizol的量加入Trizol，組織體積不能超過Trizol體積的10 %，充分勻楽約 l_2min ;
[0087] (2)組織加入Trizol后，15-30°C孵育5min，使其充分裂解；
[0088] (3)加入1/10體積的miRNA勻漿添加劑，漩渦數(shù)下混合均勻，冰上放置10分鐘； ⑷向裂解物中加入同體積的三氯甲燒，漩渦30-60S混勻；
[0089] (5)室溫最大轉(zhuǎn)速（IOOOOg)離心5分鐘，使水相有機(jī)相分離，中間相析出沖間相 如果沒有析出，再次離心；
[0090] (6)小心吸取上層水相至新的收集管中，記錄水相體積；
[0091] (7)向收集管中加入1/3體積的無水乙醇，漩渦或顛倒數(shù)下混勻；
[0092] (8)將裂解液/乙醇混合液加入過濾芯過濾，過濾芯放入新的收集管中，每個樣本 用一個過濾芯；
[0093] (9)用移液管將上步中的混合液移入過濾芯，一次可容納體積700μ1。超過 700 μ 1繼續(xù)用同樣的過濾芯再次過濾；
[0094] (10) IOOOOg離心15s使液體通過濾芯；
[0095] (11)收集濾液，如果裂解液/乙醇體積多于700 μ 1，繼續(xù)過濾時用新的收集管，直 到所有裂解液/乙醇混合液過濾完畢，收集過濾液，記錄體積；
[0096] (12)向上一步中收集到的過濾液中加入2/3體積的室溫?zé)o水乙醇；
[0097] (13)將過濾液/乙醇混合液加入第二個過濾芯中過濾，棄去過濾液，每個樣本用 一個過濾芯，將過濾芯放入提供的收集管中；
[0098] (14)用移液管將上步中的混合液移入過濾芯，一次可容納體積700 μ 1時。超過 700 μ 1繼續(xù)用同樣的過濾芯再次過濾；
[0099] (15) IOOOOg離心15s使液體通過濾芯；
[0100] (16)棄去過濾出的液體，留過濾芯用于下一步洗脫；
[0101] (17)向過濾芯中加入700μ 1的miRNA洗液1(工作液中加入乙醇），離心5-10s， 棄去洗脫出的液體，收集管繼續(xù)使用；
[0102] (18)向過濾芯中加入500μ 1的miRNA洗液2/3(工作液中加入乙醇），離心5-10s， 棄去洗脫出的液體；
[0103] (19)重復(fù)上一步驟；
[0104] (20)將過濾芯放入新的收集管（試劑盒中提供）中。向過濾芯中心加入100 μ 1 95°C預(yù)熱的洗脫液或不含核酸酶的水，最大轉(zhuǎn)速離心20-30s收集RNA溶解液。
[0105] miRNA的RT-PCR體系的配制：
[0106]

【權(quán)利要求】
1. 一種綿羊育種分子標(biāo)記miRNA，其特征在于，所述miRNA的靶標(biāo)基因是FABP6。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA為miR-29692,序列為SEQ ID NO 1〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA為ssc-miR-28-3p，所述分子 標(biāo)記序列為SEQ ID NO 8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA在優(yōu)良肉用綿羊 品種的脂肪組織中低表達(dá)。
5. -種通過檢測權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的分子標(biāo)記miRNA檢測綿羊肌肉品質(zhì)的 方法，其特征在于，采用下列檢測方法中的一種或幾種：基于核苷酸雜交基礎(chǔ)上的方法，如 RNA印跡技術(shù)、原位雜交技術(shù)、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)和微陣列技術(shù)；夾板連接法；基于PCR 基礎(chǔ)上的方法，如加尾法、小靶點(diǎn)定量PCR和莖環(huán)法。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，采用加尾法和/或莖環(huán)法檢測綿羊脂 肪組織中miRNA的表達(dá)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于，所述加尾法檢測miRNA 表達(dá)水平的步驟：（1)提取綿羊肌肉組織中的小RNA;(2)通過poly(A)聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶 進(jìn)行miRNA加尾和反轉(zhuǎn)錄；（3)采用適用于加尾法的熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行miR-29692和 /或 SSC-miR-28-3p的擴(kuò)增；所述莖環(huán)法檢測miRNA表達(dá)水平的步驟：（1)提取綿羊肌肉組 織中的總RNA; (2)通過反轉(zhuǎn)錄引物在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行miRNA反轉(zhuǎn)錄；（3)采用適用 于莖環(huán)法的熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行miR-29692和/或ssc-miR-28-3p的擴(kuò)增。
8. -種檢測綿羊脂肪組織中miR-29692和/或ssc-miR-28-3p表達(dá)水平的熒光定量 PCR試劑盒。
9. 權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的分子標(biāo)記和/或權(quán)利要求8所述試劑盒在遺傳標(biāo)記輔 助育種、改善肉用綿羊肌肉品質(zhì)中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求3和4所述的miRNA的組合在遺傳標(biāo)記輔助育種、改善肉用綿羊肌肉品質(zhì) 中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104293782SQ201410480221
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】苗向陽 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所