用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的血清miRNA標(biāo)志物組合及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于區(qū)分原發(fā)性肝細(xì)胞癌與正常人的血清miRNA標(biāo)志物組合及應(yīng)用。本發(fā)明的用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的血清miRNA標(biāo)志物組合包括下列8種has-miRNA：hsa-miR-206,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-433-3p,hsa-miR-1228-5p,hsa-miR-199a-5p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-192-5p,和hsa-miR-26a-5p。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的早期發(fā)現(xiàn)以及迅速的無創(chuàng)性檢測(cè)。
【專利說明】用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的血清miRNA標(biāo)志物組合及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于區(qū)分原發(fā)性肝細(xì)胞癌與正常人 及乙肝肝硬化的血清miRNA標(biāo)志物組合及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球第三大腫瘤死亡的疾 病，每年有近50萬死亡病例。一年內(nèi)高死亡的重要原因是只有30% -40%的HCC能得到早 期正確的診斷而進(jìn)行治療，所以，研究認(rèn)為早期診斷是提高HCC生存的關(guān)鍵。目前診斷HCC 的主要手段是：影像學(xué)診斷和生物標(biāo)志物診斷。因此，尋找新的敏感性高和特異性強(qiáng)的血清 標(biāo)志物顯得尤為重要。
[0003] miRNA(microRNA)是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度為18?24個(gè)核苷 酸。miRNA普遍存在于人類的體液中，性質(zhì)穩(wěn)定，可以定量檢測(cè)，且存在顯著的疾病特異性。 近年的研究表明，血液、唾液、尿液、乳汁及腦脊液等體液miRNA檢測(cè)可應(yīng)用于妊娠等生理 狀態(tài)的判斷以及腫瘤、感染、代謝及阿爾海默茨病等疾病的診斷和預(yù)后判斷。體液特異性 miRNA檢測(cè)的臨床意義及應(yīng)用前景已引起高度關(guān)注，miRNA作為一類非編碼調(diào)節(jié)性的小分 子RNA有可能取代傳統(tǒng)的特異蛋白為代表的生物標(biāo)志物。體液miRNA含量豐富且性質(zhì)穩(wěn)定， 具備成為優(yōu)異生物標(biāo)志物的潛質(zhì)，并且擁有以蛋白質(zhì)為代表的傳統(tǒng)生物標(biāo)志物不具備的特 性，無需抗體制備且易于精確定量，可能克服抗原抗體類生物標(biāo)志物的制備瓶頸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種能夠用于HCC的早期發(fā)現(xiàn)以及進(jìn)行快速 的無創(chuàng)性檢測(cè)的血清miRNA標(biāo)志物組合及應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明包括以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明的用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的血清miRNA標(biāo)志物組合包括下列8種hsa-m iR-206, hsa-miR-141_3p，hsa-miR-433_3p，hsa-miR-1228_5p，hsa-miR-199a_5p，hsa-miR-122_5p，hsa-miR-192_5p，和 hsa-miR-26a_5p。
[0007] 本發(fā)明的用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的miRNA探針組合，是基于下列核苷酸序列： SEQ ID NO. U SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8。
[0008] 上述用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的miRNA探針組合在制備檢測(cè)HCC的試劑中的應(yīng) 用。
[0009] 本發(fā)明的用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的試劑盒，包括上述用于檢測(cè)HCC的miRNA探 針組合，還包括Taq酶、氯化鎂和PCR緩沖液。
[0010] 本發(fā)明的權(quán)利要求用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的miRNA引物組合是基于下列核苷 酸序列：SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8。 toon] 本發(fā)明權(quán)利要求用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的試劑盒，包括上述用于檢測(cè)原發(fā)性肝 細(xì)胞癌的miRNA引物組合，還包括Taq酶、氯化鎂和PCR緩沖液。
[0012] 本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)HCC的早期發(fā)現(xiàn)以及迅速的無創(chuàng)性檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例的三組mappable reads數(shù)據(jù)及長度分析圖；
[0014] 圖2訓(xùn)練集HCC 8種miRNA與正常對(duì)照組和肝硬化組的比較；
[0015] 圖3 -圖10是8種miRNA在訓(xùn)練集ROC曲線下面積；
[0016] 圖11 一圖12是miRNA組合在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集ROC曲線下面積；
[0017] 圖13 -圖14是miRNA組合區(qū)分HCC組與正常對(duì)照組和HCC組與肝硬化組的ROC 曲線下面積；
[0018] 圖15 -圖17是AFP在不同組別的ROC曲線下面積；
[0019] 圖18 -圖20是miRNA組合比較AFP在不同組別的ROC曲線下面積。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 研究對(duì)象
[0021] 共有261例HCC患者，233例肝硬化患者和173例健康對(duì)照者，患者來自門診及住 院患者，健康志愿者來自體檢中心，無器質(zhì)性疾病以及精神性疾病人群。發(fā)現(xiàn)階段分別有3 例正常對(duì)照、3例肝硬化患者和3例HCC患者混合血清標(biāo)本進(jìn)行Illumina Hiseq 2000深度 測(cè)序；篩選階段分別20例正常對(duì)照、20例肝硬化患者和20例HCC患者；訓(xùn)練階段有90例 正常對(duì)照、132例肝硬化患者和135例HCC患者入選；驗(yàn)證階段60例正常對(duì)照、78例肝硬化 患者和103例HCC患者?；颊吆徒】等巳夯厩闆r見表1。
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的血清miRNA標(biāo)志物組合，其特征是：包括下列8種 has-miRNA :hsa_miR-206, hsa-miR-141_3p，hsa-miR-433_3p，hsa-miR-1228_5p，hsa-miR-1 99a_5p，hsa-miR-122_5p，hsa-miR-192_5p，和 hsa-miR-26a_5p〇
2. -種用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的miRNA探針組合，其特征是：基于以下核苷酸序列： SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8。
3. -種用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的試劑盒，其特征是：包括權(quán)利要求2所述包括的 miRNA探針組合，還包括Taq酶、氯化鎂和PCR緩沖液。
4. 一種用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的miRNA引物組合，其特征是：是基于下列核苷酸序 列，包括以下序列：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8。
5. -種用于檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的試劑盒，其特征是：包括權(quán)利要求4所述的miRNA 引物組合，還包括Taq酶、氯化鎂和PCR緩沖液。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293914SQ201410453958
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】譚友文, 潘騰莉 申請(qǐng)人:鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院