專利名稱：一種用于肝細(xì)胞癌早期診斷的分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因動物尋找肝細(xì)胞癌發(fā)生早期的分子事件。具體地，本發(fā)明利用外源目基因定位整合致肝細(xì)胞癌小鼠模型進(jìn)行分析，找到肝細(xì)胞癌發(fā)生早期的分子事件，從而找到可用于肝細(xì)胞癌早期診斷和靶向治療的分子標(biāo)記物。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌(HCC)是全球最主要的惡性腫瘤之一，尤其是在包括中國在內(nèi)的亞太地區(qū)。全世界每年發(fā)生HCC的患者超過100萬人(1)，5年存活率低于5％。HCC發(fā)生和發(fā)展與多種致病因素有關(guān)，尤其與乙型肝炎病毒(HBV)感染密切相關(guān)。HBV是環(huán)狀部分雙鏈的DNA病毒，全長約3.2kb。HBV復(fù)制過程中以RNA拷貝為中間體，HBV具有隨機(jī)整合到宿主基因組中的能力，整合了HBV的宿主稱為攜帶者。攜帶者中都有病毒表面抗原(HBsAg)的表達(dá)，攜帶者呈現(xiàn)非癥狀的慢性感染。估計全世界至少有三億五千萬HBV慢性攜帶者(2)，75％以上的HBV慢性攜帶者分布在亞洲和西太平洋地區(qū)(3)。其中至少約20％有不同程度的慢性肝炎和肝硬化，部分最后可演變?yōu)樵l(fā)性肝癌。中國是HBV的高攜帶區(qū)，攜帶率約為10-20％。臨床及流行病學(xué)研究顯示，HBV慢性攜帶者患HCC的風(fēng)險高達(dá)40-50％。臨床上，肝細(xì)胞癌最好的治療手段仍然是在肝癌早期手術(shù)切除，因此早期診斷顯得至關(guān)重要。至今還沒有發(fā)現(xiàn)易于檢測的血清和肝臟分子標(biāo)記物，可用于盡早檢測出可能會發(fā)生HCC的攜帶者。進(jìn)一步研究HBV導(dǎo)致HCC發(fā)生的病理過程及其分子機(jī)制對于此類肝癌的早期診斷具有重要的意義。
肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜變化過程，涉及到多種基因的異常表達(dá)或突變及其彼此間的相互作用。HBV病毒感染及其基因表達(dá)產(chǎn)物與肝細(xì)胞蛋白或核酸分子的相互作用，可干擾正常的基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可能激發(fā)原癌基因的異常表達(dá)，或在功能上滅活腫瘤抑制基因，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的非正常生長和分化，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變。流行病學(xué)調(diào)查表明，男性發(fā)生肝細(xì)胞癌的比例顯著高于女性(4)，提示肝細(xì)胞癌的發(fā)生可能與性激素密切相關(guān)。我們利用基因打靶將乙型肝炎病毒的表面抗原基因(HBsAg)和X基因(HBx)定位整合到小鼠染色體的p21位點(diǎn)上，成功建立了肝細(xì)胞癌的小鼠模型(8)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因小鼠15-24月齡，雄性小鼠發(fā)生肝細(xì)胞癌的比例為58.33％，而雌性小鼠不發(fā)生肝細(xì)胞癌。X基因轉(zhuǎn)基因小鼠在18個月后，發(fā)生肝細(xì)胞癌，雌雄小鼠發(fā)生肝細(xì)胞癌的比例差別不明顯。
雌激素受體β是Mosselman(5)和Kuiper(6)等相繼克隆出來的一種新型的雌激素受體。雌激素受體β在人及其它高等動物的許多組織與細(xì)胞中都有分布，但在不同組織與細(xì)胞中含量相差很大，甚至在同一細(xì)胞的不同區(qū)域的分布也有很大差別。如在胎兒的睪丸、卵巢、腎上腺以及脾臟中雌激素受體β的mRNA含量豐富，而在垂體、皮膚、腎和大腦皮層中含量較低或極低。1997年，Tremblay(7)等成功地克隆了小鼠的雌激素受體β。小鼠的雌激素受體β主要分布于小鼠的前列腺、卵巢、睪丸、肺、乳腺、骨、尿道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等。雌激素受體β可能與睪丸及附睪的發(fā)育、前列腺癌的發(fā)生及乳腺癌的發(fā)生等多種生理和病理現(xiàn)象密切相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種肝細(xì)胞癌發(fā)生早期的診斷分子的發(fā)現(xiàn)，它包括以下步驟①肝細(xì)胞癌小鼠模型的建立，具體步驟參見文獻(xiàn)(8)；
②設(shè)計PCR反應(yīng)的引物；③利用步驟2獲得的PCR反應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；④將步驟3獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T Easy Vector中；⑤小鼠肝臟及腫瘤RNA的提??；⑥Northern Blot分析。


圖1顯示了雌激素受體βPCR示意圖。1、1kb ladders；2、野生型小鼠肝臟；3、HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟；4、HBX轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟；5、小鼠睪丸；6、陰性對照。
圖2顯示了雌激素受體β攜帶載體的構(gòu)建示意圖。1、1kbladders；2-7、不同的細(xì)菌克隆。
圖3顯示了雌激素受體β在15-24月齡小鼠肝臟及腫瘤分布示意圖。1、野生型(♂)；2、野生型(♀)；3、p21HBsAg/+(♂)；4、3的腫瘤；5、p21HBsAg/+(30月，♀)；6、5的腫瘤；7、p21HBsAg/+(♀)；8、p21HBsAg/HBsAg(♂)；9、8的腫瘤；10、p21HBsAg/ HBaAg(♀)；11、p21HBsAg/HBsAg(30月，♀)；12、11、的腫瘤；13、p21HBx/+(♂)；14、p21HBx/+(♂)；5、14的腫瘤；16、p21HBx/HBx(♂)；17、p21HBx/HBx(♀)。
本發(fā)明的第一方面是構(gòu)建小鼠肝細(xì)胞癌的動物模型，具體步驟見文獻(xiàn)(8)。
本發(fā)明的第二方面是制備雌激素受體β的cDNA片段，包括以下步驟利用Trizol提取小鼠睪丸中的總RNA，將1μg小鼠睪丸總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以小鼠睪丸cDNA為模板，用引物1(5’-GGTATCATTACGGTGTCTGGT-3’)和引物2(5’-CTGTCACTGCGTTCAATAGGT-3’)擴(kuò)增出831bp的雌激素受體β的cDNA片段，將cDNA片段連入pGEM-T Easy Vector中，測序正確后，用EcoRI進(jìn)行酶切，回收850bp左右的片段。
本發(fā)明的第三方面是利用Northern Blot檢測雌激素受體β在小鼠的表達(dá)情況，具體方法如下用Trizol提取小鼠肝臟及腫瘤的總RNA，取20μg總RNA進(jìn)行瓊脂糖甲醛變性膠電泳，通過毛細(xì)轉(zhuǎn)移法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。以雌激素受體β基因片段為探針進(jìn)行Northern blot雜交，發(fā)現(xiàn)雌激素受體β基因在HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟腫瘤有表達(dá)，而在野生型小鼠的肝臟、HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟、HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟及腫瘤均未發(fā)現(xiàn)雌激素受體β基因的表達(dá)。
本發(fā)明人利用HBV的表面抗原基因(HBsAg)及X基因(HBx)定位整合致肝細(xì)胞癌小鼠(8)進(jìn)行分子生物學(xué)分析。通過Northernblot雜交檢測了不同年齡階段野生型小鼠的肝臟及轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟及腫瘤的雌激素受體β基因的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)雌激素受體β基因僅在HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟腫瘤有表達(dá)，而在野生型小鼠的肝臟、HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟、HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟及腫瘤均未發(fā)現(xiàn)雌激素受體β基因的表達(dá)。說明雌激素受體β與HBV的表面抗原基因(HBsAg)引起的肝細(xì)胞癌密切相關(guān)，為HBV的表面抗原基因(HBsAg)相關(guān)的肝細(xì)胞癌的診斷及治療提供了可能的靶分子。
本文中所提到的對比文獻(xiàn)的全部內(nèi)容均引入本文以供參考。
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。但是，這些實(shí)施例并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的任何限定。
實(shí)施例1小鼠組織總RNA的提取1、將小鼠組織(肝臟和睪丸等)100mg放入2ml Trizol中，用勻漿器進(jìn)行勻漿，于室溫培養(yǎng)5分鐘。
2、加入0.4ml氯仿，蓋緊瓶蓋劇烈振蕩15秒，放置2-3分鐘。2-8℃，10000-12000g離心15分鐘。
3、將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入1ml異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘，2-8℃，10000-12000g離心10分鐘。
4、棄上清，加入至少2ml 75％的異丙醇洗滌，2-8℃，不大于7500g離心5分鐘。
5、棄上清，空氣干燥5-10分鐘，加入無RNase的水500μl，反復(fù)抽吸使RNA溶解。55-60℃保溫10分鐘，-70℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2cDNA的合成采用TaKaRa公司的mRNA Selective PCR Kit(AMV)Ver 1.1系統(tǒng)，方法為1、在離心管中混合下列溶液。

2、按下列條件進(jìn)行反應(yīng)
30℃10分鐘45℃30分鐘5℃ 5分鐘實(shí)施例3雌激素受體β基因片段的獲得1、以小鼠睪丸的cDNA為模板，用引物1(5’-GGTATCATTACGGTGTCTGGT-3’)和引物2(5’-CTGTCACTGCGTTCAATAGGT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃變性3分鐘，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 90秒，循環(huán)反應(yīng)30次，結(jié)果如圖2所示。
2、將PCR產(chǎn)物1μl連入pGEM-T Easy Vector中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)，用IPTG和X-gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色克隆，提取質(zhì)粒，并用EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖1所示。
3、將酶切鑒定正確的質(zhì)粒，進(jìn)行測序，測序引物為T7引物，結(jié)果為5’-GGTATCATTACG GTGTCTGGTC CTGTGAAGGA TGTAAGGCCT TTTNTAAAAGAAGCATTCAA GGACATAATG ACTATATCTG TCCAGCCACG AATCAGTGTACAATAGACAA GAACCGGCGT AAAAGCTGCC AGGCCTGCCG ACTTCGCAAGTGTTACGAAG TAGGAATGGT CAAGTGTGGA TCCAGGAGAG AAAGGTGTGGGTACCGAATA GTACGAAGAC AGAGAAGTGC CAGCGAGCAG GTGCATTGCCTGAACAAAGC CAAGAGAACC AGTGGGCACA CACCCCGGGT GAAGGAGCTACTGCTGAACT CTCTGAGTCC CGAGCAGCTG GTGCTCACCC TGCTGGAAGCTGAGCCACCC AATGTGCTAG TGAGCCGTCC CAGCATGCCC TTCACCGAGGCCTCCATGAT GATGTCCCTC ACGAAGCTGG-3’。
4、測序正確的質(zhì)粒，用EcoRI進(jìn)行酶切，回收850bp左右的片段，采用Promega公司的WizardDNA Clean-Up System進(jìn)行回收。具體方法參見試劑盒說明書。
實(shí)施例4Northern雜交檢測雌激素受體β基因在小鼠的肝臟及腫瘤中的表達(dá)1、將1.5g瓊脂糖溶于117.2mlDEPC處理過的水中，冷卻至70℃，加入3.5μl 10mg/ml的溴化乙錠(EB)，30ml 5×MOPS(0.1mol/lMOPS(pH7.0)，40mmol/l乙酸鈉，5mmol/lEDTA(pH8.0))及2.8ml40％甲醛溶液。
2、將20μgRNA加入3倍體積的加樣緩沖液(6.7ml甲酰胺，2.2ml40％甲醛，1320μl 10×MOPS，20μl 20mg/ml溴酚藍(lán))中，60℃處理10分鐘，冰浴迅速冷卻，上樣。
3、120-160v電壓電泳2-3小時，每半小時混合電泳兩極的電泳緩沖液，溴酚藍(lán)距加樣孔8cm停止電泳。
4、電泳完畢的膠在20×SSC中浸泡兩次，每次15分鐘。
5、用20×SSC將RNA從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用2×SSC洗膜5分鐘。
6、紫外交聯(lián)(1200μW/cm2)2分鐘，80℃烤膜45分鐘。
7、采用Promega公司的Primer A Labeling System(Cat #U1100)標(biāo)記探針，方法為將待標(biāo)記的DNA片段與95-100℃煮2分鐘，迅速冰浴冷卻，在1.5ml離心管中混合下列溶液表1

加無核酸酶的水至50μl，混勻。室溫放置1小時。煮沸2分鐘，冰浴驟冷，加EDTA至終濃度20mM，終止反應(yīng)，待用。
8、膜于6×SSC中浸泡5分鐘。將膜置于預(yù)雜交液(6×SSC，2×Denhardt，0.1％SDS，100μg/ml的變性鮭魚精DNA)中，65℃預(yù)雜交2小時，將標(biāo)記好的探針加入預(yù)雜交液中，65℃雜交18小時以上。
9、將膜置于1×SSC，0.1％SDS中室溫洗20分鐘，隨后將膜置于0.2×SSC，0.1％SDS中，65℃洗膜3次，每次20分鐘。
10、膜稍事干燥，置于X光片下，-70℃曝光。
10、洗片。
結(jié)果如圖3所示。
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8.一種定位整合乙型肝炎病毒致肝細(xì)胞癌的小鼠模型。楊曉王友亮 崔芳 呂婭歆 黃翠芬 申請?zhí)?2117467.9。
權(quán)利要求
1.一種用于肝細(xì)胞癌早期診斷的分子——雌激素受體β，其特征在于在表達(dá)HBsAg的肝細(xì)胞腫瘤中過度表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的分子，作為肝細(xì)胞癌藥物篩選的靶向分子。
3.權(quán)利要求1的分子，作為肝細(xì)胞癌藥物治療的靶向分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于肝細(xì)胞癌早期診斷的分子——雌激素受體β，它特異表達(dá)于HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟腫瘤中。
文檔編號G01N33/574GK1508267SQ0215669
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者楊曉, 王友亮, 崔芳, 黃翠芬, 楊 曉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工