一種LAMP法檢測(cè)石蠟包埋肝組織中HBV cccDNA的引物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種LAMP法檢測(cè)石蠟包埋肝組織中HBV cccDNA的引物及試劑盒，方法包括(1)先利用PSAD酶消化rcDNA，提高檢測(cè)的特異性。(2)再用Bst酶環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增cccDNA，該酶特異性較高，擴(kuò)增效率也較高，提高敏感性和特異性的目的，本發(fā)明方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
【專利說明】-種LAMP法檢測(cè)石蠟包埋肝組織中HBV cccDNA的引物和 試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種LAMP法檢測(cè)石蠟包埋肝組織中 HBV cccDNA的方法和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前臨床應(yīng)用最多的檢測(cè)乙肝病毒的指標(biāo)是血清中HBV DNA的檢測(cè)，但是許多臨 床和實(shí)驗(yàn)研究表明，一些乙肝病人應(yīng)用抗病毒藥物治療后血液檢查HBV DNA雖然已經(jīng)呈陰 性，但是肝組織炎癥活動(dòng)度并未緩解，還有部分患者出現(xiàn)耐藥而導(dǎo)致反跳現(xiàn)象，這是因?yàn)榛?者病毒復(fù)制的"老巢（HBV cccDNA池）"并未被清除，因此檢測(cè)HBV cccDNA是評(píng)價(jià)抗HBV 療效的或臨床治療終點(diǎn)的一項(xiàng)重要標(biāo)準(zhǔn)，也是評(píng)價(jià)HBV感染狀態(tài)及傳染性的客觀指標(biāo)。由 于肝組織來源困難，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于HBV cccDNA的研究多為血清，各實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也不盡 相同，對(duì)于外周血單核細(xì)胞到底存在HBV cccDNA與否說法不一，但是對(duì)于肝組織中存在 HBV cccDNA池，得到了許多研究者的證實(shí)[1]。目前尚沒有可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，能清除HBV cccDNA的藥物，這也是現(xiàn)有抗病毒藥物療效不佳且易復(fù)發(fā)的原因之一。肝臟以外器官組織 可能存在HBV cccDNA，成為肝移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)的來源[2]。目前還沒有穩(wěn)定可靠的的敏 感的HBV cccDNA檢測(cè)試劑盒?；谝陨嫌^點(diǎn)，提出利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)法用于檢 測(cè)乙型肝炎病毒患者肝組織HBV cccDNA，為研究乙型肝炎致病機(jī)制和評(píng)價(jià)抗病毒藥物療效 提供一種簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法。
[0003] 目前HBV cccDNA的檢測(cè)方法有以下幾種：①選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光 PCR)選擇性PCR根據(jù)HBV DNA與HBV cccDNA結(jié)構(gòu)上的差異，通過設(shè)計(jì)一對(duì)特殊的跨雙缺 口引物，選擇性的只擴(kuò)增cccDNA，松弛環(huán)狀的（rcDNA)不被擴(kuò)增；由于PCR產(chǎn)物自身退火的 原因?qū)е麓朔N方法并非萬(wàn)無(wú)一失。②選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR[3]，與定性方法相比較增加 了與cccDNA負(fù)鏈（rcDNA負(fù)鏈缺口下游）互補(bǔ)的熒光探針，使cccDNA能夠檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào) 而rcDNA不能被檢測(cè)，此種方法同樣存在PCR產(chǎn)物自身退火而引起松弛環(huán)狀的（rcDNA)被 擴(kuò)增，且在HBV DNA >108拷貝/ml，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。③侵入者探針法。使用侵入探針和 引物探針，通過裂解酶特異性切割5'端堿基片段使之與熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒結(jié)合，裂解酶 再切割熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒上熒光基團(tuán)的短臂，發(fā)出熒光信號(hào)。其特點(diǎn)是一個(gè)模板可重復(fù) 使用，結(jié)合-裂解-結(jié)合-裂解，循環(huán)一次產(chǎn)生一次信號(hào)，呈線性信號(hào)放大。優(yōu)點(diǎn)是特異性 較強(qiáng)，缺點(diǎn)是敏感性較差，低于IO 4拷貝/ml無(wú)法檢測(cè)。④滾環(huán)聯(lián)合熒光定量擴(kuò)增法[7]。 有學(xué)者針對(duì)cccDNA為共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA，提出用phi29酶（只擴(kuò)增環(huán)狀DNA的一種酶） 來擴(kuò)增環(huán)狀的cccDNA，然后用熒光定量來達(dá)到檢測(cè)的目的，其優(yōu)點(diǎn)是特異性、敏感性均較 高，但是由于滾環(huán)擴(kuò)增是在恒溫的狀態(tài)下進(jìn)行16-18小時(shí)的擴(kuò)增，因此耗時(shí)較長(zhǎng)，且phi29 酶的價(jià)格亦較昂貴，用于臨床可能會(huì)增加患者的負(fù)擔(dān)。⑤原位滾環(huán)擴(kuò)增法。為使擴(kuò)增的HBV cccDNA能夠直觀可見，周冬青等[4]用肝組織的石蠟包埋切片采用PSAD酶消化后再用原位 滾環(huán)擴(kuò)增聯(lián)合原位PCR的方法檢測(cè)肝組織中的HBV cccDNA，研究雖然證實(shí)了肝組織中確實(shí) 存在HBV cccDNA，具有直觀、可靠、形象的優(yōu)點(diǎn)，但是原位滾環(huán)擴(kuò)增對(duì)技術(shù)要求過高，且操作 亦較繁瑣，直接用于臨床其難度較大。
[0004] 王麗等在《DNA環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法在快速鑒定病原微生物中的應(yīng)用》一文提出 LAMP對(duì)于病原微生物的鑒定具有高效率、高特異性、高敏感性特點(diǎn)[5]。
[0005] 熊新華在《DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在乙型肝炎病毒表面抗原基因檢測(cè)中的應(yīng)用》 一文中認(rèn)為環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)能快速、特異地檢測(cè)乙肝病毒表面抗原基因，且實(shí) 驗(yàn)儀器簡(jiǎn)單，不需要特殊的設(shè)備[6]。
[0006] 俞勇等在嘗試使用RT (逆轉(zhuǎn)錄）-LAMP用于輸血前檢測(cè)HCV RNA的研究中發(fā)現(xiàn)，與 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)抗HVC相比，RT-LAMP檢測(cè)HCV的方法具有快速、靈敏度高的特點(diǎn)[7]。
[0007] Cai Z等在2011年的《臨床病毒學(xué)》雜志中發(fā)表了《一種新的環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增基因型 技術(shù)用來檢測(cè)乙型肝炎病毒基因型B型和C型》一文，文中詳細(xì)介紹了 LAMP在檢測(cè)乙型肝 炎病毒基因型方面的應(yīng)用[8]。
[0008] Cai T等將LAMP作為HBV DNA定量檢測(cè)和管理的一種新工具，并進(jìn)行評(píng)估[9]。
[0009] Wang C等用RT-LAMP快速檢測(cè)丁型肝炎的基因型，獲得了成功，達(dá)到了預(yù)期的實(shí) 驗(yàn)?zāi)康腫10]。
[0010] 在Tsugunori Notomi等的《DNA的環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增術(shù)》一文中，明確指出LAMP對(duì)于擴(kuò) 增靶序列具有高度的敏感性[11]。
[0011] 雖然已有許多專家對(duì)HBV cccDNA的檢測(cè)進(jìn)行了大量的研究，也有許多研究人員利 用LAMP來檢測(cè)各種病原微生物1但是將LAMP用于HBV cccDNA的檢測(cè)尚缺乏報(bào)道。
[0012] 參考文獻(xiàn)：
[0013] [1]成軍1等，現(xiàn)代肝炎病毒分子生物學(xué)IM1，第二版，科學(xué)出版社，122-127.
[0014] [2]王笑梅，蘭孟東，郎振為，等，肝移植術(shù)后肝組織中HBVcccDNA的表達(dá)及臨床意 義中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志丄2008, 28 (12) :1028-1030二
[0015] [3]李華東，江建寧，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBVcccDNA臨床應(yīng)用研究醫(yī)學(xué)研 究，2007,12 :10-12.
[0016] [4]任曉強(qiáng)，蘇何玲，鄒正升，等，滾環(huán)擴(kuò)增在乙型肝炎病毒cccDNA檢測(cè)中的應(yīng)用 「T1,解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2009,34 (6) :675-677二
[0017] [5]王麗，石磊，李琳，DNA環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法在快速鑒定病原微生物中的應(yīng)用 「T1,牛命化學(xué)，2006,26 (5) =462-465.
[0018] [6]熊新華，DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在乙型肝炎病毒表面抗原基因檢測(cè)中的應(yīng) 用「T1,實(shí)駘預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010,2 :240-242二
[0019] [7]俞勇，鄧丹菲，環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在輸血前HCV檢測(cè)中的應(yīng)用LIk中 國(guó)輸血雜志，201U24(12) :1060-1062二
[0020] [8] Cai Z, _LouG, _CaiT, _YangJ, _WuN, _Development of a novel genotype-specific loop-mediated isothermal amplification technique for hepatitis B virus genotypes B and C genotyping and quantification, J, Journal of clinical virology, 2011, 52(4) :288-294
[0021] [9] Cai T, _Lou G, YangJ, _Xu D, _Meng Z, Development and evaluation of real-time loop-mediated isothermal amplification for hepatitis B virus DNA quantification:a new tool for HBV management,J, Journal of clinical virology, 2008, 41(4):270-276^
[0022] [10]ffang C, _Shen X, _Lu J, _Zhang LjDevelopment of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) system for rapid detection of HDV genotype, J, letters in applied microbiology, 2013, 56(3):229-235
[0023] [11] Tsugunori Notomi, _Hiroto Okayama, _Harumi Masubuchi, et al, _ Loop-mediated isothermal amplification of DNA, 2000, 28 (12) : 1-7二


【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種LAMP法檢測(cè)石蠟包埋肝組織中HBV cccDNA的方 法和試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)中HBV cccDNA檢測(cè)的不足。
[0025] 發(fā)明目的：由于肝組織收集困難，目前國(guó)內(nèi)大多使用外周血來檢測(cè)HBV CccDNAi 由于HBV cccDNA主要存在肝組織，因此檢測(cè)肝組織HBV cccDNA更為精確，目前國(guó)內(nèi)外HBV cccDNA的檢測(cè)存在特異性及靈敏性不高的問題，為解決此問題也有部分學(xué)者用滾環(huán)擴(kuò)增檢 測(cè)肝組織中HBV cccDNA，但是所使用的提取試劑盒、滾環(huán)擴(kuò)增的酶均為國(guó)外生產(chǎn)，而且耗時(shí) 較長(zhǎng)，操作復(fù)雜，需要專門的熒光定量PCR儀或者原位PCR儀器，因此臨床上尚無(wú)一種國(guó) 家批準(zhǔn)的應(yīng)用于臨床的HBV cccDNA檢測(cè)試劑，為解決以上問題，建立一種簡(jiǎn)便易行的HBV cccDNA檢測(cè)方法，參考國(guó)際前沿技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種較完善的檢測(cè)方法：先利用PSAD酶消化 rcDNA (cccDNA對(duì)此酶抵抗），再用Bst酶環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增cccDNA (該酶特異性和擴(kuò)增效率均較 高），達(dá)到檢測(cè)乙型肝炎病毒患者肝組織HBV cccDNA的目的i經(jīng)過PSAD酶消化后去除部分 非共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，再用LAMP法擴(kuò)增HBV cccDNA，從而保證檢測(cè)方法的特異性和靈敏度。 為臨床診斷和選擇更合理的抗病毒治療方案提供依據(jù)，使乙肝治療更加經(jīng)濟(jì)、安全、可靠， 為HBV cccDNA的檢測(cè)提供了一個(gè)敏感性和特異性均較好的切實(shí)可行的操作方法，為臨床的 應(yīng)用和發(fā)展提供了重要的手段。
[0026] 雖然近年來HBV cccDNA的研究成為研究的熱點(diǎn)，但是目前對(duì)于HBV cccDNA的研 究和開發(fā)尚屬初步階段，檢測(cè)技術(shù)難度較大；前期研究主要集中于細(xì)胞模型和肝臟模型，不 能滿足臨床檢驗(yàn)的需求；而現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的靈敏度不高，檢測(cè)低限為IO 4拷貝/ml ;部分研 究機(jī)構(gòu)和學(xué)者對(duì)檢測(cè)技術(shù)的特異性認(rèn)識(shí)不足，存在缺陷；而cccDNA的檢測(cè)又有許多難點(diǎn)問 題尚未解決，多種同源的乙肝病毒DNA分子并存（cccDNA、rcDNA、ssDNA、HBV整合的DNA)， 必須有效的分離cccDNA和其他DNA，才能提高檢測(cè)的特異性，由于細(xì)胞內(nèi)cccDNA含量較低， 僅為5-60拷貝/細(xì)胞，必須提高敏感性才能達(dá)到檢測(cè)的目的。為進(jìn)一步的完善檢測(cè)技術(shù)和 解決難點(diǎn)問題，提高HBV cccDNA應(yīng)用價(jià)值及發(fā)展前景，本項(xiàng)目采取以下措施來通過提高其 靈敏性和特異性達(dá)到完善檢測(cè)方法目的。（1)先利用PSAD酶消化rcDNA (cccDNA對(duì)此酶抵 抗），提高檢測(cè)的特異性。（2)再用Bst酶環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增cccDNA(該酶特異性較高，擴(kuò)增效率 也較高），提高敏感性和特異性的目的，因?yàn)長(zhǎng)AMP具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
[0027] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：
[0028] 1、靈敏度可以達(dá)到1拷貝/細(xì)胞；
[0029] 2、特異性：陽(yáng)性對(duì)照2例均為陽(yáng)性，陰性對(duì)照3例均為陰性」
[0030] 3、重復(fù)性：5例樣本使用同一方法檢測(cè)，結(jié)果無(wú)明顯差異。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例LcccDNA提取和分離
[0033] 為解決肝組織來源困難，發(fā)明人采用病理科石蠟何埋的肝纟目織,這樣可以利用病 理科常規(guī)檢測(cè)剩余的標(biāo)本，病人無(wú)需特意為了檢測(cè)而進(jìn)行肝穿刺，因此減少了病人痛苦和 經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為了解決從石蠟包埋組織中提取DNA時(shí)，使用二甲苯造成對(duì)環(huán)境的污染和個(gè)人 健康的影響，采用天恩澤公司生產(chǎn)的石蠟組織快速提取試劑盒，該試劑盒采用特殊的脫蠟 方式和裂解條件釋放組織中的DNA，整個(gè)過程不涉及有機(jī)試劑二甲苯，安全可行、簡(jiǎn)單快速。
[0034] 第一次#用前應(yīng)桉照試劑標(biāo)簽的說明在⑶和PW中加入無(wú)水乙醇，所有離心步驟 詢?yōu)榕_(tái)式離心機(jī)在室淵下離心。
[0035] 提取的操作步驟：
[0036] (1)取石錯(cuò)切片(5-10 μ m, l*lcm大?。?-8張，裝于I. 5ml無(wú)菌離心管中，加入 50〇iLl裂解液GL，再加入5〇iLlGPjglj烈渦旋10秒。
[0037] m金屬浴98°C孵育30分，期間顛倒混勻3次，直至樣品完全溶解。（注意水浴用 長(zhǎng)鑷子操作，防止?fàn)C傷i
[0038] (3) 12000rpm 室溫離心 5 分鐘。
[0039] M用20〇iLl槍頭沿管壁小心吸取中間層的水相清液于新的離心管中（上層是石 蠟及蛋白混合物，下層為少許雜質(zhì)沉淀，如果分層不徹底可以延長(zhǎng)離心時(shí)間，直至上層混合 物和水相清液很好分開）。
[0040] 151加入2倍體積的無(wú)水乙醇（例如：45〇iLl水相清液加入90〇iLl無(wú)水乙醇）， 充分混勻，靜置3分鐘。
[0041] M將上一步所得的混合液加入一個(gè)吸附柱CR2中，8000rpm室溫離心2分姓，倒 掉收集管中的廢液，重新將吸附柱放回收集管中。（注意：吸附柱最大容量為700JL1，可將 剩余液體重復(fù)上述步驟上柱）
[0042] ill向吸附柱CR2中加入50〇iLl緩沖液GDJOOOrpm室溫離心1分鐘，倒掉收集管 中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
[0043] 向吸附柱CR2中加入60〇iLl漂洗液PWJOOOrpm室溫離心1分鐘，倒掉收集管 中廢液，將吸附柱放回收集管中。
[0044] M重復(fù)上述步驟8,將吸附柱放回收集管中，12000rpm，離心2分鐘，倒掉廢液。將 吸附柱開蓋置于室溫放置2-5分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。（注：晾干要確 保乙醇揮發(fā)干凈，但也不要干燥時(shí)間太久，以免難以洗脫DNA)
[0045] 將吸附柱CR2轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附柱膜的中間部位懸空滴加 65°C預(yù)熱的30-100iLl洗脫緩沖液TE或CldH 2O洗脫DNA，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離 心2分鐘，將收集有DNA的離心管-20°C保存。（注：雙蒸水需調(diào)制PH7. 0-8. 0)
[0046] 收集病理科常規(guī)檢測(cè)剩余肝組織標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本切取5-8片組織切片，每片厚度 為4-6微米，放入I. 5ml的離心管中，使用石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒，按照說明書 的操作步驟提取肝組織DNA，吸取樣本提取DNA6. 8iU，采用質(zhì)粒安全的ATP依賴性DNA酶 (PSAD酶，2u)進(jìn)行消化，該酶具有去除線性和非閉合環(huán)狀DNA的作用，因此能去除線性DNA 和松弛環(huán)狀的0嫩(代0嫩)1而cccDNA由于沒有缺口，此酶無(wú)結(jié)合位點(diǎn)，故不起作用從而保 留cccDNA。PSAD酶試劑盒由中北林格公司提供，使用PSAD酶消化的主要操作方法如下：取 10Xbuffer2. 2 u 1.ATP0. 8 u 1.PSAD 酶 0. 2 u I (2u)加入抽提的 DNA6. 8u 1 中，# 總體積為 1〇μ 1,放入金屬浴在37°C條件下，反應(yīng)30分鐘，70°C 10分鐘滅活，達(dá)到去除其他DNA而保 留cccDNA的目的^
[0047] _實(shí)施例2jcccDNA檢測(cè)
[0048] 為了解決檢測(cè)HBVcccDNA特異性、靈敏性不高的問題，我們參考國(guó)內(nèi)外前沿技術(shù) 采用PSAD酶消化，去除部分rcDNA的影響，然后采用根據(jù)負(fù)鏈rcDNA有缺口，而cccDNA沒 有缺口的DNA序列，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法專用引物設(shè)計(jì)輔助軟件設(shè)計(jì)五條環(huán)介導(dǎo)引物， FIP、BIP兩種引物HPLC純化級(jí)別的合成引物，采用Bst酶在恒溫的情況下進(jìn)行擴(kuò)增，這五 條環(huán)介導(dǎo)引物具體序列為：
[0049] 序列 I :F3ACCAGCACCATGCAACTT
[0050] 序列 2 :B3CGAGGAGATCTCGAATAGAAGG
[0051] 序列 3 :FIP F1-AGGCACAGCTTGGAGGCTT-F2-CACCTCTGCCTAATCATCTCAT
[0052] 序列 4 :BIP B1-GTGGCTTTGGGGCATGGAC-B2-GTCAGAAGGCAAAAAAGAGAGT
[0053] 序列 5 :LB AAITTGGAGCTTCTGTGGAGTT
[0054] 擴(kuò)增的溫度、時(shí)間、儀器等條件參數(shù)為：使用北京藍(lán)譜公司提供的日本榮研株式會(huì) 社開發(fā)的通用型LAMP試劑盒，首先將設(shè)計(jì)并合成的引物進(jìn)行稀釋，引物稀釋濃度如下：將 F3、B3 引物 lOOiLmol/L 稀釋至 5jLmol/L、FIP 和 BIP 引物 lOOiLmol/L 稀釋至 4〇iLmol/L、 LB 引物 lOOiLmol/L 稀釋至 2〇iLmol/L。然后取 2 XbufferIOjlI(含 dNTP、Tris_HCL、KCL、 MgS04、（NH4) 2S04、Tween20、Betaine混合液）、加入稀釋的5條引物各UU，BstDNA聚合酶 UU、經(jīng)過PSAD酶消化后的DNAlOiU,雙蒸水4iLl，總計(jì)體積3〇iU，將配制好的反應(yīng)試管 短暫混勻瞬間離心后置于金屬浴或?qū)崟r(shí)濁度儀中63°C恒溫30-60分鐘，80°C下5分鐘。
[0055] 擴(kuò)增后可目視檢測(cè)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增具有高特異性的特征，在具 有相似堿基序列的不同基因中選擇性地針對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，每次基因復(fù)制都會(huì)對(duì)DNA 雙鏈的正反兩個(gè)方向的單核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行校正，能夠嚴(yán)格區(qū)分單一堿基的差異，而且環(huán)介 導(dǎo)擴(kuò)增效率極高，可在15分-1小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)IO 9-IOltl倍擴(kuò)增，由于有著高度的特異性，只需 根據(jù)產(chǎn)物有無(wú)即可對(duì)靶基因序列的存在與否作出判斷。
[0056] 為解決HBV cccDNA檢測(cè)成本較高而且費(fèi)時(shí)、操作復(fù)雜的問題,我們特異使用環(huán)介 導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，因?yàn)樗恍枰獙ｉT的熒光定量PCR儀或者原位PCR儀，操作簡(jiǎn)單不需要使雙鏈 DNA先變性成單鏈，只需一臺(tái)恒溫水浴箱，或者一臺(tái)金屬浴15分鐘-1小時(shí)即可完成擴(kuò)增，從 提取DNA到擴(kuò)增結(jié)束，整個(gè)過程3個(gè)小時(shí)內(nèi)即可完成。
[0057] 技術(shù)方案及原理：然后采用根據(jù)負(fù)鏈rcDNA有缺口，而cccDNA沒有缺口的DNA序 列以及缺口下游部分設(shè)計(jì)五條環(huán)介導(dǎo)引物，保證擴(kuò)增的產(chǎn)物為cccDNA，最后使用環(huán)介導(dǎo)等 溫?cái)U(kuò)增，根據(jù)LAMP法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，用Bst酶在恒溫的情況下進(jìn)行LAMP擴(kuò) 增，反應(yīng)過程中產(chǎn)生白色焦磷酸鎂沉淀，故擴(kuò)增后可目視有無(wú)白色渾濁對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，也 可在反應(yīng)過程中加入鈣黃綠素，陽(yáng)性呈黃綠色，經(jīng)濟(jì)條件好的單位還可使用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì) 渾濁度進(jìn)行測(cè)定，從而進(jìn)行相對(duì)定量。
[0058] 實(shí)施例確度判定
[0059] 使用本方法檢測(cè)30例HBV感染患者，其中陽(yáng)性患者為17例，陽(yáng)性率56. 67% ;將 這30例患者使用現(xiàn)有的技術(shù)（PSAD酶消化+熒光定量實(shí)時(shí)PCR)檢測(cè)，陽(yáng)性患者為12例 (< IO3難以檢測(cè)），陽(yáng)性率為40%。
[0060] 實(shí)施例h特異性實(shí)驗(yàn)
[0061] 取3例非乙肝肝組織作為陰性對(duì)照，其中1例HBV血清免疫標(biāo)志物和血清HBV DNA 均為陰性的丙型肝炎患者肝組織切片、1例HBV血清免疫標(biāo)志物和血清HBV DNA均為陰性的 酒精性肝硬化患者肝組織切片，以及1例正常肝組織（供肝），結(jié)果均為陰性。
[0062] 實(shí)施例^靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0063] 使用HBV cccDNA質(zhì)粒，采用梯度稀釋方法，稀釋范圍在IO2-IOici進(jìn)行檢測(cè)，最低檢 測(cè)限為1拷貝/細(xì)胞。
[0064] 實(shí)施例L重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
[0065] 將5例樣本，用本方法重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果相同。
【權(quán)利要求】
1. 一種LAMP法檢測(cè)石蠟包埋肝組織中HBV cccDNA的引物，其特征在于，何括:
2. -種LAMP法檢測(cè)石蠟包埋肝組織中HBVcccDNA的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要 求1所述的序列。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種LAMP法檢測(cè)石蠟包埋肝組織中HBV cccDNA的試劑盒，其 特征在于，其使用方法包括如下步驟： 1) 提供權(quán)利要求1所述的引物； 2) 提取石蠟包埋肝組織樣本中的DNA ; 3) 采用PSAD酶進(jìn)行消化，去除線性DNA和rcDNA，保留cccDNA ; 4) 用Bst酶在恒溫的情況下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)過程中產(chǎn)生白色焦磷酸鎂沉淀作為結(jié) 果判定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104372106SQ201410453981
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】周冬青, 王春穎, 劉成永, 王驥, 張克球, 劉加彬, 楊友國(guó), 李 瑞, 黃海濱, 成松, 季昊坤 申請(qǐng)人:徐州市傳染病醫(yī)院