一種通過體外小分子誘導(dǎo)培養(yǎng)尿源性多潛能干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過體外小分子誘導(dǎo)培養(yǎng)尿源性多潛能干細(xì)胞的方法，包括從人尿液樣品中獲得尿源性細(xì)胞，對得到的原代細(xì)胞進行體外小分子誘導(dǎo)和培養(yǎng)獲得貼壁生長的P1代hUSCs克隆，挑取生長狀態(tài)良好的hUSCs克隆進行接種，并繼續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形，狀態(tài)良好的hllSCso采用本方法制備的hUSCs經(jīng)誘導(dǎo)可定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞，對糖尿病下肢缺血模型進行體內(nèi)移植hUSCs，研究結(jié)果表明其能顯著增強缺血部位的血流恢復(fù)和血管新生。本方法制備的hUSCs可應(yīng)用于治療和修復(fù)糖尿病及并發(fā)癥、心腦腎血管疾病、阿爾茲海默癥、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等病變組織與器官的修復(fù)，以及泌尿系統(tǒng)腫瘤預(yù)警與細(xì)胞藥物的篩選。
【專利說明】一種通過體外小分子誘導(dǎo)培養(yǎng)尿源性多潛能干細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多潛能干細(xì)胞的制備方法，特別涉及一種通過體外小分子誘導(dǎo)培 養(yǎng)尿源性多潛能干細(xì)胞（Human Urine-Derived Stem Cells, hUSCs)的方法。本發(fā)明屬于 細(xì)胞生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，

【背景技術(shù)】
[0002] 組織、器官的喪失或功能障礙是人類健康所面臨的主要危害之一，也是人類疾病 和死亡的最主要原因。據(jù)美國的一份資料顯示，每年有數(shù)以百萬計的美國人患有各種組織、 器官的喪失或功能障礙，每年需進行800萬次手術(shù)進行修復(fù)，年住院日在4000- 9000萬之 間，年耗資超過400億美元。近年來，干細(xì)胞領(lǐng)域所取得的一系列重大突破燃起了人類尋找 組織器官再生修復(fù)的希望。
[0003] 干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞。在胚胎和成年組 織中均存在著具有高度更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì) 胞兩大類。目前發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞主要有造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肝臟干 細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、腸上皮干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞等。隨著對干細(xì)胞可塑性認(rèn)識 的深入，其在多組織器官損傷性疾病治療中的應(yīng)用潛能進一步加大。與胚胎干細(xì)胞不同，成 體干細(xì)胞不存在胚胎干細(xì)胞有的移植排斥反應(yīng)、致瘤性及倫理等問題。在體外理想的培養(yǎng) 條件下，將人體多種組織來源的成體干細(xì)胞從組織中提取分離出來，并在體外人工增殖擴 增至治療劑量，經(jīng)合適途徑移植給受者，通過參與受者組織細(xì)胞的替代和再生，修復(fù)病變或 衰老的器官組織結(jié)構(gòu)并重建功能，從而用于治療多種目前尚不能用傳統(tǒng)治療手段治愈的相 關(guān)疾?。禾悄虿〖安l(fā)癥、心腦腎血管疾病、阿爾茲海默癥、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等。從目前完 成的干細(xì)胞臨床試驗表明，成體干細(xì)胞移植在安全性、有效性、穩(wěn)定性等各方面均非常適合 臨床治療的要求，將是未來相當(dāng)一段時期內(nèi)有希望首先從實驗室研究真正走向臨床應(yīng)用的 治療性干細(xì)胞。
[0004] 能夠利用病人自身的干細(xì)胞用于治療具有不發(fā)生誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或排斥的優(yōu)勢，然 而，因為組織特異性的干細(xì)胞數(shù)量稀少，所以很難將它們從器官和組織中分離出來。近來已 有研究利用小分子化合物成功誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞定向分化，包括5-氮雜胞苷（5- &2&-2-de〇XyCytidine5-AZA)，DNA甲基化化酶抑制劑以及作為S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 (S-adenosylhomocysteine hydrolase)競爭性抑制劑的腺苷類似物；研究還發(fā)現(xiàn)通過在培 養(yǎng)過程中添加維生素C可使誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells)的誘導(dǎo)效率提高10倍。
[0005] 目前國內(nèi)關(guān)于hUSCs的研究基本處于空白階段，本發(fā)明利用一種非侵入式的簡單 低成本的方法而非外科手術(shù)，通過體外化學(xué)小分子組合誘導(dǎo)重編程培養(yǎng)獲得尿液源性多潛 能干細(xì)胞。通過體外增殖培養(yǎng)并證實這些干細(xì)胞具有多潛能性，并且通過細(xì)胞移植發(fā)現(xiàn)這 些hUSCs能有效促進糖尿病大鼠缺血下肢的血管新生與血流恢復(fù)。此外，在植入體內(nèi)后未 觀測到腫瘤形成，其安全性與有效性hUSCs可轉(zhuǎn)化于未來臨床應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種通過體外小分子誘導(dǎo)培養(yǎng)尿源性多潛能干細(xì)胞的方 法以及由該方法得到的尿源性多潛能干細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)這些干細(xì)胞具有多潛能性，并且通 過細(xì)胞移植發(fā)現(xiàn)這些hUSCs能有效促進糖尿病大鼠缺血下肢的血管新生與血流恢復(fù)。
[0007] 為了達到以上目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0008] 本發(fā)明的一種通過體外小分子誘導(dǎo)培養(yǎng)尿源性多潛能干細(xì)胞的方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0009] (1)尿源性細(xì)胞的分離
[0010] 將獲取的人尿液樣品進行離心，沉淀用PBS洗1-3遍后，離心，棄上清，用培養(yǎng)液重 懸細(xì)胞，得到尿源性細(xì)胞；
[0011] (2)尿源性細(xì)胞的原代培養(yǎng)
[0012] 將得到的尿源性細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)液的24孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，洗 棄未貼壁的細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，獲得貼壁生長的PO代圓形細(xì)胞；
[0013] (3)化學(xué)小分子誘導(dǎo)重編程獲得Pl代尿源性多潛能干細(xì)胞
[0014] 選擇步驟（2)培養(yǎng)的得到的狀態(tài)佳的細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)液的六孔板中，細(xì)胞 貼壁生長后，采用兩步誘導(dǎo)法，第一步，向培養(yǎng)液中添加5-氮雜-2' -脫氧胞嘧啶核苷 (5-AZA)誘導(dǎo)培養(yǎng)1-3天；第二步，向含有5-氮雜-2' -脫氧胞嘧啶核苷的培養(yǎng)液中添加 3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及維生素C進行誘導(dǎo)，每4天換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)液，10-14天 完成化學(xué)小分子誘導(dǎo)細(xì)胞重編程，獲得貼壁生長的圓形或短梭形且具有無限增殖和多向分 化潛能的細(xì)胞，即為Pl代尿源性多潛能干細(xì)胞克??；
[0015] 其中，5-氮雜-2'-脫氧胞啼陡核苷（5-AZA)、3_Deazaneplanocin A(DZNeP)以及 維生素C的化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別如下所示：
[0016]

【權(quán)利要求】
1. 一種通過體外小分子誘導(dǎo)培養(yǎng)尿源性多潛能干細(xì)胞的方法，其特征在于， 包括以下步驟： (1) 尿源性細(xì)胞的分離 將獲取的人尿液樣品進行離心，沉淀用PBS洗1-3遍后，離心，棄上清，用培養(yǎng)液重懸細(xì) 胞，得到尿源性細(xì)胞； (2) 尿源性細(xì)胞的原代培養(yǎng) 將得到的尿源性細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)液的24孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，洗棄未 貼壁的細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，獲得貼壁生長的PO代圓形細(xì)胞； (3) 化學(xué)小分子誘導(dǎo)重編程獲得Pl代尿源性多潛能干細(xì)胞 選擇步驟（2)培養(yǎng)的得到的狀態(tài)佳的細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)液的六孔板中，細(xì)胞 貼壁生長后，采用兩步誘導(dǎo)法，第一步，向培養(yǎng)液中添加5-氮雜-2' -脫氧胞嘧啶核苷 (5-AZA)誘導(dǎo)培養(yǎng)1-3天；第二步，向含有5-氮雜-2' -脫氧胞嘧啶核苷的培養(yǎng)液中添加 3-Deazaneplanocin A(DZNeP)以及維生素C進行誘導(dǎo)，每4天換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)液，10-14天 完成化學(xué)小分子誘導(dǎo)細(xì)胞重編程，獲得貼壁生長的圓形或短梭形且具有無限增殖和多向分 化潛能的細(xì)胞，即為Pl代尿源性多潛能干細(xì)胞克??； (4) PO代尿源性多潛能干細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 挑選小分子誘導(dǎo)獲得的Pl代尿源性多潛能干細(xì)胞克隆，接種轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)液的6孔 板中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長至90 %融合轉(zhuǎn)移至含有相同培養(yǎng)液的9cm平皿中進行傳代培養(yǎng)， 通過連續(xù)傳代之后，獲得呈現(xiàn)長梭形，狀態(tài)良好的細(xì)胞，即為尿源性多潛能干細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中所述的培養(yǎng)液為含有15% FBS的 KSFM培養(yǎng)液。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)中所述的培養(yǎng)液為含有10% FBS、 100U/ml青霉素以及100mg/ml鏈霉素的KSFM培養(yǎng)液。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)中將得到的細(xì)胞按照500個細(xì)胞/ 孔的密度接種于24孔板中，置于37°C，5 % CO2及飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接種24h后， 洗棄未貼壁的細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，獲得貼壁生長的圓形細(xì)胞。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)中所述的培養(yǎng)液為含有5% FBS的 KSFM以及EFM按照等體積混合的培養(yǎng)液，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)液為含有3-Deazaneplanocin A(DZNeP)、維生素C以及5% FBS的KSFM以及EFM按照等體積混合的培養(yǎng)液。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)中添加5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核 苷使其終濃度達到2-10 μ mol/L，添加3-Deazan印lanocin A (DZNeP)以及維生素C使其終 濃度分別達到1-5 μ mol/L以及10-40 μ g/ml。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4)中初次傳代時間為6-8天，初次傳代 后，按照1 :3的比例轉(zhuǎn)移至含有相同培養(yǎng)液的9cm平皿中進行傳代培養(yǎng)，3-4天傳代一次， 通過連續(xù)傳代5-7代之后，獲得呈現(xiàn)長梭形，狀態(tài)良好的細(xì)胞，即為尿源性多潛能干細(xì)胞， 其中所述培養(yǎng)液為含有5% FBS的KSFM以及EFM按照等體積混合的培養(yǎng)液。
8. 按照權(quán)利要求1-7任一項所述的方法制備得到的尿源性多潛能干細(xì)胞，其特征在 于，所述的尿源性多潛能干細(xì)胞為表達間質(zhì)標(biāo)志⑶29、⑶44、⑶73、⑶90和SSEA-4,不表達 成熟造血細(xì)胞標(biāo)志⑶45及內(nèi)皮標(biāo)志⑶31和⑶133的多潛能干細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求8所述的尿源性多潛能干細(xì)胞在定向誘導(dǎo)細(xì)胞分化中的應(yīng)用，所述細(xì)胞為 脂肪細(xì)胞，成骨細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的尿源性多潛能干細(xì)胞在制備治療糖尿病引起的遠(yuǎn)端血管閉 塞和糖尿病足的藥物中的用途。
【文檔編號】C12N5/079GK104212762SQ201410421813
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】曾強, 陳海旭, 楊超 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院