專利名稱：誘導t細胞細胞因子的表面分子和使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞因子調(diào)節(jié)劑和使用其在單核細胞譜系來源的細胞中調(diào)節(jié)細胞因 子的產(chǎn)生的方法。
背景技術：
眾多的臨床狀況由急性和/或慢性炎癥介導，所述炎癥包括但不限于類風濕性關 節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩病、銀屑病、銀屑病關節(jié)炎、格雷夫斯病(Graves Disease)、自身 免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征、遺傳性蛋白尿綜合征(Hereditary ProteinuriaSyndrome)、I型 糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性甲狀腺炎、肝炎、獲得性免疫缺 陷病(HIV)、移植物抗宿主病、同種異體移植疾病(Allograft Disease)、哮喘、皮膚T細胞 淋巴瘤、HTLV-I-相關皮膚T細胞淋巴瘤、HTLV-II-相關淋巴瘤、毛細胞白血病(Hairy Cell Leukemia)、特發(fā)性⑶4+T淋巴細胞減少癥或黑色素瘤。據(jù)信，牽涉炎癥的機制之一是通過 活化單核細胞譜系來源的巨噬細胞(ΜΦ)上調(diào)細胞因子。例如，已顯示，在損傷中產(chǎn)生的促 炎細胞因子例如腫瘤壞死因子-a (TNFa)和白細胞介素-1 β (IL_1 β )誘導和維持慢性損 傷炎癥。最近，相關動物模型中的研究顯示，T細胞(Τ。)在ΜΦ的活化中起著關鍵作用 ’然 而，已顯示T細胞細胞因子例如白細胞介素-4、10和13 (IL-4、IL-10和IL-13)起著抗炎作 用或只微弱地誘導TNF α /IL-I β上調(diào)。因此，存在對調(diào)控炎癥以治療各種與急性和/或慢性炎癥相關的臨床狀況的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明的一些方面涉及細胞因子調(diào)節(jié)劑和使用其在單核細胞譜系來源的細胞中 調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生的方法。在一些特定的實施方案中，本發(fā)明提供了促炎細胞因子調(diào)節(jié) 劑和使用其在單核細胞譜系來源的細胞(通常為人單核細胞譜系來源的細胞)中調(diào)節(jié)促炎 細胞因子的產(chǎn)生的方法。不受任何理論的束縛，據(jù)信，當單核細胞譜系來源的細胞與不同的 效應τ細胞群體發(fā)生細胞間直接接觸時，它們被活化。在TCISM配體和/或TCISM受體的 水平上控制適應性(即，獲得性)免疫提供了在微生物感染(例如，細菌性皮膚感染)過程 中仍然允許先天免疫的治療性干預。本發(fā)明的一個方面提供了用于在受試者的單核細胞譜系來源的細胞中調(diào) 節(jié)細胞因子的產(chǎn)生的方法，其包括對所述受試者施用細胞因子調(diào)節(jié)劑，其中所述細 胞因子調(diào)節(jié)劑選擇性結(jié)合T淋巴細胞的誘導T細胞細胞因子的表面分子(T-cell cytokine-inducingsurface molecule, TCISM)-配體或單核細胞譜系來源的細胞的相應的 TCISM-受體，由此細胞因子調(diào)節(jié)劑與TCISM-配體或TCISM-受體的選擇性結(jié)合在單核細胞 譜系來源的細胞中調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生。在一些實施方案中，TCISM-配體包含至少一種表1中所列的TCISM-配體(圖 19)。在這些實施方案中，在一些情況下TCISM-配體包括⑶81、⑶21、⑶316、α -烯醇化酶、FKBP4、FKBP多基因家族的其他成員、或其組合。FKBP多基因家族的成員包括但不限于 FKBP12 (FKBPlA)、FKBP12. 6 (FKBPlB)、FKBP13 (FKBP2)、FKBP9 (FKBPll)、FKBP22 (FKBP14)、 FKBP23 (FKBP7)、FKBP25 (FKBP3)、FKBP36 (FKBP6)、FKBP37 (AIP)、FKBP38 (FKBP8)、 FKBP51(FKBP5)、FKBP52(FKBP4)、FKBP60(FKBP9)和 FKBP65(FKBPlO)。在其他實施方案中，單核細胞譜系來源的細胞包括單核細胞譜系來源的巨噬細胞、抗原呈遞細胞(APC)、樹突細胞、郎格漢斯細胞、庫普弗細胞(Kuppfler Cell)或其組
口 O在其他實施方案中，T淋巴細胞是⑶3+T淋巴細胞。在其他實施方案中，被調(diào)節(jié)的細胞因子包括腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介 素-1 β (IL-1 β )、白細胞介素-32 (IL-32)或其組合。在其他實施方案中，TCISM-配體是存在于⑶3+淋巴細胞上的TCISM-配體。在這 些實施方案中，在一些情況下TCISM-配體包括⑶81、⑶21、⑶315、⑶316、α -烯醇化酶、 FKBP、或其組合。示例性 FKBP 包括但不限于 FKBP4、FKBP12 (FKBPlA)、FKBP12. 6 (FKBPlB)、 FKBP13 (FKBP2), FKBP9 (FKBPll), FKBP22 (FKBP14) , FKBP23 (FKBP7) , FKBP25 (FKBP3), FKBP36 (FKBP6)、FKBP37 (AIP)、FKBP38 (FKBP8)、FKBP51 (FKBP5)、FKBP52 (FKBP4)、 FKBP60(FKBP9)和 FKBP65(FKBPlO)。在其他實施方案中，TCISM-受體包括存在于⑶68+抗原呈遞細胞上的TCISM-受 體。在這些實施方案中，在一些情況下TCISM-受體包括⑶81的受體、⑶21的受體、⑶315 的受體、⑶316的受體、α-烯醇化酶的受體、Π(結(jié)合蛋白的受體、或其組合。在一些情況 下，TCISM-受體包括 CD19、CD21、CD225、CD315、CD316、C3dR、CD19、CD81、BCR、CD9、CD81、 KAI1/CD82JK506、雷帕霉素(西羅莫司)、依維莫司、環(huán)孢素、他克莫司、其他合成的小分子 免疫抑制劑的受體，或其組合。一般地，TCISM-受體是指這樣的受體，其存在于單核細胞譜 系來源的細胞上，且當與配體結(jié)合時，其刺激細胞因子在單核細胞譜系來源的細胞中產(chǎn)生。本發(fā)明的另一個方面提供了用于在受試者中治療由急性或慢性炎癥介導的臨床 狀況的方法，該方法包括對所述受試者施用細胞因子調(diào)節(jié)劑，其中細胞因子調(diào)節(jié)劑選擇性 結(jié)合T淋巴細胞的誘導T細胞細胞因子的表面分子(TCISM)-配體或單核細胞譜系來源的 細胞的相應的TCISM-受體，由此細胞因子調(diào)節(jié)劑對細胞因子的產(chǎn)生的調(diào)節(jié)可用于治療由 急性或慢性炎癥介導的臨床狀況。在一些實施方案中，細胞因子調(diào)節(jié)劑選擇性結(jié)合⑶3+淋巴細胞上的TCISM-配體。在其他實施方案中，細胞因子調(diào)節(jié)劑選擇性結(jié)合CD68+單核細胞上的TCISM-受 體。在其他實施方案中，臨床狀況包括自身免疫性疾病。在這些實施方案中，在一些 情況下，自身免疫性疾病包括類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩病、銀屑病、銀屑病關節(jié) 炎、格雷夫斯病、自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征、遺傳性蛋白尿綜合征、I型糖尿病、系統(tǒng)性 紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性甲狀腺炎、肝炎、獲得性免疫缺陷病(HIV)、移 植物抗宿主病、同種異體移植疾病、哮喘、皮膚T細胞淋巴瘤、HTLV-I-相關皮膚T細胞淋巴 瘤、HTLV-II-相關淋巴瘤、毛細胞白血病、特發(fā)性⑶4+T淋巴細胞減少癥或黑色素瘤，或其 組合。本發(fā)明的另一個方面提供了治療受試者的自身免疫性疾病的方法，該方法包括對需要此類治療的受試者施用治療有效量的針對TCISM-配體的拮抗劑或針對相應的 TCISM-受體的拮抗劑。本發(fā)明的另一個方面提供了細胞因子調(diào)節(jié)劑，其可用于通過選擇性結(jié)合 TCISM-配體和/或TCISM-受體來調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生。
附圖概述

圖1是顯示促分裂原刺激的人T細胞可通過細胞間接觸誘導單核細胞THP-I M Φ 分泌促炎細胞因子的圖。圖2是顯示不同的激活刺激物誘導不同的T細胞的"TCISM配體"的活性的圖。圖3是顯示人“細胞因子混合物”在PBMC來源的人T細胞中誘導人TCISM-配體 表達的圖。圖4是顯示細胞因子混合物活化的人PBMC-來源的Pan⑶3+Τ細胞不激活人THP-I 細胞產(chǎn)生TNF-α的圖。圖5是顯示升高的IL-12 (ρ70)由新獲得的人血單核細胞在與TCISM配體-陽性 人CD3+T細胞進行細胞間接觸后產(chǎn)生的圖。圖6是顯示高度純化的經(jīng)刺激的人Hut_78T細胞膜在激活人THP-IM細胞分泌 TNF-α中比用多聚甲醛固定的經(jīng)刺激的Hut-78完整細胞更有效的圖。圖 7 是 PHA/PMA 刺激的 CD3+T 細胞、Hut-78、H9、Molt4、Jurkat & Raji 細胞中的 編碼膜蛋白或膜相關蛋白的基因的微陣列2D簇(cluster)的圖。圖8是闡明潛在的人T細胞TCISM-配體基因候選物的表達水平的雙對數(shù)“特征 (signature)，，基因圖。圖9是測量不同的已知的人T細胞膜共刺激蛋白的PMA/PHA刺激的Hut_78T細胞 或未經(jīng)刺激的Hut-78T細胞的FACS分析的圖。圖10是顯示從被PMA/PHA刺激6小時的Hut_78人T細胞獲得的總RNA的定量實 時PCR(qRT-PCR)測量的圖。圖 11 是顯示抗 IFN- y、CD40L、IFN- y +CD40L、IL-15 或 IL-15 受體(IL-15R)的 中和抗人單克隆抗體不抑制由活化的Hut-78T細胞的純化的膜驅(qū)動的ΤΗΡ-1ΜΦ細胞中的 TNF-α或IL-I β的產(chǎn)生的圖。圖12是抗潮霉素的Flp-In 293細胞的FACS分析的圖。圖13是顯示CD40L+IFN- γ刺激TNF- α產(chǎn)生但不刺激IL-1 β產(chǎn)生(使用f lp_in 分子分析法)的圖。圖14是顯示在一些情況下抑制T細胞介導的TNF α從人M Φ的產(chǎn)生(即，適應性 免疫)，而對LPS-刺激的TNF α和IL-I β的產(chǎn)生(即，先天性免疫)沒有任何作用的圖。圖15是ρ的一個可能的機制的示意圖。圖16是顯示不同的小分子TNFa抑制劑在小鼠的鼠膠原誘導的關節(jié)炎中的評估 的圖。圖17是顯示抗-TNF α和IL-lra治療小鼠的功效的圖。圖18是代表性小鼠的關節(jié)組織病理學切片。圖19是列舉TCISM-配體的表1。發(fā)明詳述據(jù)信，Τ。-誘導的ΜΦ活化的活化機制之一是通過直接的細胞間接觸(通過免疫突 觸機制)?；罨腡細胞表達許多已知的和未知的膜相關蛋白。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，在本文中 稱為誘導Τ。細胞因子的表面分子(即，TCISM或TCISM-配體)的此類分子中的一些分子通 過選擇性結(jié)合存在于M Φ中的相應的TCISM-受體來參與細胞間接觸信號傳導級聯(lián)，從而導 致促炎細胞因子的誘導。眾多的臨床狀況由急性或慢性炎癥介導，所述炎癥包括但不限于類風濕性關節(jié) 炎、多發(fā)性硬化、克羅恩病、銀屑病、銀屑病關節(jié)炎、格雷夫斯病、自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜 合征、遺傳性蛋白尿綜合征、I型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫 性甲狀腺炎、肝炎、獲得性免疫缺陷病(HIV)、移植物抗宿主病、同種異體移植疾病、哮喘、皮 膚T細胞淋巴瘤、HTLV-I-相關皮膚T細胞淋巴瘤、HTLV-II-相關淋巴瘤、毛細胞白血病、 特發(fā)性CD4+T淋巴細胞減少癥和/或黑色素瘤。本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，此類臨床狀況可通過調(diào) 節(jié)單核細胞譜系來源的巨噬細胞中的細胞因子產(chǎn)生(通過施用可選擇性結(jié)合T淋巴細胞的 TCISM-配體和/或單核細胞譜系來源的細胞的相應的TCISM-受體的細胞因子調(diào)節(jié)劑或通 過例如用iRNA或siRNA抑制TCISM-配體的轉(zhuǎn)錄)來治療。
本發(fā)明的一些方面提供了 TCISM-配體和在受試者的單核細胞譜系來源的細胞中 調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生(通過施用選擇性結(jié)合T淋巴細胞的誘導T細胞細胞因子的表面分子 (TCISM)-配體或單核細胞譜系來源的細胞的相應的TCISM-受體的細胞因子調(diào)節(jié)劑或通過 抑制TCISM-配體的轉(zhuǎn)錄)的方法。在一些實施方案中，TCISM-配體包括至少一個表1中所列的TCISM-配體(圖19)。 這些TCISM-配體的相應TCISM-受體可由本領域技術人員容易地確定。例如，通過使用細 胞間接觸生物測定法，使用中和單克隆或多克隆抗體抑制TCISM-配體與TCISM受體的相互 作用。另一個方法是使用經(jīng)刺激的和未經(jīng)刺激的Hut-78和H9亞克隆T細胞膜鑒定阻斷細 胞間接觸的單克隆抗體的消減免疫法(Subtractivelmmunization)。不受任何理論的束縛， 據(jù)信，單核細胞-巨噬細胞的接觸介導的活化是誘導細胞因子產(chǎn)生的主要途徑。因此，該機 制的調(diào)節(jié)，例如，IL-I和TNF- α的產(chǎn)生在觸發(fā)水平上的阻斷或TCISM-配體或TCISM-受體 的表達的抑制(例如，通過siRNA)，可用于治療由細胞因子的產(chǎn)生介導的臨床狀況。本發(fā)明的一些組合物和方法可用于選擇性結(jié)合存在于單核細胞譜系來源的細胞 中的TCISM-受體(或通過抑制這樣的受體的表達或轉(zhuǎn)錄)，從而調(diào)節(jié)細胞因子在此類單核 細胞譜系來源的細胞中的產(chǎn)生。單核細胞譜系來源的細胞包括當被T淋巴細胞活化時產(chǎn)生 細胞因子的任何細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法調(diào)節(jié)促炎細胞因子的產(chǎn) 生。產(chǎn)生細胞因子的示例性單核細胞譜系來源的細胞包括但不限于單核細胞譜系來 源的巨噬細胞、抗原呈遞細胞(APC)、樹突細胞、郎格漢斯細胞和庫普弗細胞。本發(fā)明的組合物和方法包括可選擇性結(jié)合TCISM-配體或TCISM-受體的分子。此 夕卜，本發(fā)明的組合物和方法還包括可調(diào)節(jié)TCISM-配體或TCISM-受體的翻譯、轉(zhuǎn)錄和/或 表達的分子。例如，可對T淋巴細胞施用siRNA以調(diào)節(jié)TCISM-配體的表達。在知道適當 的TCISM-配體的情況下，本領域技術人員可容易地鑒定可調(diào)節(jié)TCISM-配體的表達的適當?shù)膕iRNA。例如，可以用可商購獲得的計算機軟件設計針對編碼全長蛋白質(zhì)的信使RNA的 siRNA，所述計算機軟件使得能夠確定在轉(zhuǎn)錄過程中最易于去穩(wěn)定的mRNA區(qū)段。在TCISM的水平上控制適應性(獲得性)免疫是有利的，因為治療性干預在細菌 性皮膚感染期間允許先天性(天然)免疫。因此，本發(fā)明的一些方面提供了用于調(diào)節(jié)適應 性或獲得性免疫同時基本上保持先天性免疫的組合物和方法。本發(fā)明的示例性TCISM-配體、TCISM-受體和/或細胞因子 調(diào)節(jié)劑化合物包括但不限于具有下式的化合物、其類似物和衍生物
<formula>formula see original document page 8</formula>使用原代人τ細胞及自體新鮮獲得的人血單核細胞或人τ細胞及單核細胞細胞系 建立具有高度重現(xiàn)性和經(jīng)確認有效的細胞間接觸生物測定。圖1是顯示促分裂原刺激的人 T細胞可通過細胞間接觸誘導單核細胞THP-I ΜΦ分泌促炎細胞因子的圖。圖1是細胞間 接觸24h和48h時的細胞因子的時程測量(time course measurement)。將THP-I ΜΦ中 的TNF-α (左圖)和IL-I β (右圖)產(chǎn)物與不同的ΡΜΑ/ΡΗΑ刺激的人T細胞系一起溫育。 將來自單核細胞系THP-I的細胞與高度純化的來自經(jīng)刺激的(“s”)或未經(jīng)刺激的(ns)靜 息T細胞的膜制劑一起溫育；在溫育后24小時或48小時測量細胞因子的產(chǎn)量。在兩個時 期都從與sHut-78和sH9T細胞一起溫育的THP-IM Φ檢測到TNF- α和IL-I β的產(chǎn)量的顯 著增加。提供了一式三份的測量的平均值+/_標準差。如圖1中所顯示的，在ΡΗΑ/ΡΜΑ刺激 的Molt4、Jurkat和Raji細胞中只觀察到TNF- α和IL-I β的產(chǎn)生的少量誘導，而在靜息 原代人T細胞、未受刺激的Hut-78、Η9、Molt4、Jurkat或Raji細胞中未觀察到可檢測的產(chǎn) 量。還觀察到PMA/PHA-刺激的H9細胞和Hut_78細胞(在較低的程度上)誘導了 TNF- α 和IL-I β的最大THP-IM Φ分泌，表明這些細胞是TCISML陽性的。
PMA/PHA刺激物在人T細胞上提供了 TCISML的顯著誘導，因為在24h的培養(yǎng)期后， 在培養(yǎng)物中產(chǎn)生了升高水平的TNF-α。參見圖2。在圖2中，從健康人供體血液分離Pan ⑶3+T細胞，在37°C下刺激6小時，清洗，并用的多聚甲醛固定(6h RT)。然后用PBS漂 洗細胞，在RT下保持過夜。然后加入PBMC-來源的⑶14+ΜΦ，且在37°C下溫育24小時。 將細胞培養(yǎng)物上清液離心，過濾滅菌，然后利用ELISA測量細胞因子水平。顯示了平均值 士SEM(N = 6個單獨的供體，一式三份地測量；P < 0. 05，與未經(jīng)刺激的T細胞相比較)。對 于用aCD3/aCD28體外刺激的T細胞觀察到相當?shù)臄?shù)據(jù)。與單獨的完整T細胞對照培養(yǎng) 物相比較，在T細胞和M Φ共培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生了幾乎2倍的TNF-a。如圖3中所顯示的，結(jié)果顯示細胞因子混合物#1 (IL2+IL6+TNF- a )或 #2(IL15+IL6+TNF-a)活化的人T細胞，當以1 8(血液單核細胞T細胞)的比例混 合時，可激活人單核細胞產(chǎn)生升高水平的TNF-a和IL-I β (大約100-250pg/ml)。這些 細胞因子水平顯著高于由單獨的被細胞因子活化的、固定的T細胞釋放的促炎細胞因子 的水平。在圖3中，從健康人供體分離Pan CD3+T細胞，將其與不同的細胞因子混合物
(■ IL2+IL6+TNF- α ； I IL-15+IL-6+TNF-α ;π未被刺激的 T 細胞)一起在 37°C下溫育
8天，進行清洗，然后用新鮮的的多聚甲醛進行固定(6h RT) 0然后用PBS漂洗細胞，在 RT下保持過夜。隨后加入新鮮獲得的人血單核細胞，將其與T細胞一起溫育(在37°C進行 24小時)。收集細胞培養(yǎng)物上清液，利用ELISA測量細胞因子水平。顯示了平均值士SEM(N =4個單獨的供體，一式三份地測量)。用來自相同供體的純化的Pan CD3+T細胞進行兩個 分開的實驗以驗證這些發(fā)現(xiàn)。還檢測用細胞因子混合物#1或#2刺激的人PBMC-來源的⑶3+T細胞是否誘導 足以激活人THP-I細胞產(chǎn)生TNF-α和IL_1 β的TCISM的表達。如圖4中所示，與被細 胞因子活化的T細胞組合的THP-I細胞導致產(chǎn)生升高水平的TNF-a，然而，誘導的細胞因 子水平?jīng)]有顯著高于由單獨的經(jīng)多聚甲醛固定的、被細胞因子刺激的T細胞誘導的細胞 因子水平。在圖4中，從健康人供體分離Pan CD3+T細胞，將其與不同的細胞因子混合物
(■ IL2+IL6+TNF- α ；· IL-15+IL-6+TNF-α ;π未被刺激的 T 細胞)一起在 37°C下溫育
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8天，進行清洗，然后用新鮮的4%的多聚甲醛進行固定(6h RT)。隨后用PBS漂洗細胞，在 RT下保持過夜，然后將其加入至THP-I細胞中(在37°C下進行24小時)。如上收集細胞培 養(yǎng)物上清液，然后通過ELISA測量細胞因子水平。顯示了平均值士SEM。如圖5中所示，用PMA/PHA或α⑶3/ α⑶28體外刺激從健康人自愿者的外周血獲 得的Pan⑶3+人T細胞，進行6小時，然后用新鮮的的多聚甲醛在室溫下固定過夜。然 后，向組織培養(yǎng)板中加入新鮮獲得的人血單核細胞，在37°C下將其與固定的T細胞一起溫 育，進行6小時或24小時的培養(yǎng)。然后如上所述收集上清液，且利用ELISA測量不同的Thl 和Th2細胞因子水平。PMA/PHA刺激的T細胞有效地活化人血單核細胞，使其以大約1000 至1250pg/ml的水平產(chǎn)生IL-12 (p70)，特別是在6小時的細胞間接觸之后(圖4)。類似地， α⑶3/ α⑶28-刺激的T細胞也有效地激活人血單核細胞的IL_12 (ρ70)的釋放，盡管程度 較低。最后，兩種類型的被刺激的人T細胞在這兩個不同的時期都能活化人血單核細胞，使 其產(chǎn)生IL-I β和TNF-α。 比較 PMA/PHA 禾口 α CD3/ α CD28 刺激的 Hut_78T 細胞與 PMA/PHA 禾口 α CD3/ α CD28刺激的Hut-78T細胞的膜的活性(活化THP-I細胞產(chǎn)生TNF- α的活性)(參見圖6)。顯 示ΡΜΑ/ΡΗΑ刺激的Hut-78T細胞的數(shù)據(jù)用于舉例說明目的。用相同的Hut_78細胞培養(yǎng)物 批次進行這些研究以減少生物測定的變異性。結(jié)果顯示，與用1 %的多聚甲醛固定的經(jīng)刺激 的Hut-78相比較，經(jīng)刺激的Hut-78T細胞的純化的膜在體外誘導THP-I細胞的TNF- α產(chǎn) 生中更有效。還進行混合和匹配“反加”實驗(mix and match" add back" experiment) 以證明在低速和高速離心步驟過程中TCISM主要存在于純化的膜級分中，而非Parbomb細 胞上清液(例如，細胞溶膠)級分中(參見圖6)。在圖6中，如上所述制備膜，然后在細胞 間接觸生物測定中將其與THP-I細胞組合。在24小時的培養(yǎng)后，取出上清液，對其進行離 心，過濾滅菌，然后利用ELISA測量細胞因子水平。顯示了平均值+/-SD。典型的陣列特征譜(array profiling) “熱圖(heatmap) ”示于圖7，其為PHA/PMA 刺激的CD3+T細胞、Hut-78、H9、Molt4、Jurkat & Raji細胞中編碼膜蛋白質(zhì)或膜相關蛋白 的基因的微陣列2維(2D)簇。進行至少4個實驗(倍數(shù)變化> 2且P值< 0. 01)。在圖7 中，紅色代表基因表達水平> 2. O (即；高于陣列特征譜背景水平)，綠色代表基因表達水平 < 2. 0(即；低于陣列特征譜背景水平)。在數(shù)據(jù)檢查(data review)的計算機評估階段，只 考慮人T細胞膜相關的且在TCISM (+) T細胞系中上調(diào)的和在TCISM (-) T細胞系中下調(diào)的基 因。檢查50，000個由微陣列實驗產(chǎn)生的基因中的大約10，000個基因，其中焦點集中于在 Hut-78和H9細胞中被上調(diào)但在人Molt-4和Jurkat T細胞中不被上調(diào)的T細胞基因上。從具有大約100個潛在的人T細胞TCISM候選物的經(jīng)評審的(curated)列表產(chǎn)生 雙對數(shù)強度圖(其在線性標度上繪制)以鑒定TCISM候選物。這些圖(參見，例如，圖8)描 述了“未改變的”、“特征”、“下調(diào)的”和“上調(diào)的”T細胞基因產(chǎn)物，以及基因產(chǎn)物的相對表達 水平(與總的陣列特征譜結(jié)果相比較)。鑒定了 5個候選人T細胞TCISM基因白喉毒素受 體或肝素結(jié)合EGF (DTR，包含EGF元件的粘蛋白樣激素受體2 (EMR2)，Adamlysin-17 (ADAM或 解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)TNF α -轉(zhuǎn)化酶(TACE，TNF受體超家族成員9 (TNFRSF9或LIGHT)， 以及用于細胞間接觸陽性對照的目的(基于公開的科技文獻的綜述)，TNFRSF5或CD40配 體(CD40L)。為了確認TCISM候選基因在PMA/PHA-刺激的Hut_78和H9亞克隆T細胞中的表 達，進行實時qRT-PCR(參見圖9)。TCISM候選物DTR和LIGHT滿足預先設定的標準，因為兩 個基因都在經(jīng)刺激的Hut-78和H9T細胞中高表達，但在Molt-4和Jurkat T細胞或RajiB 細胞中不上調(diào)。然而，TACE和EMR2在TCISM(-)人Raji B細胞系中都被高度上調(diào)。FACS 也用于驗證這些分子在被活化的H9細胞上的存在(參見圖10)。在細胞間接觸生物測定中檢測大約50個不同的可商購獲得的抗已知的人T細胞表面蛋白的中和單克隆抗體(包括抗ALCAM、⑶6、β 2-整聯(lián)蛋白、⑶69、⑶23、⑶40-⑶40L 和LAG-3的mAb)。已發(fā)現(xiàn)，它們在該系統(tǒng)中對促炎細胞因子的產(chǎn)生的抑制不超過大約30%。 觀察到的更有效的多克隆抗體制劑之一是抗-ADAM-17(TACE)。用可獲得的多克隆抗體進行 這些實驗。在生物測定中使用高特異性的抗⑶40L mAb沒有顯著阻斷TNF-α或IL-I β細 胞因子的產(chǎn)生(參見圖11)。在圖11中，用ΡΜΑ/ΡΗΑ刺激Hut-78細胞，進行6小時，在此時 如之前所述制備純化的膜。將Hut-78膜和所示濃度的抗人mAb加至共培養(yǎng)孔，并且讓其在 37°C下溫育2小時。然后向共培養(yǎng)孔中加入新近傳代的定居(resident)THP-I細胞，并在 37°C下保持24小時。收集上清液以進行TNF- α和IL-I β ELISA。圖11顯示在各mAb濃度上進行的兩個分開的實驗(進行一式三份的細胞因子測量)。FACS分析顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染的293細胞(圖12) —致地在它們的細胞表面上表達升高 水平的TCISML基因產(chǎn)物。在圖12中，用pOG44將pcDNA5/FRT/DTR、EMR2-07 (包含EGF樣 結(jié)構(gòu)域1、2和5的同種型)或⑶40L分別共轉(zhuǎn)染入Flp-In 293細胞和Jurkat細胞，然后在 500mg/ml潮霉素中選擇集落。用細胞解離緩沖液(disassociationbuffer)使細胞脫落，然 后通過FACS進行分析。(抗⑶97與EMR2-07發(fā)生交叉反應，用于檢測EMR2-07的表達)。 在數(shù)次細胞培養(yǎng)傳代后表達保持穩(wěn)定，這表明它們適合用于細胞間接觸測定。在細胞間接 觸測定中使用經(jīng)轉(zhuǎn)染的293細胞進行初步實驗(參見圖13)。DTR和CD40L構(gòu)建體有效地 增加sHut-78m驅(qū)動的TNF- α /IL-I β的THP-I誘導(圖13)。向測定中加入外源IFN- γ 導致CD40L-誘導的M Φ活化的水平和隨后TNF-α釋放的水平增加(圖13的左圖)，但不 導致IL-I β釋放的水平增加(圖13的右圖)。對于用⑶40L轉(zhuǎn)染的293或Jurkat細胞， 此類作用是高度可重現(xiàn)的。在健康人T細胞和從具有活性Ps和PsA的患者獲得的T細胞中鑒定了人T細胞 TCISM。如所觀察到的，體外細胞間接觸生物測定是鑒定共培養(yǎng)物中的人T細胞與人ΜΦ之 間的免疫突觸機制的高度可重現(xiàn)的人細胞因子“讀出系統(tǒng)”。已觀察到，ΡΜΑ/ΡΗΑ-刺激的Η9 細胞和!1肚-78細胞誘導1順-0和IL-I β的THP-I分泌(表明這些細胞是TCISM陽性的)， 而ΡΗΑ/ΡΜΑ刺激的Mo 114、Jurkat、Raji細胞和靜息原代人T細胞、未經(jīng)刺激的Hut_78、H9、 Molt4、Jurkat 或 Raji 細胞是 TCISM 陰性(圖 1)。使用下列標準確定TCISM候選物㈧與膜相關的；⑶在經(jīng)刺激的Hut-78和H9 細胞中上調(diào)超過2倍，但在Molt4、Jurkat和Raji細胞中不上調(diào)的；和(C)高表達水平必須 得到qRT-PCR和FACS的驗證。用α⑶3/ α⑶28或人細胞因子混合物體外刺激的原代T細胞也在測定中增加促 炎細胞因子(PIC)活性。ΡΜΑ/ΡΗΑ或α⑶3/ α⑶28刺激的T細胞增強ΜΦ的活化以產(chǎn)生 IL-12。已在銀屑病損傷中檢測到IL-12。據(jù)信，IL-12主要刺激幼稚(Naiive)Th細胞中 的IFN-Y產(chǎn)生并且在Thl應答的擴展和穩(wěn)定中起作用。對來自正常健康供體與來自銀屑病患者的PBMC來源的T細胞進行微陣列分析，以 鑒定人T細胞TCISML分子和其經(jīng)由人M Φ TCISMR的信號轉(zhuǎn)導途徑(其導致炎癥和皮膚疾病 (cutaneous skindisease))。使用來自健康供體、PsA和CPP患者的人T細胞的微陣列分析 已鑒定了 TCISM分子，包括白喉毒素受體(DTR ；HB-EGF)和粘蛋白樣表皮生長因子家族成員 (EMR4 ；CD97)。還觀察到許多 TNF 家族成員(包括 4-1BB (TNFSF14)、0X-40、LIGHT (TNFSF9) 和 CD40L(CD154 ； TNFSF5))的上調(diào)。使用大約50個不同的可商購獲得的中和單克隆抗體，通過細胞間接觸測定驗證 人TCISM候選物。在許多情況下，發(fā)現(xiàn)這些試劑在該系統(tǒng)中在24-96小時的時期內(nèi)對促炎 細胞因子的產(chǎn)生的抑制不超過30% (參見圖11)?！癋lip-in”轉(zhuǎn)染系統(tǒng)法用于鑒定來自微 陣列實驗的5個初始候選TCISML基因候選物，包括EMR2、DTR、4-1BB、LIGHT和⑶40L。將 TCISM候選基因的全長cDNA轉(zhuǎn)染入TCISM陰性293和Jurkat細胞，在細胞間接觸生物測定 中進行表征，結(jié)果顯示DTR和⑶40L有效地增加T細胞驅(qū)動的M Φ TNF-α/IL-I β。向測定 中加入外源IFN-γ導致^401^-誘導的11(]5活化的水平和隨后TNF-α釋放的水平增加，但 不導致IL-I β釋放的水平增加(圖12a-b和13)。
一些已鑒定的導致炎癥和皮膚疾病的人ΜΦ TCISMR(TCISM-受體)包括DTR、 CD97、4-1BB、0X_40、LIGHT 和 CD40L。將 TCISM 候選基因的全長 cDNA 轉(zhuǎn)染入 TCISM 陰性 293 和Jurkat細胞，在細胞間接觸生物測定中進行表征，結(jié)果顯示DTR和⑶40L有效地增加T 細胞驅(qū)動的TNFa /IL-I β的ΜΦ產(chǎn)生。 銀屑病本發(fā)明的一個特定方面提供了用于治療銀屑病的組合物和方法。銀屑病(Ps)是 影響大約2%的美國人口的慢性皮膚障礙。不受任何理論的束縛，并且如圖15中圖解說 明的，據(jù)信Ps的病理學牽涉表皮的增殖和分化、血管生成和角質(zhì)形成細胞的過度增殖以及 活化的T-細胞(Τ。)、巨噬細胞(ΜΦ)、樹突細胞(DC)、郎格漢斯細胞(LC)和嗜中性粒細胞 (PMN)至損傷的皮膚內(nèi)的浸潤。在活躍的損傷處產(chǎn)生的促炎細胞因子(PIC)(包括腫瘤壞死 因子-a (TNFa )，白細胞介素-1 β (IL_1 β )和白細胞介素-32 (IL-32))據(jù)信誘導和維持疾 病例如銀屑病關節(jié)炎(PsA)和Ps中的慢性皮膚炎癥。據(jù)信，通過活化ΜΦ上調(diào)細胞因子負 責此類障礙的發(fā)病機制。已表明，T細胞在ΜΦ的活化中起著至關重要的作用；然而，已顯 示Τ。細胞因子例如白細胞介素_4、10和13 (IL-4、IL-10和IL-13)起著抗炎作用或只微弱 地誘導TNFa/IL-Ιβ上調(diào)。據(jù)信，Τ。-誘導的M Φ活化的活化機制是通過直接的細胞間接 觸(通過皮膚中的免疫突觸機制)進行的。免疫突觸(IS)在抗原呈遞細胞(APC)和T細胞之間的界面處形成，據(jù)信其是負責 抗原識別和τ細胞活化的結(jié)構(gòu)。IS最初發(fā)現(xiàn)于T細胞與B細胞之間，或T細胞與包含MHC的 平板雙分子層(planarbilayer)之間。據(jù)信其是通過T細胞受體-主要組織相容性復合物 (TCR-MHC)在稱為中央超分子活化簇(c-SMAC)的IS中心區(qū)域的累積和白細胞功能相關抗原 I(LFA-I)-細胞間粘著分子-I(ICAM-I)在稱為外周(p_)SMAC(pSMAC)的外部IS區(qū)域中的累 積而形成的。已顯示成熟IS包含富集有LFA-1、踝蛋白、VLA-4、ADAP和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的pSMAC。 pSMAC圍繞富集有TCR、CD4或CD8共受體、CD28共刺激分子、CD2、PKC θ等的cSMAC。Ps皮膚的特征在于角質(zhì)形成細胞的過度增殖，其導致脊狀和釘狀的夸張模式。已 顯示皮膚中的角質(zhì)形成細胞、DC和ΜΦ都產(chǎn)生TNFa、IL-I β和IL-32。雖然IS控制銀屑 病自身抗原-特異性皮膚淋巴細胞抗原(CLA)陽性T細胞的活化，但至關重要的分子組分 包括TCR和圍繞其的一圈粘著分子例如LFA-1，所述分子可結(jié)合由鄰近細胞例如角質(zhì)形成 細胞或APC表達的ICAM-I。因此，IS是治療方法的邏輯靶標。例如，阿來西普是重組融合 蛋白，其結(jié)合記憶效應T細胞上的CD2，從而抑制它們的活化并且減少此類細胞的數(shù)目。依 法珠單抗是抗⑶Ila分子的人源化單克隆抗體(Mab)。⑶Ila和⑶18包含LFA-I的亞基。本發(fā)明者已顯示，在人T細胞的表面上存在TCISM，其通過驅(qū)動ΜΦ的活化以產(chǎn)生 促炎細胞因子來介導皮膚炎癥。在TCISM的水平上控制適應性(獲得性)免疫是有利的， 因為治療性干預在細菌性皮膚感染期間允許先天性免疫。銀屑病是具有幾個臨床表現(xiàn)的皮膚遺傳性病癥。最常見的類型是尋常性銀屑病 (psoriasis vulgaris)(或斑塊狀銀屑病(Plaque psoriasis) [Ps])，其在人體的特征部位 發(fā)生為慢性、復發(fā)性、鱗屑性(scaling)丘疹和斑塊。目前，銀屑病的療法并不令人滿意。Ps 的特征在于活化的T細胞對皮膚的浸潤和角質(zhì)形成細胞的異常增殖。由于被T細胞、角質(zhì) 形成細胞、DC和LC過度產(chǎn)生，已報導TNF α的濃度在Ps損傷中比在未受牽連的皮膚(在患Ps的患者和正常人中)中更高。 自身免疫性疾病人的自身免疫性疾病例如Ps和銀屑病關節(jié)炎(PsA)是慢性綜合征，其特征在于與 抗表達自身抗原的組織的適應性體液(自身抗體)或細胞(自身反應性T細胞)應答的 診斷結(jié)果組合的典型的、通常復發(fā)性的臨床癥狀。重要的人自身免疫性疾病通常與病毒或 細菌感染共存或由其觸發(fā)，并且與某些MHC等位基因相關。先天性免疫系統(tǒng)包括范圍從上 皮的非特異性屏障功能至病原體的高度選擇性識別(通過使用種系編碼的受體)的宿主防 御的集合。這些不同元件的共同特征是對感染或組織破壞的快速和直接(blunt)應答。在 另一方面，適應性免疫系統(tǒng)使用體細胞重排的抗原受體基因來產(chǎn)生針對幾乎任何抗原的受 體。適應性免疫應答速度較慢但更靈活，并且能夠抵抗已進化至逃避先天性應答的感染。先天性免疫系統(tǒng)通過識別病原體中的保守基序以及許多細胞應激或死亡的其他 標志來進行應答。先天性免疫系統(tǒng)的細胞組分包括DC、單核細胞、ΜΦ、粒細胞和天然殺傷T 細胞(NKT)以及在生物體和其環(huán)境之間形成界面的皮膚、肺和消化道上皮細胞。先天性系 統(tǒng)的非細胞元件是非常多樣的，范圍從角質(zhì)層的簡單屏障功能至復雜途徑例如補體級聯(lián)。 這些元件通過物理阻斷來阻止病原體的進入，或當細胞被侵入時，使它們能夠直接破壞或 通過吞噬細胞破壞病原體。先天性免疫系統(tǒng)還已進化至識別對于許多種類的病原體來說是 共同的分子模式。此類分子模式稱為病原體相關分子模式(PAMP)。PAMP識別通過使用一 組種系編碼的、進化上保守的病原體-識別受體(PRR)來進行。Toll-樣受體(TLR)是非常 重要的一組病原體受體，它們在先天性免疫細胞上和不同組織的細胞(包括內(nèi)皮細胞、上 皮細胞和成纖維細胞)上表達。已在人中鑒定了對于不同的微生物分子是特異性的10個 TLR家族成員。TLR與它們的微生物配體的結(jié)合導致吞噬細胞的活化，以及促炎細胞因子和 抗微生物肽的釋放。此類分子據(jù)信也激活DC起始適應性免疫應答。
T細胞在免疫應答中是重要的，且可基于它們的遷移模式和功能能力將其分為許 多獨特的子集。幼稚T細胞主要在血液與淋巴結(jié)之間再循環(huán)(通過表達歸巢受體L-選 擇蛋白和CCR7來輔助的模式)。幼稚T細胞保持多能狀態(tài)并且具有相對靜止的效應子程 序(effector program)，因為它們從血液通過淋巴器官再循環(huán)，檢查激活MHC-肽復合物的 DC。通過整合來自活化的DC和來自細胞因子環(huán)境的信號的復雜機制，幼稚T細胞被驅(qū)動通 過快速的幾輪分裂(其與分泌對抗不同種類病原體所必需的效應細胞因子的能力密切相 關)?？蓪D4+T輔助細胞功能性地分成Thl (分泌干擾素[IFN] γ)和Th2(分泌白細胞介 素[IL]_4)子集，以及最近鑒定的其他Th子集(其包括Trl (分泌IL-10)、Th3(產(chǎn)生轉(zhuǎn)化 生長因子[TGF] β)、ΤΗ (濾泡輔助細胞)、外周誘導的(peripherally-induced)調(diào)節(jié)性T 細胞(Treg ；FoxP3-陽性)和Thl7(產(chǎn)生IL-17A)細胞)。其他子集的發(fā)現(xiàn)無疑將激起鑒 定潛在的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的興趣，所述轉(zhuǎn)錄因子可能牽涉修飾參與效應子功能的特征細胞因 子基因的機制。免疫突觸(IS)在抗原呈遞細胞與T細胞之間的界面上形成，并且據(jù)信是負責抗原 識別和τ細胞活化的結(jié)構(gòu)。最初在T細胞與B細胞之間或T細胞與包含MHC的平板雙分子 層之間發(fā)現(xiàn)IS。其通過T細胞受體-主要組織相容性復合物(TCR-MHC)在稱為中央超分 子活化簇(c-SMAC)的中心IS區(qū)域的累積和白細胞功能相關抗原I(LFA-I)-細胞間粘著分子-I(ICAM-I)在稱為外周(p-)SMAC(pSMAC)的外部區(qū)域中的累積而形成。成熟突觸包含富集有LFA-1、踝蛋白、VLA-4、ADAP和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的pSMAC。pSMAC圍繞富集有TCR、⑶4 或⑶8共受體、⑶28共刺激分子、⑶2、PKC θ等的cSMAC。在APC的表面上表達的配體據(jù)信招募特異性受體至IS接觸位點。共刺激分子⑶28 和細胞毒性T淋巴細胞抗原4 (CTLA4)至突觸的招募被其配體B7-1和B7-2在APC上的表 達有差別地增強。雖然⑶28和CTLA4結(jié)合這兩個配體中的任一個，但當在APC上表達時， B7-2招募⑶28以及B7-1招募CTLA4至突觸。配體在APC上的接觸位點中的穩(wěn)定性也是非 常重要的，因為^28、01^-4和蛋白激酶(-0的招募需要B7-1的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的存在。銀屑病皮膚的特征在于角質(zhì)形成細胞的過度增殖，其導致脊狀和釘狀的夸張模 式。皮膚中的角質(zhì)形成細胞、DC和ΜΦ都能產(chǎn)生TNF α。雖然IS控制銀屑病自身抗原-特 異性皮膚淋巴細胞抗原(CLA)陽性T細胞的活化，但一些至關重要的分子組分包括TCR和 圍繞其的一圈粘著分子例如LFA-1，所述分子可結(jié)合由鄰近細胞例如角質(zhì)形成細胞或APC 表達的ICAM-1。突觸的LFA-I組分據(jù)信在銀屑病中非常重要，因為阻斷該粘著相互作用的 治療劑(抗LFA-I抗體；依法珠單抗)已被美國食品與藥品管理局(FDA)批準用于治療銀 屑病。其他的貢獻分子(包括其他粘著分子和共刺激分子)也影響T細胞的應答性，例如， 細胞表面分子對CD2 :LFA-3和CD28 :CD80/CD86。
類風濕性關節(jié)炎類風濕性關節(jié)炎(RA)是也涉及IS信號轉(zhuǎn)導的炎性疾病。用于治療RA的潛在方 法之一包括抑制存在于T細胞與抗原呈遞細胞之間的IS上的分子。據(jù)信，細胞因子的上調(diào) 的機制是接觸依賴性的。在細胞表面上存在多個可介導此類功能的候選蛋白。已顯示，由T細胞受體復合物活化的T細胞誘導單核細胞的IL-10合成。這部分 依賴于內(nèi)源TNFa和IL-I的水平，且已顯示T細胞膜TNF α是重要的接觸介導的信號。然 而，當TNF α和IL-I被中和時，IL-10合成仍然進行，從而表明存在IL-10合成所需的不依 賴于TNF/IL-1的信號。特別有趣的是TNF/TNF-R家族的成員，其包括CD40、CD27、CD30、0Χ-40和LT β。 這些TNF-R分子的配體據(jù)信在T細胞活化后被上調(diào)，此外，據(jù)信，CD40L、4-1BB、CD27L、CD30 在活化后作為可溶性介體(mediator)被釋放。已觀察到，⑶40L與⑶40之間的相互作用 對于在T細胞與單核細胞相互作用后誘導IL-I和IL-12的合成是非常重要的，且最近觀察 到其介導人小膠質(zhì)細胞在與抗-CD3-刺激的T細胞相互作用后產(chǎn)生IL-10。
T細胞免疫球蛋白粘蛋白T細胞免疫球蛋白粘蛋白(TIM)是在T細胞上表達的包含共同結(jié)構(gòu)基序的I型膜 糖蛋白。TIM基因家族位于小鼠的11號染色體上和人的5q33上?；蚪M分析已在小鼠中鑒 定了 8個家族成員(TIM-1至TIM-8)，在人中鑒定了 3個家族成員(TIM_1、TIM_3和TIM-4)。 所有成員共有包含IgV、粘蛋白、跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的特征結(jié)構(gòu)。該基因家族在免疫應答的 調(diào)控中起作用。之前被鑒定為甲型肝炎病毒受體的TIM-I共刺激T細胞增殖和細胞因子產(chǎn)生。 TIM-I在所有活化的T細胞上表達，當CD4+T細胞兩極分化時，以更高的水平在Th2細胞上表達(相對于Thl細胞)。已顯示，當與肽或APC或抗⑶3和⑶28的交聯(lián)抗體一 起培養(yǎng)時，激動性單克隆抗-TIM-I抗體(3B3)體外共刺激T細胞。當在免疫應答期間 體內(nèi)施用時，抗-TIM-I抗體促進T細胞的體外增殖，甚至在抗原性再刺激(antigenic re-stimulation)不存在的情況下亦如此。與對照處理相比較，其還增加Thl和Th2原型細 胞因子(prototypiccytokine)的產(chǎn)量。此外，抗_TIM_1抗體消除高劑量耐受性的誘導并 且當用抗原鼻內(nèi)免疫和攻擊小鼠時，還可恢復AHR。因此推測TIM-I用作所有T細胞的共刺 激分子，其對Th2細胞的作用可能比對Thl細胞的作用更強。
已證明，與Th2細胞相比較，TIM-3優(yōu)先在體外極化的人⑶4+Thl細胞上表達。因 此，TIM-3的表達可用于鑒定人Thl細胞。此外，據(jù)信TIM-3有助于Thl細胞的體內(nèi)調(diào)控。 例如，在實驗性自身免疫性腦炎(EAE)模型中對小鼠施用TIM-3-特異性抗體導致Thl-驅(qū) 動的EAE的進展加速。此外，抗-TIM-3抗體誘導ΜΦ的活化和克隆性T細胞增殖，對于此， 需要M Φ與T細胞之間的相互作用。這些數(shù)據(jù)似乎顯示ΤΙΜ-3在負調(diào)節(jié)T細胞對M Φ的活 化中的作用。ΤΙΜ-3/ΤΙΜ-3配體相互作用也在耐受性中起作用。用全長和可溶性TIM-3 Ig 融合蛋白對小鼠的治療消除了使用高劑量水性抗原誘導的耐受性。類似地，ΤΙΜ-3-缺陷型 小鼠不能產(chǎn)生耐受性。事實上，Ig融合蛋白治療的小鼠和ΤΙΜ-3-缺陷型小鼠在施用高劑 量的水性抗原后，都展示與對照相比增加的T細胞增殖和IL-2的產(chǎn)量。ΤΙΜ-4據(jù)信是TIM-I的天然配體。與其他TIM分子不同，ΤΙΜ-4顯示不在T細胞中 表達，相反地在APC中(特別是在成熟淋巴DC中)表達。迄今為止未發(fā)現(xiàn)正調(diào)控TIM樣家 族分子(其介導Thl T-細胞-驅(qū)動的ΜΦ活化)。本發(fā)明者已顯示TIM-I和ΤΙΜ-3在PMA/ 離子霉素活化的Η9或原代人CD3+T細胞中都不上調(diào)。鑒定參與免疫突觸的胞質(zhì)蛋白、膜蛋 白和核內(nèi)蛋白的蛋白質(zhì)組學方法蛋白質(zhì)組學技術可用于表征疾病的生物標記和生物特征(biosignature)以及揭 示關于功能性亞蛋白質(zhì)組和網(wǎng)絡的信息。雖然許多蛋白質(zhì)組學應用提供了關于亞系統(tǒng)(其 在對疾病、損傷或藥物的應答中發(fā)生變化)的一般信息，但蛋白質(zhì)組學還可用于鑒定之前 未被表征的參與生物化學應答(例如MAPK信號轉(zhuǎn)導、趨化性、黑色素瘤腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移， 以及MHC II類誘導的細胞死亡等)的蛋白質(zhì)。雙向凝膠電泳(2DGE)和質(zhì)譜法的組合是 用于蛋白質(zhì)組學應用的分析技術之一。與通過串聯(lián)質(zhì)譜法和后期數(shù)據(jù)庫檢索算法進行的蛋 白質(zhì)的直接和無偏鑒定偶聯(lián)的2DGE的定量能力提供了優(yōu)良的技術平臺，借助于該平臺可 獲得細胞系統(tǒng)、血漿、皮膚等中的蛋白表達變化的特征譜?；パa發(fā)現(xiàn)平臺(complementary discovery platform)是多維色譜蛋白質(zhì)和肽分離技術，接著用于蛋白質(zhì)鑒定的串聯(lián)質(zhì)譜 法和數(shù)據(jù)庫檢索。隨后使用選擇的反應監(jiān)測來定量相關分子。
宿主防御和炎性疾病促炎性、多效性細胞因子TNF α和IL_1 β在宿主防御和炎性疾病過程中起著至關 重要的作用。已在Ps疾病靶組織和患有炎性皮膚病的患者的循環(huán)系統(tǒng)(circulation)中 發(fā)現(xiàn)TNF α和IL-I β的過表達。T細胞和單核細胞-ΜΦ的一個主要功能是釋放各種細胞 因子，包括IL-I β和/或TNF α。這些分子反過來參與下游部分例如IL-32 (由角質(zhì)形成 細胞和ΜΦ產(chǎn)生)的誘導和釋放，最終導致角質(zhì)形成細胞的過度增殖和Ps的發(fā)生。不受任 何理論的束縛，據(jù)信，在更末端的水平(例如，在T細胞驅(qū)動的單核細胞-ΜΦ的活化的水平上，可能在適應性應答和/或IS形成期間的不同時期)上阻斷這些細胞因子的產(chǎn)生，可導致新型分子藥物發(fā)現(xiàn)靶標(其被設計用于特異性抑制這些細胞因子)，從而產(chǎn)生對于Ps患 者具有更小的副作用的更安全的治療劑。在參考下列不意欲限定本發(fā)明的實施例后，對本領域技術人員來說，本發(fā)明的另 外的目的、有利方面和新特征將變得明顯。
實施例
細胞系的培養(yǎng)在由補充有10% (v/v)FCS血清、2mM L-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100單 位/ml鏈霉素的RPMI 1640 (Biochrom, Berlin, Germany)組成的標準培養(yǎng)基中培養(yǎng)人細胞 系。從 ATCC 獲得 Hut 78、H9、Molt4、Jurkat、Raji 和 THP-I 細胞系。
細胞分離外周血單核細胞(PBMC)。通過Ficoll密度梯度離心分離PBMC。獲得的PBMC的 成活力> 95%，如通過臺盼藍染色所測定的。在Neubauer計數(shù)室(Neubauer chamber) (Zeiss, Oberkochen, Germany)中定量存活的細胞，然后將其貯存于液氮中。
CD3+T細胞再次以1，500rpm離心解凍的PBMC，進行5分鐘。棄去上清液，將沉淀重懸浮于 MACS緩沖液中。以IO8個細胞/0.8ml緩沖液的濃度將細胞分離成單細胞懸浮液。每IO8 個細胞加入大約0. 2ml的半抗原-抗體混合物。充分混合所得的混合物，然后在冰上溫 育20分鐘。通過加入20x標記體積來清洗細胞，離心，然后除去上清液。以IO8個細胞 /0.8ml緩沖液的濃度重懸浮細胞沉淀。每IO8個細胞加入大約0.2ml MACS抗-半抗原微 珠(Anti-Hapten MicroBead)以磁性標記細胞。將混合物在冰上溫育15分鐘，用20x的體 積進行清洗(將來自Leukophoresis packs的冷凍細胞通過45 μ m孔隙的過濾器以除去成 簇的死細胞)，離心，然后棄去上清液。以IO8個細胞/lml MACS緩沖液的濃度重懸浮細胞， 將LS+柱置于適當?shù)腗ACS分離器的磁場中。通過用3ml緩沖液清洗來制備柱子。將細胞 懸浮液應用于柱子，使未標記的細胞通過該柱子。收集流出物作為陰性級分，其代表富集的 T細胞級分。用4x 3ml緩沖液漂洗柱子，收集流出物。在細胞清洗后，以IO6個細胞/ml的 濃度將細胞沉淀重懸浮于50ml組織培養(yǎng)基中。通過⑶3-FITC標記和FACS分析測定T細 胞純度(> 95% )。
單核細胞方法與⑶3+T細胞分離的相同。 細胞的免疫分型在FACS培養(yǎng)基[包含1 %牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)]中清 洗收獲的細胞，然后在4°C下用直接綴合有異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)的抗體染色，進行20分鐘。此后，用PBS清洗細胞3次，通過FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg，Germany)，使用 CellQuest 軟件(Becton Dickinson)進行分析?？贵w如下PE 標記的抗_小鼠IgG、抗-人⑶40L和⑶137。
細胞間接觸測定用冷PBS清洗原代T細胞或H9細胞，然后以5x IO6個細胞/ml將細胞沉淀重懸浮于新制備的多聚甲醛中。在冰上將細胞固定2小時，然后用20倍體積的冷PBS清洗 3次。在第三次清洗后，將細胞在4°C下于PBS中保持過夜以使多聚甲醛擴散。對細胞進行 離心，并再清洗一次。將固定的T細胞以Ix IO7個細胞/ml重懸浮于培養(yǎng)基中，然后分配 入96孔U形底平板(大約Ix 106/ml的THP-I細胞，每孔100 μ 1)。以8χ、4χ和2x IO6個 細胞/ml加入原代T細胞或H9細胞(每孔100 μ 1)。將平板在37°C下、增濕的5% CO2中 溫育48小時。以1，500rpm離心平板5分鐘，將上清液(120 μ 1)轉(zhuǎn)移入新平板。在_20°C 下貯存上清液直至使用。
Hut-78的質(zhì)膜的制備將大約5x IO8個經(jīng)刺激的或未經(jīng)刺激的Hut-78細胞懸浮于IOml包含蛋白酶抑制 劑的高滲緩沖液(50mM Tris-Cl (pH 7. 4)、25mM KCl、5mM MgCl2、200uM PMSF、lx完全蛋白酶 抑制劑)中，然后使用杜恩斯勻漿器在冰上進行勻漿(20下)。通過在4°C下以4000xg離 心15分鐘棄去細胞核和未破碎的細胞級分，然后在4°C下使用SW40轉(zhuǎn)子28K(100，OOOxg) 對上清液進行超速離心，進行45分鐘。用22G注射器針頭將膜沉淀重懸浮于9ml PBS中， 然后將其加至Iml的200mM CHAPS中。將勻漿物在冰上溫育1小時。將大約Iml等分的懸 浮質(zhì)膜(5x IO7個細胞當量/ml)貯存在-80°C下。
RNA樣品的制備和雜交按照廠商的方案，使用RNeasy MinElute 試劑盒(Qiagen)和 Qiagen Mini RNeasy 試劑盒提取和純化 RNA。如 Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix，兩循環(huán) 方案)中所述，對于各樣品使用IOOng的總RNA進行cDNA合成。使用BioArray High-Yield Transcript Labeling試劑盒(Enzo)進行cRNA反應。將15微克經(jīng)標記的cRNA片段化，然 后按照廠商的說明書將其雜交至GAPS Slides (Corning)。
Flp-In轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定的TCISM配體(TCISML)-陰性T細胞系，然后用微陣列實驗中鑒定的 TCISML候選基因(包括EMR2、DTR、4_1BB、LIGHT和CD40L)的cDNA對其進行轉(zhuǎn)染。按照 廠商的方案使用稱為“Flp-In”法的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(其使用Flp-In重組酶)。使用貼壁293細 胞(貼壁細胞對照)或TCISM-陰性Jurkat細胞制備8個不同的構(gòu)建體(包含EGF結(jié)構(gòu) 域 2 和 5 的 pcDNA5/FRT/EMR-2-04、包含 EGF 結(jié)構(gòu)域 1、2 和 5 的 pcDNA5/FRT/EMR-2_05、包 含 EGF 結(jié)構(gòu)域 1、2 和 5 的 pcDNA5/FRT/EMR-02-07、pcDNA/FRT/DTR、pcDNA3/4-lBB、pcDNA5/ FRT/LIGHT, pcDNA5/FRT/CD40L 和 pcDNA5/FRT 對照)。
小分子測定
通過使用T細胞膜-M Φ細胞接觸生物測定法，鑒定差異性阻斷抗-⑶3/抗-⑶28 活化的T細胞介導的-但非LPS刺激的-外周血定居⑶14+ΜΦ的TNF α和IL-I β產(chǎn)生的 小分子拮抗劑。選擇幾種激酶抑制劑并且使用經(jīng)驗證的T細胞膜-ΜΦ接觸生物測定法就 這些化合物在阻斷TNFa和/或IL-I β的產(chǎn)生中的作用對其進行評估。經(jīng)證明，化合物 C (p38 MAP激酶抑制劑)顯示完全抑制T細胞介導的人M Φ的TNF α產(chǎn)生，而對LPS-刺激 WTNFa和IL-Ιβ的產(chǎn)生不具有任何顯著作用(參見圖14)。其他化合物C類似物以大 約相同的程度(大約50-100%的抑制)抑制活化的T細胞膜-刺激的和LPS-刺激的M Φ 的TNF α和IL-I β產(chǎn)生，或者對于LPS-刺激的MΦ活化顯示更少的對細胞因子產(chǎn)生的抑 制(大約30-50%的對LPS-活化的細胞因子產(chǎn)生的抑制對大約100%的對T細胞介導的細 胞因子產(chǎn)生的抑制)。因此，使用人T細胞和M Φ進行的活化的T細胞膜-M Φ接觸生物測 定可用于建立高通量篩選，所述高通量篩選用重組TCISM(經(jīng)鑒定和克隆后)鑒定具有口服 活性的小分子拮抗劑，其特異性靶向適應性_但非LPS介導的-先天性免疫。一些特異性 干擾T細胞介導的ΜΦ活化，從而導致增加細胞因子產(chǎn)量(但不增加LPS介導的ΜΦ細胞 因子釋放)的具有口服活性的小分子TNFa和/或IL-I β抑制劑，在T細胞介導的皮膚病 例如Ps中具有有利的治療/副作用特征譜。
數(shù)據(jù)分析用統(tǒng)計軟件〃SIGMASTAT" -SIGMAPL0T V. 9 的工具(Systat Software, San Jose, CA)進行統(tǒng)計評估。使用學生氏t檢驗比較使用siRNA和/或小分子化合物敲除的活化的 H9細胞的組中與活化的H9細胞的組中的細胞因子的濃度。所有比較的顯著性水平都以 0. 05的共同標準設定。
統(tǒng)計白勺考慮因素(Stat i st i ca I Consideration)通過比較對照細胞、經(jīng)刺激的細胞和其中已使用siRNA和/或小分子化合物敲除 潛在的TCISM候選物的表達的經(jīng)刺激的細胞之間的生物測定的讀出結(jié)果(readout)，可容 易地驗證候選蛋白質(zhì)。使用小分子化合物的一個有利方面是能夠闡明TCISM的p38信號轉(zhuǎn)導途徑活性并 且其是具有口服活性的抑制TCISM的試劑。
TCISM配體候選物的鑒定 細胞間接觸生物測定表明，TCISML在從PMA/PHA刺激的原代T細胞、Hut_78禾口 H9細胞獲得的純化的膜上-但不在Molt4、Jurkat或RAJI B細胞中-高表達。來自活化 的細胞與未活化的細胞的表達特征譜數(shù)據(jù)(使用18個單獨的TCISML(+)對TCISML(-)比 較條件)顯示，這些不同的細胞系之間的基因表達顯著不同。計算機評估顯示，TCISM分子 在TCISML (+) T細胞系中上調(diào)，在TCISML (-) T細胞系中下調(diào)。完全檢查由微陣列實驗產(chǎn)生 的50，000個基因中的大約10，000個基因。使用下列標準確定TCISML候選物(1)它們是 膜相關的；(2)它們在經(jīng)刺激的Hut-78和H9細胞中-但不在Molt4、Jurkat和Raji細胞 中_被上調(diào)超過2倍；和(3)它們的表達水平得到qRT-PCR的確認。隨后的數(shù)據(jù)分析將總 共10，000個基因縮減至僅100多個膜相關蛋白。雙對數(shù)強度圖鑒定了 5個候選人T細胞TCISML基因白喉毒素受體或肝素-結(jié)合EGF (DTR或HB-EGF)、包含EGF元件的粘蛋白樣激 素受體 2(EMR2 ；CD97)、4_1BB (TNFRSF14)、0X_40 (CD134)、TNF 受體超家族成員 9 (TNFRSF9 或 LIGHT ；⑶248)和⑶40配體(⑶40L ；TNFRSF5)。FAC用于確認這些分子在活化的H9細胞上 的存在。qRT-PCR也用于確定這些基因是否是TCISM候選物。使用Ilcm IPG條pH 4_6在第一向中分離來自經(jīng)刺激的和未經(jīng)刺激的H9細胞的膜 制劑的蛋白質(zhì)，然后使用10. 5-14%的梯度SDS-PAGE凝膠在第二向中分離所述蛋白質(zhì)。將 代表至少1.5倍的表達變化(通過用ImageMaster分析)的標記的點切下，使用胰蛋白酶 進行消化，然后通過nanoLC/MS/MS在Agilent超高容量離子阱(Ultrahigh capacity ion trap)上進行分析。
凝膠分析 在脫色和用水漂洗后在Typhoon 9400熒光掃描儀(GEHealthcare)上以200 像素的分辨率進行成像。如下所述使用IMAGE-Master platinum II軟件版本5. 0(GE Healthcare)，將經(jīng)刺激的和未經(jīng)刺激的制劑中的蛋白質(zhì)點進行匹配。將各蛋白質(zhì)點的強度(3-維體積)針對凝膠上檢測到的所有點的總強度進行標準 化。在比較凝膠之前，單獨地調(diào)整檢測閾值以產(chǎn)生平均1500個蛋白質(zhì)點/凝膠。條件之間 的明顯的點強度的變化是用于切取隨后使用質(zhì)譜法進行鑒定的點的標準。使用OneTouch PlusSpot Picker (The Gel Company)，用 1. 5mm 槍頭切取目的點。
凝膠內(nèi)消化使用胰蛋白酶在凝膠點中消化蛋白質(zhì)。簡而言之，混合來自至少2個重復實驗的 點，用1/1乙腈和IOOmM碳酸氫銨脫色一次，然后用100%乙腈濃縮，并進行真空干燥。用 25ng/yl胰蛋白酶再水化點，并且在37°C下溫育過夜。收集上清液，使用含有30%乙腈的 1 %甲酸(水性的)將其與2份另外的提取物混合。將混合的提取物真空濃縮至大約10 μ L， 并在-80°C下貯存直至使用。
胰蛋白酶消化物的LC/MS/MS分析利用反相納升電噴霧LC-MS/MS(Agilent 1100 HPLC, 75 μ m ID χ 15cm柱，Zorbax C18)分析大約30%的凝膠內(nèi)消化的樣品。緩沖液A是0. 甲酸。使用逐漸增加的緩沖液 B(90%ACN，0. 甲酸)的梯度以300nl/分鐘的流速將肽從分離柱洗脫入質(zhì)譜儀。在350 至1800Da的m/z范圍內(nèi)收集譜(Agilent LC/MSD Trap XCT Ultra)。對于6個最豐富的 m/z值收集了 3個MS/MS譜，然后將這些質(zhì)量從分析中排除(1分鐘)，選擇接下來的6個最 豐富的m/z值進行片段化。
使用數(shù)據(jù)庫檢索進行蛋白質(zhì)鑒定通過使用Mascot (Matrix Science)和 Spectrum Mill(Agilent)程序檢索 NCBInr 和SwissProt數(shù)據(jù)庫來鑒定蛋白質(zhì)。對于Mascot，使用10，000的強度閾值和最小0. 2 % 的相對豐度產(chǎn)生所得的譜的化合物列表，將其歸類在5個掃描中?；衔锪斜磔敵鰹?mgf 文件，然后使用針對人的分類過濾器(taxonomy filter)檢索數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫檢索中使用的參數(shù)如下單同位素質(zhì)量、2. ODa的肽質(zhì)量允差(mass tolerance)、0. 7Da的碎片離 子質(zhì)量允差、只允許2個漏切(missed cleavage)的胰蛋白酶消化的肽、Cys的脲甲基 化(carbamidomethylation)作為固定修飾和脫酰胺作用(N，Q)和乙?；?K)作為可變 修飾。相似的參數(shù)用于SpectrumMill檢索。高于13的SpectrumMill蛋白質(zhì)評分、和高 于10的肽評分以及高于70%的評定的百分數(shù)強度(SPI)是初始擊中確認(initial hit validation)的截斷值。有效的蛋白質(zhì)鑒定需要至少兩個肽匹配。使分子量和pi值與凝膠 相互關聯(lián)來幫助證實鑒定。
與皮膚炎癥相關的TCISM的鑒定用PMA/離子霉素刺激人T細胞淋巴瘤H9細胞。使用離液裂解緩沖液(7M尿素、 2M硫脲、4% CHAPS)裂解細胞，然后使用可商購獲得的膜蛋白質(zhì)提取試劑盒分離膜蛋白。將 樣品(200 μ g)加載至Ilcm pH4-7的IPG條上，并在通過SDS page分離前聚焦30，OOOVhr0 使用ImageMaster軟件對點進行匹配和相對量測量。將在經(jīng)刺激的與未經(jīng)刺激的樣品之間 顯示大于2倍的變化的蛋白質(zhì)切下，用胰蛋白酶進行凝膠內(nèi)消化，然后使用Agilent Ultra 離子阱通過nanoLC/MS/MS進行分析。使用SpectrumMill和MASCOT算法鑒定蛋白質(zhì)。使 用Western印跡、siRNA抑制和細胞間接觸生物測定確認蛋白質(zhì)的鑒定、定量和功能。從完全細胞裂解物或膜分級分離樣品觀察到大約30個在初步實驗中在表達上發(fā) 生至少2倍的變化的蛋白質(zhì)點，并通過nLC/MS/MS對其進行了鑒定。在這些蛋白質(zhì)中，進 一步基于它們在人T細胞中的潛在功能研究5個潛在的候選物-膜聯(lián)蛋白VI、烯醇化酶、 FKBP4、CD81、CD316和埃茲蛋白(Ezrin)。這些蛋白的Western印跡顯示，F(xiàn)KBP4和埃茲蛋白 的表達在T細胞活化后顯著增加，而烯醇化酶的表達顯示減少。膜聯(lián)蛋白VI、⑶81和⑶316 的表達在PMA/離子霉素處理后未改變。特別有趣的是FKBP4和埃茲蛋白。FKBP或Π(506 結(jié)合蛋白據(jù)信是具有脯氨酰異構(gòu)酶活性的親免素，其用作包含脯氨酸殘基的蛋白質(zhì)的蛋白 質(zhì)折疊伴侶。其還結(jié)合用于治療罹患自身免疫性障礙的患者的免疫抑制劑分子他克莫司 (最初稱為Π(506)。FBKP-他克莫司復合物抑制鈣神經(jīng)素(calcineurin)，并可能通過干擾 FKBP4與干擾素調(diào)節(jié)因子-4(IRF-4)的結(jié)合來阻斷T淋巴細胞轉(zhuǎn)導途徑中的信號轉(zhuǎn)導。埃 茲蛋白據(jù)信是具有富含脯氨酸的區(qū)域的肌動蛋白結(jié)合蛋白。據(jù)信，其受磷酸肌醇脂質(zhì)調(diào)控 并且是Lck酪氨酸激酶的底物。最近發(fā)現(xiàn)，磷酸化的埃茲蛋白是促成SLE患者中增加的T 細胞極化、粘附和遷移的原因。據(jù)信，埃茲蛋白也是介導T細胞浸潤至皮膚從而引起導致銀 屑病的皮膚炎癥的至關重要的蛋白質(zhì)之一。本發(fā)明者還顯示，阿來西普(Amevive ；Biogen-Idec)和依法珠單抗(Raptiva ； Genentech)，兩種目前可獲得的銀屑病治療劑，在上述模型系統(tǒng)中不抑制T細胞-驅(qū)動的 MΦ的細胞因子產(chǎn)生。已報導這些試劑的機制通過介導功能障礙性免疫突觸(IS)的形成來 選擇性滅活人T細胞的亞群。不受任何理論的束縛，據(jù)信，在一些情況下，親免素(包括但 不限于FKBP4)，在與埃茲蛋白協(xié)同作用的情況下，可用作支架蛋白以保持突觸相互作用并 介導有效的經(jīng)由IS的信號轉(zhuǎn)導。這些T細胞靶的功能作用可通過使用siRNA抑制和細胞 間接觸生物測定(使用ECL進行細胞因子的讀出)來容易地評估。
體內(nèi)關節(jié)炎研究在第0天用CII+CFA免疫小鼠，在第21天用CII+IFA進行加強免疫。每組使用總共10只DBA雌性小鼠。如所顯示的施用藥物，在爪子腫脹/關節(jié)炎的初始癥狀顯現(xiàn)的 第一天開始施用。各組小鼠施用下表中所示的不同的TCISM調(diào)節(jié)劑。按照Bendele等人， Arthritis& Rheumatism，2000，43 (12)，pp 2648-2659 的方法評估平均關節(jié)炎評分(參見 下面的數(shù)據(jù))。圖16顯示不同TCISM-配體調(diào)節(jié)劑的平均關節(jié)炎評分(作為時間的函數(shù)) 的圖。圖17展示了顯示對照(大鼠IgG、HA)、抗-TNFa治療的小鼠和IL-Ira治療的小鼠 的圖。在圖17中，大鼠抗小鼠TNFa單克隆抗體(R&D Systems)用作陽性對照，以證實抑 制TNFa或稱為IL-lra(白細胞介素_1受體拮抗劑；Amgen)的IL-I抑制劑的治療效果。 在顯示膠原誘導的關節(jié)炎的癥狀后8天治療小鼠。 圖18是代表性小鼠的關節(jié)組織病理學。在圖18中，A圖表示從用同種型-對照 大鼠抗小鼠MAb治療的患有膠原誘導的關節(jié)炎的DBA小鼠(陰性對照)獲得的膝關節(jié)，其 顯示在該對照治療過程中沒有發(fā)生炎癥。圖B顯示存在最低限度的炎癥，其已在從陰性對 照小鼠獲得的膝關節(jié)中發(fā)生。圖C顯示在第+13天(即；在膠原誘導的關節(jié)炎的誘導后+13 天)產(chǎn)生嚴重的炎癥，且單核細胞和滑膜細胞浸潤至從用化合物H治療的小鼠(50mg/kg P.O.每天一次，始于第+1天)獲得的膝關節(jié)內(nèi)。圖D顯示在第+13天(即；在膠原誘導的 關節(jié)炎的誘導后+13天)產(chǎn)生嚴重的炎癥，且單核細胞和滑膜細胞浸潤至從用化合物H治 療的小鼠(50mg/kg P.O.每天一次，始于第+1天)獲得的膝關節(jié)內(nèi)。圖E顯示在第+13天 (即；在膠原誘導的關節(jié)炎的誘導后+13天)產(chǎn)生減輕的炎癥，且?guī)缀鯖]有單核細胞和滑膜 細胞浸潤至從用化合物C治療的小鼠(50mg/kg P.O.每天一次，始于第+1天)獲得的膝關 節(jié)內(nèi)。圖F顯示在第+13天(即；在膠原誘導的關節(jié)炎的誘導后+13天)產(chǎn)生減輕的炎癥， 幾乎沒有單核細胞和滑膜細胞的浸潤，從用化合物H治療的小鼠(50mg/kg P.O.每天一次， 始于第+1天)獲得的軟骨和骨得到保護。表不同的小分子TNFa抑制劑在鼠膠原誘導的 關節(jié)炎中的評估
對照Cpd X BLX50 BLX25 Cpd D Cpd H
0 0 0 0 0 0 0. 30.05 00. 2 0. 3 0
0.6.0.2 0. 1 0. 2 0. 75 0. 5
10. 3 0. 1 0. 25 10.85 1.2 0.5 0. 15 0.4 1. 25 1
1.50. 7 0. 2 0. 5 1. 5 1. 35 1.8 1. 2 0. 25 0.6 1. 75 1.45
21. 5 0. 35 0.85 2. 2 2 2.4 1.7 0.65 1.2 2.4 2.1
2.51.9 0. 75 1.4 2.6 2. 3 2. 7 2.2 0.8 1. 75 2.8 2.4
2.752. 3 0.95 1.95 2.9 2.65 2.85 2.4 1. 2232. 75
3.22. 5 1. 223.4 3
42.6 1.32.1 4.2 3.9
4.52.8 1.42.2 4. 75 4對照PBSCpd X :9-[(lR，3R)-反式-環(huán)戊烷-3-醇]腺嘌呤(腺苷A3拮抗劑；10mg/kg ；PO) BLX50 =BLX-WSl (p38a MAPK抑制劑；50mg/kg ；PO) BLX25 =BLX-WSl (p38a MAPK抑制劑；25mg/ kg ；PO)Cpd D :ρ38 α /β MAPK 抑制劑；50mg/kg ；PO ；Cpd H =PKC 抑制劑；50mg/kg ；PO
已提供本發(fā)明的上述論述用于舉例說明和描述目的。上述內(nèi)容不意欲將本發(fā)明限定為本文中公開的形式。雖然本發(fā)明的說明書已包括一個或多個實施方案和某些變化和改 變的描述，但在理解本公開內(nèi)容后，其他變化和改變也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如，其可在本 領域技術人員的能力和知識范圍內(nèi)。期望獲得這樣的權利，其包括備選實施方案至允許的 程度，包括交替的、可互換的和/或等價的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟(至所請求保護的那些)， 無論此類交替的、可互換的和/或等價的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟是否在本文中公開，并且 不意欲公開開放任何可獲專利保護的主題內(nèi)容。
權利要求
用于在受試者的單核細胞譜系來源的細胞中調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生的方法，該方法包括對所述受試者施用細胞因子調(diào)節(jié)劑，其中所述細胞因子調(diào)節(jié)劑選擇性結(jié)合T淋巴細胞的誘導T細胞細胞因子的表面分子(TCISM)-配體或單核細胞譜系來源的細胞的相應的TCISM-受體，由此所述細胞因子調(diào)節(jié)劑與TCISM-配體或TCISM-受體的結(jié)合在單核細胞譜系來源的細胞中調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生。
2.權利要求1的方法，其中所述TCISM-配體包括至少一種表1中所列的TCISM-配體。
3.權利要求2的方法，其中TCISM-配體包括⑶81、⑶21、⑶316、α-烯醇 化酶、FKBP4、 FKBP多基因家族的其他成員、或其組合。
4.權利要求1的方法，其中單核細胞譜系來源的細胞包括單核細胞譜系來源的巨噬細 胞、抗原呈遞細胞(APC)、樹突細胞、郎格漢斯細胞、庫普弗細胞或其組合。
5.權利要求1的方法，其中所述T淋巴細胞是⑶3+Τ淋巴細胞。
6.權利要求1的方法，其中被調(diào)節(jié)的細胞因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞 介素-1 β (IL-1 β )、白細胞介素-32 (IL-32)或其組合。
7.權利要求1的方法，其中TCISM-配體是存在于⑶3+淋巴細胞上的TCISM-配體。
8 權利要求7的方法，其中TCISM-配體包括⑶81、⑶21、⑶315、⑶316、α-烯醇化酶、 FKBP或其組合。
9.權利要求1的方法，其中所述TCISM-受體包括存在于CD68+抗原呈遞細胞上的 TCISM-受體。
10.權利要求9的方法，其中所述TCISM-受體包括⑶81的受體、⑶21的受體、⑶315 的受體、⑶316的受體、α-烯醇化酶的受體、結(jié)合蛋白的受體或其組合。
11.權利要求10的方法，其中所述TCISM-受體包括存在于⑶19、⑶21、⑶225、⑶315、 CD316、C3dR、CD19、CD81、BCR、CD9、CD81、KAI1/CD82 上的 TCISM-配體的受體或其組合。
12.用于治療受試者中由急性或慢性炎癥介導的臨床狀況的方法，該方法包括對所述 受試者施用細胞因子調(diào)節(jié)劑，其中所述細胞因子調(diào)節(jié)劑選擇性結(jié)合T淋巴細胞的誘導T細 胞細胞因子的表面分子(TCISM)-配體或單核細胞譜系來源的細胞的相應的TCISM-受體， 由此細胞因子調(diào)節(jié)劑對細胞因子的產(chǎn)生的調(diào)節(jié)用于治療由急性或慢性炎癥介導的臨床狀 況。
13.權利要求12的方法，其中所述細胞因子調(diào)節(jié)劑選擇性結(jié)合存在于CD3+淋巴細胞的 表面上的TCISM-配體。
14.權利要求12的方法，其中所述細胞因子調(diào)節(jié)劑選擇性結(jié)合存在于CD68+單核細胞 的表面上的TCISM-受體。
15.權利要求12的方法，其中所述臨床狀況包括自身免疫性疾病。
16.權利要求15的方法，其中T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病包括類風濕性關節(jié) 炎、多發(fā)性硬化、克羅恩病、銀屑病、銀屑病關節(jié)炎、格雷夫斯病、自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜 合征、遺傳性蛋白尿綜合征、I型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫 性甲狀腺炎、肝炎、獲得性免疫缺陷病(HIV)、移植物抗宿主病、同種異體移植疾病、哮喘或 其組合。
17.權利要求12的方法，其中所述臨床狀況包括癌癥。
18.權利要求12的方法，其中所述臨床狀況包括皮膚T細胞淋巴瘤、HTLV-I-相關皮膚T細胞淋巴瘤、HTLV-II-相關淋巴瘤、毛細胞白血病、特發(fā)性⑶4+T淋巴細胞減少癥、黑色素 瘤或其組合。
19.用于治療受試者的自身免疫性疾病的方法，該方法包括對需要此類治療的受試者 施用治療有效量的針對TCISM-配體的拮抗劑或針對相應的TCISM-受體的拮抗劑。
20.用于在受試者的單核細胞譜系來源的細胞中調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生的方法，該方法 包括對所述受試者施用siRNA，其中所述siRNA抑制T淋巴細胞的誘導T細胞細胞因子的表 面分子(TCISM)-配體的基因的轉(zhuǎn)錄，由此對TCISM-配體的轉(zhuǎn)錄的抑制在受試者中減少細 胞因子的產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了細胞因子調(diào)節(jié)劑和使用其在單核細胞譜系來源的細胞中調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生的方法。特別地，本發(fā)明的細胞因子調(diào)節(jié)劑選擇性地結(jié)合T淋巴細胞的誘導T細胞細胞因子的表面分子(TCISM)-配體或單核細胞譜系來源的細胞的相應的TCISM受體，從而在單核細胞譜系來源的細胞中調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生。
文檔編號C12Q1/68GK101821393SQ200880024647
公開日2010年9月1日 申請日期2008年6月5日 優(yōu)先權日2007年6月5日
發(fā)明者C·K·愛德華德三世, D·諾里斯, K·R·瓊謝爾, L·李 申請人:美國西聯(lián)生物制藥公司