月桂酸修飾sod的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種月桂酸修飾SOD的制備方法，主要解決現(xiàn)有技術(shù)中存在有毒物質(zhì)摻入、SOD室溫下長(zhǎng)期放置失去活性(失活時(shí)間短、半衰期短)而實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵是保存SOD的活性、目前尚無(wú)用于職業(yè)性皮膚病的先例等問(wèn)題。本發(fā)明通過(guò)采用一種月桂酸修飾SOD的制備方法，主要包括以下步驟：(1)月桂酸和氯化亞砜在50～140℃下反應(yīng)，然后穩(wěn)定回流，通過(guò)減壓蒸餾收集到124～127℃的餾分，即為活化月桂酸修飾劑；(2)將牛血SOD溶于緩沖液中，加入活化月桂酸修飾劑，攪拌反應(yīng)后急冷終止反應(yīng)，得到月桂酸修飾SOD產(chǎn)品的技術(shù)方案較好地解決了上述問(wèn)題，可用于月桂酸修飾SOD制備中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】月桂酸修飾SOD的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種月桂酸修飾S0D的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，簡(jiǎn)稱(chēng)S0D)是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi) 的金屬酶，是催化超氧陰離子自由基（〇'2_)歧化反應(yīng)的酶類(lèi)，是超氧陰離子自由基（〇' 2_)的 清除劑，也是一種具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值的藥用酶，它能治療被超氧陰離子自由基（〇'2_)傷 害的有關(guān)疾病。臨床上用于治療氧自由基誘發(fā)的腫瘤，炎癥，缺血-再灌注損傷，氧中毒、帕 金斯綜合癥，老年癡呆癥，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、衰老、多種皮膚病等。
[0003] 天然的S0D存在著半衰期短、穩(wěn)定性較差、長(zhǎng)期存放失活、遇熱失活、具有免疫原 性等問(wèn)題。上述問(wèn)題國(guó)內(nèi)外均主要通過(guò)對(duì)S0D進(jìn)行化學(xué)修飾解決。主要修飾劑為聚乙二醇、 多糖類(lèi)物質(zhì)、小分子脂肪酸等，但大分子修飾的S0D不易透過(guò)皮膚與細(xì)胞膜。
[0004] 閻家麒等（閻家麒，謝文正，月桂酸修飾超氧化物歧化酶的制備及其性質(zhì)研究，生 物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1994,21 (2) :154-157)報(bào)道采用月桂酸修飾牛血S0D的方法，采 用氯化亞砜作為活化劑，使用了催化劑吡啶DMF活化月桂酸，活性回收率為93%，修飾率為 80 %。但吡啶屬于有毒類(lèi)物質(zhì)，體系中盡量不要引入這種物質(zhì)。
[0005] 目前，尚未見(jiàn)修飾S0D應(yīng)用于職業(yè)性皮膚病防治的報(bào)道。采用S0D防治職業(yè)性皮 膚病必須解決S0D長(zhǎng)期放置、耐熱、易于透過(guò)皮膚等問(wèn)題，且修飾劑及修飾過(guò)程采用的催化 劑等必須無(wú)毒。本發(fā)明有針對(duì)性的解決了該問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中存在有毒物質(zhì)摻入、長(zhǎng)期放置活性短、 耐熱性差的問(wèn)題，提供一種新的月桂酸修飾S0D的制備方法。該方法用于月桂酸修飾S0D 制備中，具有制備過(guò)程無(wú)有毒物質(zhì)摻入、耐熱性好、長(zhǎng)期放置活性長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種月桂酸修飾S0D的制備方法， 主要包括以下步驟：（1)活化月桂酸修飾劑的合成：月桂酸和氯化亞砜在50?140°C下反 應(yīng)，待至少80 %的月桂酸轉(zhuǎn)化后穩(wěn)定回流，然后通過(guò)減壓蒸餾收集到124?127°C的餾分， 即為活化月桂酸修飾劑；（2)月桂酸修飾S0D的制備：將牛血S0D溶于緩沖液中，配制成S0D 溶液，加入活化月桂酸修飾劑，在30?50°C下攪拌反應(yīng)后急冷終止反應(yīng)，得到月桂酸修飾 S0D產(chǎn)品。
[0008] 上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述月桂酸在50?60°C水浴中溶化后加入氯化亞砜， 在65?135°C下反應(yīng)，待90%月桂酸已轉(zhuǎn)化后，再穩(wěn)定回流0. 5?2. 5h。
[0009] 上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，步驟（1)中通過(guò)減壓蒸餾，蒸去多余的未反應(yīng)物，然后 繼續(xù)蒸餾，收集110?134°C餾分，通過(guò)蒸餾在110?134°C餾分，棄去140°C以上餾分，再重 蒸餾，進(jìn)一步提取124?127°C的餾分，得到活化月桂酸。
[0010] 上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述緩沖液為磷酸氫鉀或四硼酸鈉中的至少一種。 toon] 上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述步驟（1)中制備的活化月桂酸修飾劑待用時(shí)需放 置于冰箱中。
[0012] 上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述步驟（2)中的S0D溶液中的S0D濃度為2?5mg/ ml，加入活化月桂酸修飾劑，在35?45°C下攪拌反應(yīng)0. 5?1. 5小時(shí)后急冷終止反應(yīng)。
[0013] 上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述步驟（2)中的活化月桂酸修飾劑與S0D的重量比為 1 ?20 :1。
[0014] 上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述步驟（2)中用冷水浴終止反應(yīng)；步驟（1)的反應(yīng)壓 力為常壓，步驟（2)的反應(yīng)壓力以表壓計(jì)為常壓。
[0015] 本專(zhuān)利所述的月桂酸修飾S0D的制備過(guò)程沒(méi)有采用有毒的催化劑，制備的月桂酸 修飾S0D比活達(dá)到2950U/mg，修飾率為80% (采用三硝基苯磺酸TNBS法測(cè)定），月桂酸修 飾S0D溶液在20°C條件下，酶活性至少可保存2. 5年，具有較好的技術(shù)效果。
[0016] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不僅限于本實(shí)施例。

【具體實(shí)施方式】
[0017]【實(shí)施例1】
[0018] ⑴活化月桂酸修飾劑的合成
[0019] 取月桂酸，在50°C水浴中溶化，加入氯化亞砜，月桂酸與氯化亞砜的重量比為5 : 1，反應(yīng)壓力為常壓，滴加氯化亞砜速率控制在2. 5小時(shí)滴加25%的總量，反應(yīng)溫度為65°C， 待90%月桂酸已轉(zhuǎn)化后，再穩(wěn)定回流1小時(shí)。然后減壓蒸餾，蒸去多余的未反應(yīng)物質(zhì)。然后 繼續(xù)蒸餾，收集110?134°C餾分，餾出速度0. 7?0. 8滴/秒。共需40分鐘，留下140°C 以上的餾分，棄去。再重蒸餾110?134°C餾分兩次，收集124?127°C餾分，得到高純的活 化月桂酸修飾劑，置冰箱中保存待用。
[0020] (2)月桂酸修飾S0D的制備
[0021] 將牛血S0D溶于緩沖液中，配制成3. 17mg/ml S0D溶液，緩沖液為磷酸氫鉀，按 S0D :活化月桂酸修飾劑=1 :6. 1的重量比加入活化月桂酸，在39°C水浴中攪拌1小時(shí)，反 應(yīng)壓力為常壓，用冷水浴終止反應(yīng)。用TNBS法測(cè)定修飾率。
[0022] 制備得到月桂酸修飾S0D比活為2950U/mg，修飾率為80%，月桂酸修飾S0D溶液 在20°C條件下，酶活性至少可保存2. 5年，并有很好的耐熱性。
[0023] 月桂酸修飾S0D膏劑在青島染料廠分散藍(lán)車(chē)間使用。分散藍(lán)作業(yè)工人主要接觸蒽 醌及其衍生物，此類(lèi)化學(xué)物質(zhì)對(duì)工人的主要危害表現(xiàn)在皮膚上。接觸的其它毒物為濃硫酸、 濃硝酸、燒堿、亞硫酸鈉、溴素、苯酚等。應(yīng)用結(jié)果表明，使用月桂酸修飾S0D的112人中，未 發(fā)現(xiàn)一例全身或局部不良反應(yīng)，接觸性皮炎有效率達(dá)71. 4%，色素沉著有效率為41. 7%， 對(duì)于預(yù)防和治療職業(yè)性因素引起的皮膚損害具有較好效果。
[0024] 【實(shí)施例2】
[0025] (1)活化月桂酸修飾劑的合成
[0026] 取月桂酸，在60°C水浴中溶化，加入氯化亞砜，月桂酸與氯化亞砜的重量比為 7 :1，反應(yīng)壓力為常壓，滴加氯化亞砜速率控制在2. 5小時(shí)滴加25%的總量，反應(yīng)溫度為 135°C，待80%月桂酸已轉(zhuǎn)化后，再穩(wěn)定回流2. 5小時(shí)。然后減壓蒸餾，蒸去多余的未反應(yīng)物 質(zhì)。然后繼續(xù)蒸餾，收集110?134°C餾分，餾出速度0.7?0.8滴/秒。共需35分鐘，留 下140°C以上的餾分，棄去。再重蒸餾110?134°C餾分兩次，收集124?127°C餾分，得到 高純的活化月桂酸修飾劑，置冰箱中保存待用。
[0027] (2)月桂酸修飾S0D的制備
[0028] 將牛血S0D溶于緩沖液中，配制成2. lmg/ml S0D溶液，緩沖液為四硼酸鈉，按S0D : 活化月桂酸修飾劑=1 :8. 4的重量比加入活化月桂酸，在35°C水浴中攪拌1. 5小時(shí)，反應(yīng) 壓力為常壓，用冷水浴終止反應(yīng)。用TNBS法測(cè)定修飾率。
[0029] 制備得到月桂酸修飾S0D比活為2910U/mg，修飾率為81 %，月桂酸修飾S0D溶液 在20°C條件下，酶活性至少可保存2. 5年，并有很好的耐熱性。
【權(quán)利要求】
1. 一種月桂酸修飾SOD的制備方法，主要包括以下步驟：（1)活化月桂酸修飾劑的合 成：月桂酸和氯化亞砜在50?140°C下反應(yīng)，待至少80%的月桂酸轉(zhuǎn)化后穩(wěn)定回流，然后通 過(guò)減壓蒸餾收集到124?127°C的餾分，即為活化月桂酸修飾劑；（2)月桂酸修飾SOD的制 備：將牛血SOD溶于緩沖液中，配制成SOD溶液，加入活化月桂酸修飾劑，在30?50°C下攪 拌反應(yīng)后急冷終止反應(yīng)，得到月桂酸修飾SOD產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述月桂酸修飾SOD的制備方法，其特征在于所述月桂酸在50? 60°C水浴中溶化后加入氯化亞砜，在65?135°C下反應(yīng)，待90%月桂酸已轉(zhuǎn)化后，再穩(wěn)定回 流 0. 5 ?2. 5h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述月桂酸修飾SOD的制備方法，其特征在于步驟（1)中通過(guò)減 壓蒸餾，蒸去多余的未反應(yīng)物，然后繼續(xù)蒸餾，收集110?134°C餾分，通過(guò)蒸餾在110? 134°C餾分中進(jìn)一步提取124?127°C的餾分，得到活化月桂酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述月桂酸修飾SOD的制備方法，其特征在于所述緩沖液為磷酸氫 鉀或四硼酸鈉中的至少一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述月桂酸修飾SOD的制備方法，其特征在于所述步驟（1)中制備 的活化月桂酸修飾劑待用時(shí)需放置于冰箱中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述月桂酸修飾SOD的制備方法，其特征在于所述步驟（2)中的SOD 溶液中的SOD濃度為2?5mg/ml，加入活化月桂酸修飾劑，在35?45°C下攪拌反應(yīng)0. 5? 1. 5小時(shí)后急冷終止反應(yīng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述月桂酸修飾SOD的制備方法，其特征在于所述步驟（2)中的活 化月桂酸修飾劑與SOD的重量比為1?20 :1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述月桂酸修飾SOD的制備方法，其特征在于所述步驟（2)中用冷 水浴終止反應(yīng)；步驟（1)的反應(yīng)壓力為常壓，步驟（2)的反應(yīng)壓力為常壓。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述月桂酸修飾SOD的制備方法，其特征在于加入的月桂酸與氯化 亞砜的重量比為1?10 :1。
【文檔編號(hào)】C12N9/96GK104195126SQ201410395824
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】巫志鵬, 高艷霞, 葛春濤, 王建偉 申請(qǐng)人:中國(guó)石油化工股份有限公司, 中國(guó)石油化工股份有限公司青島安全工程研究院