單個多能干細胞培養(yǎng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多能干細胞培養(yǎng)領域以及易于在工業(yè)水平培養(yǎng)多能干細胞的方法。本發(fā)明提供了用于已經(jīng)用酶釋放為單細胞的多能干細胞的維持、傳代和分化的方法。尤其是,本發(fā)明提供了用于已經(jīng)釋放為單細胞的多能干細胞的維持、傳代和分化,而沒有隨后的多能性損失,并且沒有染色體異常增加的方法。
【專利說明】單個多能干細胞培養(yǎng)
[0001] 申請為分案申請,原申請的申請日為2008年6月30日,申請?zhí)枮?200880104926. 8 (PCT/US2008/068782),發(fā)明名稱為"單個多能干細胞培養(yǎng)"。
[0002] 本發(fā)明涉及多能干細胞培養(yǎng)領域以及易于在工業(yè)水平培養(yǎng)多能干細胞的方法。
[0003] 背景
[0004] 多能干細胞,例如胚胎干細胞,具有分化成為所有成體細胞類型的能力。同樣地, 胚胎干細胞可以是由于疾病、感染或先天性異常損害的器官的替換細胞和組織的來源。體 外增殖細胞同時維持它們多能性的困難妨礙了胚胎干細胞作為替換細胞來源使用的潛力。
[0005] 當前培養(yǎng)未分化的胚胎干細胞的方法需要復雜的培養(yǎng)條件,例如在有飼養(yǎng)細胞層 的情況下培養(yǎng)該胚胎干細胞。可選擇地,通過接觸飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物獲得的培養(yǎng)基可以用來 培養(yǎng)胚胎干細胞。采用這些方法的培養(yǎng)系統(tǒng)往往使用從與培養(yǎng)的干細胞不同的物種獲得的 細胞(異種細胞)。另外,這些培養(yǎng)系統(tǒng)可能補充動物血清。
[0006] 例如,Reubinoff 等(Nature Biotechnologyl8 :399_4〇4(2〇00))和 Thompson 等 (Science6Novemberl998 :Vol. 282. no. 5391,ρρ· 1145-1147)公開了使用小鼠胚胎成纖維 細胞飼養(yǎng)細胞層從人類胚泡的胚胎干細胞系的培養(yǎng)。
[0007] 在另一個例子中,W02005014799公開了用于哺乳動物細胞維持、增殖和分化的條 件培養(yǎng)基。W02005014799陳述:"根據(jù)本發(fā)明產生的培養(yǎng)基以鼠科動物細胞,尤其是那些稱 為MMH(Met鼠科動物肝細胞)的已分化且永生化的轉基因肝細胞的細胞分泌活性為條件。"
[0008] 然而,異種細胞或異種細胞產物的使用增加了通過這樣的方法產生的胚胎干細胞 群可能被病毒和/或免疫原性異蛋白質污染的風險。
[0009] Richards 等(Stem Cells21 :546_556, 2003)評估了一組 11 種不同的人類成體、 胎兒和初生兒飼養(yǎng)細胞飼養(yǎng)物層支持人類胚胎干細胞培養(yǎng)的能力。Richards等陳述:"在 成體皮膚成纖維細胞飼養(yǎng)物上培養(yǎng)的人類胚胎干細胞系保留了人類胚胎干細胞形態(tài)并且 仍然是多能的"。
[0010] US6642048公開了在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)中支持靈長類動物多能干(pPS)細胞生長的培 養(yǎng)基,以及可用于生產這樣的培養(yǎng)基的細胞系。US6642048陳述:"本發(fā)明包括從胚胎組織 獲得的或從胚胎干細胞分化的間充質細胞和成纖維細胞樣細胞系。在本公開中描述和例示 了取得這樣的細胞系,加工培養(yǎng)基,以及使用該條件培養(yǎng)基生長干細胞的方法。"
[0011] US20020072117公開了產生在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)中支持靈長類動物多能干細胞生長的 培養(yǎng)基的細胞系。使用的細胞系是從胚胎組織獲得的或從胚胎干細胞分化的間充質細胞和 成纖維細胞樣細胞系。US20020072117還公開了該細胞系作為初始飼養(yǎng)細胞層的用途。
[0012] 在另一個例子中,Wang等(Stem Cells23 :1221-1227,2005)公開了在來源于人類 胚胎干細胞的飼養(yǎng)細胞層上長期生長人類胚胎干細胞的方法。
[0013] 在另一個例子中,Xu等(Stem Cells22 :972-980,2004)公開了從人類胚胎干細胞 衍生物獲得的條件培養(yǎng)基,所述衍生物通過遺傳修飾以過表達人類端粒酶逆轉錄酶。
[0014] 在另一個例子中,Stojkovic 等(Stem Cells200523 :306-314,2005)公開了一種 來源于人類胚胎干細胞自發(fā)分化的飼養(yǎng)細胞系統(tǒng)。
[0015] 在另一個例子中,Miyamoto 等(Stem Cells22 :433_440, 2004)公開了一種從人類 胎盤獲得飼養(yǎng)細胞的來源。
[0016] Amit等(Biol. R印rod68 :2150-2156,2003)公開了一種來源于人類包皮的飼養(yǎng)細 胞層。
[0017] 在另一個例子中,Inzunza 等(Stem Cells23 :544_549, 2005)公開了 一種來自人 類生后包皮成纖維細胞的飼養(yǎng)細胞層。
[0018] 一種可供選擇的培養(yǎng)系統(tǒng)使用補充有能夠促進胚胎干細胞增殖的生長因子的無 血清培養(yǎng)基。例如,〇^〇11等出丨〇1?印1'〇(1001 :10.1095/1^〇11'印1'〇(1.105.046870,2005 年 10月19日)公開了一種無飼養(yǎng)物、無血清的培養(yǎng)系統(tǒng),其中胚胎干細胞在補充有能夠觸發(fā) 胚胎干細胞自我更新的不同生長因子的非條件血清替換(SR)培養(yǎng)基中維持。
[0019] 在另一個例子中,Levenstein 等(Stem Cells24 :568-574,2006)公開了在沒有成 纖維細胞或條件培養(yǎng)基的情況下,使用補充有bFGF的培養(yǎng)基長期培養(yǎng)人類胚胎干細胞的 方法。
[0020] 在另一個例子中,US20050148070公開了在沒有血清和成纖維細胞飼養(yǎng)細胞的確 定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類胚胎干細胞的方法,該方法包括:在包含白蛋白、氨基酸、維生素、 礦物質、至少一種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代替物、至少一種胰島素或胰島素代替物的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)干細胞,該培養(yǎng)基基本上不含哺乳動物胎兒血清并且包含至少大約l〇〇ng/ml的能 夠活化成纖維細胞生長因子信號傳導受體的成纖維細胞生長因子,其中該生長因子從除成 纖維細胞飼養(yǎng)層以外的來源提供,在沒有飼養(yǎng)細胞或條件培養(yǎng)基的情況下該培養(yǎng)基支持干 細胞以未分化的狀態(tài)的增殖。
[0021] 在另一個例子中,US20050233446公開了一種用于培養(yǎng)干細胞的確定成分培養(yǎng)基, 包括未分化的靈長類動物原始干細胞。在溶液中,該培養(yǎng)基與培養(yǎng)的干細胞相比基本上是 等滲的。在給定的培養(yǎng)中,特定的培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基以及支持該原始干細胞基本上未 分化的生長所必需的量的bFGF、胰島素和抗壞血酸。
[0022] 在另一個例子中,US6800480陳述"在一種實施方案中,提供了一種用于以基本上 未分化的狀態(tài)生長靈長類動物來源的原始干細胞的細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基,其包括有效支持靈長 類動物來源的原始干細胞生長的低滲透壓、低內毒素的基礎培養(yǎng)基。該基礎培養(yǎng)基與有效 支持靈長類動物來源的原始干細胞生長的營養(yǎng)血清以及選自飼養(yǎng)細胞和來源于飼養(yǎng)細胞 的細胞外基質組分的基質組合。該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑、以及選自核苷和 丙酮酸鹽的第一生長因子。"
[0023] 在另一個例子中,US20050244962陳述:"在一個方面本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)靈長 類動物胚胎干細胞的方法。在基本上不含哺乳動物胎兒血清(優(yōu)選還基本上不含任何動物 血清)和有從并非僅僅是(other than just)成纖維細胞飼養(yǎng)層的來源提供的成纖維細胞 生長因子的培養(yǎng)物中培養(yǎng)干細胞。在一種優(yōu)選的形式中,通過添加足夠的成纖維細胞生長 因子使以前需要來維持干細胞培養(yǎng)的成纖維細胞飼養(yǎng)層不必要。"
[0024] 在另一個例子中,W02005065354公開了一種基本上無飼養(yǎng)物和無血清的確定成分 的、等滲的培養(yǎng)基,包括:a)基礎培養(yǎng)基;b)足夠支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長 的量的bFGF ;c)足夠支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長的量的胰島素;和d)足夠 支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長的量的抗壞血酸。
[0025] 在另一個例子中,W02005086845公開了一種用于維持未分化的干細胞的方法,所 述方法包括使干細胞接觸足夠維持該細胞未分化狀態(tài)的量的轉化生長因子β (TGFi3)家 族蛋白質成員、成纖維細胞生長因子(FGF)家族蛋白質成員或煙酰胺(NIC)足夠的時間以 獲得需要的結果。
[0026] 胚胎干細胞提供了用于研究和藥物篩選的潛在資源。目前,人類ES細胞系的大規(guī) 模培養(yǎng)是有問題的并且提供了相當?shù)奶魬?zhàn)。一種對這些挑戰(zhàn)可能的解決方案是以單細胞傳 代和培養(yǎng)人類胚胎干細胞。單細胞更適于標準組織培養(yǎng)技術,例如計數(shù)、轉染等等。
[0027] 例如,Nicolas等提供了一種用于從用慢病毒載體遺傳修飾之后通過熒光激 活細胞分選法(FACS)分離的單細胞產生和擴增hES細胞系的方法。Stem Cells and Development(2007),16(1),109-118。
[0028] 在另一個例子中,美國專利申請US2005158852公開了一種"用于改良單個人類胚 胎干細胞的生長和存活的方法。該方法包括下列步驟:獲得單個未分化的HES細胞;把該單 個未分化細胞與細胞外基質(ECM)混合以環(huán)繞該細胞;以及在生長環(huán)境中把該混合物接種 到具有營養(yǎng)培養(yǎng)基的飼養(yǎng)細胞上"。
[0029] 在另一個例子中,Sidhu,KS et al(Srem Cells Dev. 2006Feb ;15(1) :61-9.) "描 述了三種人類胚胎干細胞(hESC)克隆hES3. 1、3. 2和3. 3的首次報道,它們通過流式細 胞術分選單細胞制劑來源于親本系hES3。在細胞分選前后單細胞制劑的成活力保持> 98%,,。
[0030] 然而,人類胚胎干細胞以單細胞傳代和培養(yǎng)引起遺傳異常和多能性損失。培養(yǎng)條 件在多能性和遺傳穩(wěn)定性的維持中是重要的。通常,hES細胞系的傳代是手動實施的或使 用酶性試劑,例如膠原酶、liberase或分散酶。
[0031] 例如,Draper JS等指出"在五個獨立的時期三種獨立的人類胚胎干細胞系 中存在包括染色體17q增加的核型改變。"(Nat Biotechnol. 2004Jan ;22 (1) :53-4. Epub2003Dec7)〇
[0032] 在另一個例子中,Buzzard等陳述,"我們僅僅檢測到一種核型改變事件......使 用的培養(yǎng)方法可能對我們的結果具有一些影響,已知我們的方法與大多數(shù)其它小組使用的 那些方法顯然不同。通常在使用破裂的移液管的邊緣首次剖解菌落7天后傳代人類ES細 胞......沒有細胞離散的酶或化學方法合并入該方法。我們推測這可能解釋了在我們手 中的 hES 細胞的相對細胞遺傳彈性。"(Nat Biotechnol. 2004Apr ;22 (4) :381-2 ;author reply382)。
[0033] 在另一個例子中,Mitalipova麗等陳述"批量傳代方法......會使非整倍體 細胞群體在培養(yǎng)中的延長傳代后永生,但是可用于較短的時期(直到至少15代)而不損 害核型......在長期手動繁殖條件繼之以在比手動傳代方法需要更大量的hES細胞的 實驗中有限量的傳代下維持hES細胞的正常的核型是可能的,單獨地,可以提供"。(Nat Biotechnol. 2005Jan ;23(1) :19-20)。
[0034] 在另一個例子中,Heng BC等陳述"結果顯示第二種流程(使用溫和吸取的胰酶消 化)比第一種流程(使用刮擦的膠原酶處理)對細胞成活力損害更少。這隨后轉變?yōu)楦?的凍融存活率"。(Biotechnology and Applied Biochemistry (2007),47(1),33-37)。
[0035] 在另一個例子中,Hasegawa K.等陳述,"我們建立了能夠容忍完全離解的hESC亞 系。這些細胞顯示出高的再平板接種(r印lating)效率以及高的克隆效率并且它們維持它 們分化成為三種胚層的能力。"(Stem Cells. 2006Dec ;24(12) :2649-60. Epub2006Aug24)。
[0036] 概述
[0037] 本發(fā)明提供了用于已經(jīng)用酶釋放為單細胞的多能干細胞的維持、傳代和分化的方 法。尤其是,本發(fā)明提供了用于已經(jīng)釋放為單細胞的多能干細胞的維持、傳代和分化,而沒 有隨后的多能性損失,并且沒有染色體異常增加的方法。
[0038] 在一個實施方案中,本發(fā)明提供了用于分化多能干細胞的方法,包括下列步驟:
[0039] a)成簇培養(yǎng)多能干細胞,
[0040] b)釋放該多能干細胞為單細胞,
[0041] c)平板接種該單個多能干細胞到組織培養(yǎng)基質上,和
[0042] d)分化該細胞。
[0043] 在一個實施方案中,本發(fā)明提供了用于維持多能干細胞的方法,包括下列步驟:
[0044] a)獲得多能干細胞,
[0045] b)釋放該多能干細胞為單細胞,和
[0046] c)平板接種該單個多能干細胞到組織培養(yǎng)基質上。
[0047] 在一個實施方案中,本發(fā)明提供了用于傳代多能干細胞的方法,包括下列步驟:
[0048] a)獲得多能干細胞簇,
[0049] b)釋放該多能干細胞為單細胞,
[0050] c)平板接種該單個多能干細胞到組織培養(yǎng)基質上,
[0051] d)允許該單個多能干細胞擴增,
[0052] e)釋放該單個多能干細胞,和
[0053] f)平板接種該單個多能干細胞到新的組織培養(yǎng)基質上。
[0054] 附圖簡述
[0055] 圖1 :在MEF條件培養(yǎng)基中1 : 30減少的生長因子MATRIGEL?上生長的H9ccp33 人類ES細胞的4X放大圖像。
[0056] 圖2 :在分化處理以產生定形內胚層之后表達CXCR4的細胞的百分數(shù)。深灰色:在 第45和55代之間的H1細胞簇(Hlcc)進行的六次DE分化實驗的平均值。黑色:用第47 和54代的H1單細胞(Hlsc)進行的兩次DE分化實驗的平均值。白色:在第37和55代之 間的H9細胞簇(H9cc)進行的五次DE分化實驗的平均值。淺灰:在第36和48代之間的H9 單細胞(H9sc)進行的三次DE分化實驗的平均值。誤差條表示重復實驗的標準差。
[0057] 圖3 :在接觸14或17天的胰腺內分泌分化流程之后通過實時PCR進行的基因表 達分析。A.分析第37代的H9單細胞和細胞簇。B.延續(xù)Hlp47和H9p37細胞簇和單細胞 至胰腺內胚層階段。在第14和17天之后Pdxl表達。對每一數(shù)據(jù)集把未經(jīng)處理細胞的指 示標記的基因表達設置為值1。
[0058] 圖4 :在MEF條件培養(yǎng)基中1 : 30減少的生長因子MATRIGEL?上生長的H9scp22 人類ES單細胞的4X放大圖像。
[0059] 圖5 :通過FACS評估hES細胞的多能性標記表達。標明的標記陽性細胞的百分數(shù) 列在X軸上。
[0060] 圖6 :以簇傳代38次隨后以單細胞傳代20次的H9hES單細胞的染色體分散。
[0061] 圖7 :在定形內胚層分化期間H9單細胞和細胞簇的比較。在細胞接觸定形內胚層 分化流程之后顯示了 CXCR4陽性細胞的百分數(shù)。對于H9sc-p N = 2而對于H9cc N = 5。 誤差條表示重復實驗的平均值的標準差。
[0062] 圖8:在H9單細胞(第22代)分化之后胰腺內胚層標記的增加。顯示了在11、14 或17天的胰腺內分泌分化之后通過實時PCR進行的基因表達分析。第14和17天的值是 一塊六孔板的兩個孔的平均值。
[0063] 圖9 :hES單細胞可以在MEF上分化。在MEF飼養(yǎng)物上生長并分化為定形內胚層的 Hlscp4細胞的FACS結果。定形內胚層標記CXCR4(⑶184)在89%的細胞中表達而在未分 化細胞中為〇% (參見圖5)。
[0064] 圖10 :hES單細胞(H9scpl8)可以在96孔格式中分化為定形內胚層。顯示了 Soxl7 陽性檢測的免疫熒光數(shù)據(jù)。8個孔在實驗的持續(xù)時間中用MEF條件培養(yǎng)基處理:MEF培養(yǎng) 基。8個孔用不含組分的基礎分化培養(yǎng)基處理:無化合物。對每一數(shù)據(jù)條算出8個孔的重 復實驗數(shù)據(jù)組的平均值。總共40個孔各自用Wnt3a或Gsk3b抑制劑處理并對每一數(shù)據(jù)組 算出平均值。誤差條表示每一重復實驗組的標準差。
[0065] 圖11 :使用hES單細胞(H9scpl9)的藥效團篩選。測試了總共13種實驗小分子 化合物在定形內胚層分化流程中替代fct3a的能力。顯示了三種有效的化合物。數(shù)據(jù)組表 示在兩個或更多孔中Soxl7陽性細胞的平均值。使用以MEF條件培養(yǎng)基或基礎培養(yǎng)基處理 的細胞作為陰性對照
[0066] 圖12 :評估H9p33hES細胞簇和單細胞之間的轉染效率。用8 μ 1 Lipofectamine2000 (Invitrogen,Carlesbad,CA)和 4 或 8 μ g DNA (分別是黑色和灰色條) 把CMV-GFP轉染進入細胞。
[0067] 圖13 :在MEF上生長然后以簇或單細胞傳代至MATRIGEL?的HlhES細胞的相位顯 微照片。用膠原酶從MEF傳代至MATRIGEL?的第37代HlhES細胞形成具有一些松散分化 的細胞的分散、高密度的菌落。用Accutase?或TrypLE?傳代一次的HlhES細胞形成具有 高密度的已分化細胞的區(qū)塊(pocket)的單細胞層培養(yǎng)物。
[0068] 圖14 :直接從MEFS傳代至MATRIGEL?的HlhES細胞以單細胞自發(fā)地分化。畫面 A :在用Accutase?從MEFs到MATRIGEL?傳代2次之后仍然在群中的細胞的百分數(shù)。畫面 B :在用Accutase?從MEF到MATRIGEL?傳代2次之后hES細胞中的多能性和分化標記的 表達。畫面C :在用Accutase?從MEF到MATRIGEL?傳代2次之后HlhES細胞的相位顯微 照片。
[0069] 詳述
[0070] 為了公開的清楚,而不是作為限制,把本發(fā)明的詳細說明分成下列小部分,其描述 或例示本發(fā)明的某些特征、實施方案或應用。
[0071] 定義
[0072] 干細胞是通過它們在單細胞水平自我更新和分化產生后代細胞兩種能力定義的 未分化細胞,包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和終末分化細胞。干細胞還以它們在體外 分化成為來自多個胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的多種細胞譜系的功能性細胞,以及 在移植之后產生多個胚層的組織和在注射進入胚泡之后相當大地促成大多數(shù),如果不是全 部,組織的能力為特征。
[0073] 干細胞通過它們的發(fā)育潛力分類為:(1)全能的,表示能產生所有胚胎和胚外 細胞類型;(2)多能的(pluripotent),表示能產生所有胚胎細胞類型;(3)多潛能的 (multipotent),表示能產生一種亞型的細胞譜系,但是都在一種特定的組織、器官或生理 系統(tǒng)之內(例如,造血干細胞(HSC)可以產生包括HSC(自我更新)、血細胞限制性寡能祖細 胞和為血液正常組分的所有細胞類型和元件(例如血小板)的后代);(4)寡能的,表示能 產生比多潛能(multipotent)干細胞更限制性的亞型的細胞譜系;和(5)偏能的,表示能產 生單一細胞譜系(例如生精子的干細胞)。
[0074] 分化是非特化的("未定型的")或較少特化的細胞獲得特化細胞(例如神經(jīng)細胞 或肌細胞)特征的過程。已分化的或分化誘導的細胞是在細胞譜系中具有更加特化的("定 型的")位置的細胞。當應用于分化過程時,術語"定型的"指的是在分化途徑中進行至一 個節(jié)點的細胞,在正常環(huán)境下,在該節(jié)點,它將繼續(xù)分化成為特定細胞類型或細胞類型的亞 型,而不能在正常環(huán)境下分化成為不同的細胞類型或回復到較少分化的細胞類型。脫分化 指的是細胞回復到在細胞譜系中較少特化的(或定型的)位置的過程。如本文使用的,細 胞譜系規(guī)定了細胞的遺傳性,即,它來自哪種細胞和它可以產生什么細胞。細胞譜系把細胞 置于發(fā)育和分化的遺傳圖式中。譜系特異性標記指的是與感興趣的譜系的細胞表型特異性 相關的特征并且可用于評價未定型細胞至感興趣的譜系的分化。
[0075] 在培養(yǎng)中多種術語用于描述細胞。"維持"通常指的是在易于細胞生長和/或分裂 的條件下放入生長培養(yǎng)基中的細胞,其可能或可能不產生更大群的細胞。"傳代"指的是把 細胞從一個培養(yǎng)容器移去并在易于細胞生長和/或分裂的條件下把它們置于第二個培養(yǎng) 容器的過程。
[0076] 特定的細胞群或細胞系有時指的是它已經(jīng)傳代的次數(shù)或以其為特征。例如,已經(jīng) 傳代10次的培養(yǎng)細胞群可以稱為P10培養(yǎng)物。原始培養(yǎng)物,即在從組織的細胞分離之后的 第一培養(yǎng)物,指定為P0。在第一次繼代培養(yǎng)之后,細胞被描述為第二培養(yǎng)物(P1或第1代)。 在第二次繼代培養(yǎng)之后,細胞成為第三培養(yǎng)物(P2或第2代),等等。本領域技術人員可以 理解在傳代期間可能有許多次種群加倍;因此培養(yǎng)物種群加倍的數(shù)目大于傳代數(shù)。在傳代 之間的時期細胞的擴增(即種群加倍的數(shù)目)取決于許多因素,包括但不限于接種密度、基 質、培養(yǎng)基、生長條件和傳代之間的時間。
[0077] 本文使用的"AFP"或"甲胎蛋白"指的是在肝臟發(fā)育起始時產生的一種抗原。AFP 還可以在胚外細胞中表達。
[0078] " β -細胞譜系"指的是具有轉錄因子rox-i和至少一種下列轉錄因子陽性基因表 達的細胞:NGN-3、Nkx2. 2、Nkx6. 1、NeuroD、Isl-1、HNF-3 β、MAFA、Pax4 和 Pax6。表達 β 細胞譜系特征標記的細胞包括β細胞。
[0079] 本文使用的"Brachyury"是一種Τ-框(box)基因家族成員。它是原條和中胚層 細胞的標記。
[0080] 本文使用的"表達定形內胚層譜系特征標記的細胞"指的是表達至少一種下列標 記的細胞:S0X-17、GATA-4、HNF-3 β、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、fcachyury、Mix 樣同源框蛋 白質40卩40)48、6〇11168〇(161'11^11伍01^5)、01?4、卩6卩17、6八丁八-6、〇父0?4、(:-1(行、0)99或0^2。 表達定形內胚層譜系特征標記的細胞包括原條前體細胞、原條細胞、中內胚層細胞和定形 內胚層細胞。
[0081] 本文使用的"CD99"指的是登錄號NM_002414的基因編碼的蛋白質。
[0082] 本文使用的"表達胰腺內胚層譜系特征標記的細胞"指的是表達至少一種下列標 記的細胞:PDX-1、HNF-1 β、PTF-1 a、HNF-6或HB9。表達胰腺內胚層譜系特征標記的細胞 包括胰腺內胚層細胞。
[0083] 本文使用的"表達胰腺內分泌譜系特征標記的細胞"指的是表達至少一種下列標 記的細胞:NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6. 1、Pax-4、Ngn-3 或 PTF-la。表達胰腺內 分泌譜系特征標記的細胞包括胰腺內分泌細胞、胰腺激素表達細胞、和胰腺激素分泌細胞、 和β細胞譜系的細胞。
[0084] 本文使用的"CXCR4"指的是基質細胞衍生因子l(SDF-l)受體,又名"LESTR"或 "fusin"。在形成原腸胚過程中的小鼠胚胎中,CXCR4在定形內胚層和中胚層中而不是在胚 外內胚層中表達。
[0085] 本文使用的"定形內胚層"指的是在原腸胚形成期間具有從外胚層產生的細胞 特性的細胞,其形成胃腸道及其衍生物。定形內胚層細胞表達下列標記:CXCR4、HNF-3i3、 GATA-4、S0X-17、Cerberus、0TX2、goosecoid、c-Kit、CD99 和 Mixll。
[0086] 本文使用的"胚外內胚層"指的是表達至少一種下列標記的細胞群:S0X_7、AFP和 SPARC。
[0087] "GATA-4"和"GATA-6"是GATA轉錄因子家族的成員。該轉錄因子家族由TGF- β 信號傳導誘導并有助于早期內胚層標記的維持。
[0088] 本文使用的"GLUT-2"指的是在許多胎兒和成人組織(包括胰腺、肝、腸、腦和腎) 中表達的葡萄糖轉運分子。
[0089] 本文使用的"Goosecoid"或"GSC"指的是在胚孔的背唇中表達的同源結構域轉錄 因子。
[0090] 本文使用的"Islet-Ι"或"Isl-1"是LIM/同源結構域轉錄因子家族的成員,在發(fā) 育中的胰腺中表達。
[0091] 本文使用的"MafA"是在胰腺中表達的轉錄因子,控制在胰島素生物合成和分泌中 涉及的基因的表達。
[0092] 本文使用的"標記"是在感興趣的細胞中差異表達的核酸或多肽分子。在本上下 文中,對于陽性標記差異表達表示增加的水平而對于陰性標記其表示減少的水平。與其它 細胞相比,在感興趣的細胞中標記核酸或多肽的可檢測水平足夠高或低,以致可以使用本 領域已知的多種方法中的任意一種鑒定和將感興趣的細胞同其它細胞區(qū)別開來。
[0093] 本文使用的"中內胚層細胞"指的是表達至少一種下列標記的細胞:⑶48、 eomesodermin (E0MES)、S0X-17、DKK4、HNF-3 β、GSC、FGF17、GATA-6。
[0094] 本文使用的"Nodal"是TGF0蛋白超家族的成員。
[0095] "Oct-4"是P0U結構域轉錄因子的成員并被普遍認為是多能干細胞的標志。Oct-4 與多能干細胞的關系通過其緊密地限制性表達到未分化的多能干細胞表明。當分化為體細 胞譜系時,〇ct-4的表達迅速消失。
[0096] 本文使用的"胰腺內分泌細胞"或"胰腺激素表達細胞"指的是能夠表達至少一種 下列激素的細胞:胰島素、胰高血糖素、生長激素釋放抑制激素和胰多肽。
[0097] 本文使用的"胰腺激素分泌細胞"指的是能夠分泌至少一種下列激素的細胞:胰島 素、胰高血糖素、生長激素釋放抑制激素和胰多肽。
[0098] 本文使用的"Pax-4"和"Pax-6"是涉及胰島發(fā)育的胰腺β細胞特異性轉錄因子。
[0099] 本文使用的"rox-i"指的是涉及胰腺發(fā)育的同源結構域轉錄因子。
[0100] 本文使用的"前-原條細胞"指的是表達至少一種下列標記的細胞:Nodal或FGF8。
[0101] 本文使用的"原條細胞"指的是表達至少一種下列標記的細胞:Brachyury、Mix樣 同源框蛋白質或FGF4。
[0102] 本文使用的"PTF-la "指的是48kD的堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白,其是三聚體胰腺 轉錄因子1 (PTF1)的序列特異性DNA結合亞基。
[0103] 本文使用的"SPARC"又名"酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白"。
[0104] "SSEA_1"(時期專一的胚胎抗原1)是存在于鼠畸胎癌干細胞(EC)、鼠和人胚胎生 殖細胞(EG)和鼠胚胎干細胞(ES)表面上的糖脂表面抗原。
[0105] "SSEA_3"(時期專一的胚胎抗原3)是存在于人畸胎癌干細胞(EC)、人胚胎生殖細 胞(EG)和人胚胎干細胞(ES)表面上的糖脂表面抗原。
[0106] "SSEA_4"(時期專一的胚胎抗原4)是存在于人畸胎癌干細胞(EC)、人胚胎生殖細 胞(EG)和人胚胎干細胞(ES)表面上的糖脂表面抗原。
[0107] "TRA1-60"是在人畸胎癌干細胞(EC)、人胚胎生殖細胞(EG)和人胚胎干細胞(ES) 表面上表達的硫酸角質素相關抗原。
[0108] "TRA1-81"是在人畸胎癌干細胞(EC)、人胚胎生殖細胞(EG)和人胚胎干細胞(ES) 表面上表達的硫酸角質素相關抗原。
[0109] "TRA2-49"是在人畸胎癌干細胞(EC)和人胚胎干細胞(ES)表面上表達的堿性磷 酸酶同工酶。
[0110] 本發(fā)明提供了用于已經(jīng)用酶釋放為單細胞的多能干細胞的維持、傳代和分化的方 法。尤其是,本發(fā)明提供了用于已經(jīng)釋放為單細胞的多能干細胞的維持、傳代和分化,而沒 有隨后的多能性損失,并且沒有染色體異常增加的方法。
[0111] 在一個實施方案中,本發(fā)明提供了用于分化多能干細胞的方法,包括下列步驟:
[0112] a)成簇培養(yǎng)多能干細胞,
[0113] b)釋放該多能干細胞為單細胞,
[0114] c)平板接種該單個多能干細胞到組織培養(yǎng)基質上,和
[0115] d)分化該單個多能干細胞。
[0116] 可以通過酶處理釋放多能干細胞簇為單細胞。酶處理可以用TrypLE? Express, 可選擇地用TrypLE? Select,可選擇地用胰蛋白酶,或者可選擇地用胰蛋白酶/EDTA。
[0117] 酶處理可以是大約2至大約5分鐘??蛇x擇地,酶處理為大約5分鐘。
[0118] 可以使用從大約0. 5g/L到大約2. 5g/L濃度的酶。
[0119] 在一個實施方案中,可以用TrypLE? EXPRESS釋放多能干細胞簇為單細胞。
[0120] 在一個實施方案中,多能干細胞是胚胎干細胞。在一個替代的實施方案中,胚胎干 細胞是人的。
[0121] 在一個實施方案中,把釋放的單個多能細胞平板接種到組織培養(yǎng)基質上。基質可 以是MATRIGEL?,可選擇地基質可以是纖連蛋白,可選擇地基質可以是層粘連蛋白,可選擇 地基質可以是人血清,或者可選擇地基質可以是膠原。
[0122] 在一個實施方案中,把釋放的單個多能細胞平板接種到三維支持物上。支持物可 以與至少一種促進該釋放的單個多能細胞存活和行使功能的藥物試劑結合。對本發(fā)明來說 適合使用的支持物材料包括泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織品和無紡結構形式的合成和天 然材料。
[0123] 在一個實施方案中組織培養(yǎng)基質是MATRIGEL?。可以在從大約1 : 30到大約 1 : 10的稀釋度使用MATRIGEL?。在一個實施方案中,以1 : 10的稀釋度使用MATRIGEL?。
[0124] 單個多能干細胞可以分化成為表達定形內胚層譜系特征標記的細胞??蛇x擇地, 單個多能干細胞可以分化成為表達胰腺內胚層譜系特征標記的細胞??蛇x擇地,單個多能 干細胞可以分化成為表達胰腺內分泌譜系特征標記的細胞。
[0125] 在一個實施方案中,本發(fā)明提供了用于維持多能干細胞的方法,包括下列步驟:
[0126] a)獲得多能干細胞簇,
[0127] b)釋放該多能干細胞為單細胞,和
[0128] c)平板接種該單個多能干細胞到組織培養(yǎng)基質上。
[0129] 可以通過酶處理釋放多能干細胞簇為單細胞。酶處理可以用TrypLE? Express, 可選擇地用TrypLE? Select,可選擇地用胰蛋白酶,或者可選擇地用胰蛋白酶/EDTA。
[0130] 酶處理可以是大約2至大約5分鐘??蛇x擇地,酶處理為大約5分鐘。
[0131] 可以使用從大約0. 5g/L到2. 5g/L濃度的酶。
[0132] 在一個實施方案中,可以用TrypLE? Express釋放多能干細胞簇為單細胞。
[0133] 在一個實施方案中,多能干細胞是胚胎干細胞。在一個替代的實施方案中,胚胎干 細胞是人的。
[0134] 在一個實施方案中,把釋放的單個多能細胞平板接種到組織培養(yǎng)基質上?;|可 以是MATRIGEL?,可選擇地基質可以是生長因子減少的MATRIGEL?,可選擇地基質可以是纖 連蛋白,可選擇地基質可以是層粘連蛋白,可選擇地基質可以是人血清,或者可選擇地基質 可以是膠原。
[0135] 在一個實施方案中,把釋放的單個多能細胞平板接種到三維支持物上。支持物可 以與至少一種促進該釋放的單個多能細胞存活和行使功能的藥物試劑結合。對本發(fā)明來說 適合使用的支持物材料包括泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織品和無紡結構形式的合成和天 然材料。
[0136] 在一個實施方案中組織培養(yǎng)基質是生長因子減少的MATRIGEL???梢栽趶拇蠹s 1 : 30到大約1 : 10的稀釋度使用生長因子減少的MATRIGEL?。在一個實施方案中,以 1 : 30的稀釋度使用MATRIGEL?。
[0137] 單個多能干細胞可以分化成為表達定形內胚層譜系特征標記的細胞??蛇x擇地, 單個多能干細胞可以分化成為表達胰腺內胚層譜系特征標記的細胞。可選擇地,單個多能 干細胞可以分化成為表達胰腺內分泌譜系特征標記的細胞。
[0138] 在一個實施方案中,本發(fā)明提供了用于傳代多能干細胞的方法,包括下列步驟:
[0139] a)獲得多能干細胞簇,
[0140] b)釋放該多能干細胞為單細胞,
[0141] c)平板接種該單個多能干細胞到組織培養(yǎng)基質上,
[0142] d)允許該單個多能干細胞擴增,
[0143] e)釋放該單個多能干細胞,和
[0144] f)平板接種該單個多能干細胞到新的組織培養(yǎng)基質上。
[0145] 可以通過酶處理釋放多能干細胞簇為單細胞。酶處理可以用TrypLE? Express, 可選擇地用TrypLE? Select,可選擇地用胰蛋白酶,或者可選擇地用胰蛋白酶/EDTA。
[0146] 酶處理可以是大約2至大約5分鐘。可選擇地,酶處理為大約5分鐘??梢允褂?從大約0. 5g/L到2. 5g/L濃度的酶。
[0147] 在一個實施方案中,可以用TrypLE? Express釋放多能干細胞簇為單細胞。
[0148] 在一個實施方案中,在細胞再次經(jīng)受酶傳代到新的組織培養(yǎng)基質上以前單個多能 細胞生長到大約70至80%的密度。使用本發(fā)明的方法,單個多能干細胞可以傳代一次,或 者它們可以傳代多于一次。
[0149] 在一個實施方案中,多能干細胞是胚胎干細胞。在一個替代的實施方案中,胚胎干 細胞是人的。
[0150] 在一個實施方案中,把釋放的單個多能細胞平板接種到組織培養(yǎng)基質上?;|可 以是MATRIGEL?,可選擇地,基質可以是生長因子減少的MATRIGEL?,可選擇地基質可以是 纖連蛋白,可選擇地基質可以是層粘連蛋白,可選擇地基質可以是人血清或者可選擇地基 質可以是I父原。
[0151] 在一個實施方案中,把釋放的單個多能細胞平板接種到三維支持物上。支持物可 以與至少一種促進該釋放的單個多能細胞存活和行使功能的藥物試劑結合。對本發(fā)明來說 適合使用的支持物材料包括泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織品和無紡結構形式的合成和天 然材料。
[0152] 在一個實施方案中組織培養(yǎng)基質是生長因子減少的MATRIGEL???梢栽趶拇蠹s 1 : 30到大約1 : 10的稀釋度使用生長因子減少的MATRIGEL?。在一個實施方案中,以 1 : 30的稀釋度使用MATRIGEL?。
[0153] 用于多能干細胞的分離、擴增和培養(yǎng)的其它方法
[0154] 多能干細胞的鑒定
[0155] 多能干細胞可以表達時期專一的胚胎抗原(SSEA) 3和4,以及可使用命名 為Tra-1-60和Tra-1-81的抗體檢測的標記中的一種或更多種(Thomson et al., Science282 :1145,1998)。多能干細胞在體外的分化導致SSEA-4、Tra-l-60和Tra-1-81表 達(如果存在)的損失以及SSEA-1表達的增加。未分化的多能干細胞通常具有堿性磷酸 酶活性,其可以按照廠商(Vector Laboratories,Burlingame Calif)的描述通過用4%多 聚甲醛固定該細胞然后用Vector Red作為底物顯影來檢測。未分化的多能干細胞通常還 表達Oct-4和TERT,通過RT-PCR檢測。
[0156] 增殖的多能干細胞的另一個需要的表型是分化成為所有三種胚層:內胚層、中胚 層和外胚層組織的細胞的潛力。干細胞的多能性可以通過,例如注射細胞進重癥聯(lián)合免疫 缺陷(SCID)小鼠,使用4%多聚甲醛固定其形成的畸胎瘤,然后組織學上檢查它們來自三 種胚層的細胞類型的證據(jù)來確定??蛇x擇地,多能性可以通過胚狀體的產生和評價該胚狀 體與三種胚層相關的標記的存在來確定。
[0157] 增殖的多能干細胞系可以使用標準G顯帶技術確定核型并與公布的相應靈長類 物種核型相比。需要獲得具有"正常核型"的細胞,其表示細胞是整倍體的,其中所有人染 色體都存在并且沒有顯著地改變。
[0158] 多能干細胞的來源
[0159] 可以使用的多能干細胞類型包括來源于妊娠之后形成的組織,包括胚前期組織 (例如胚泡)、胚胎組織或妊娠期間任何時間(通常但不必然在大約10-12星期妊娠以前) 獲取的胎兒組織的已經(jīng)建立的多能細胞系。非限制性例子是已經(jīng)建立的人胚胎干細胞或人 胚胎生殖細胞系,例如人胚胎干細胞系H1、H7和H9(WiCell)。還預期了在上述細胞最初建 立或穩(wěn)定化期間本公開的組合物的用途,在該種情況下來源細胞可以是直接從來源組織獲 取的原始多能細胞。從已經(jīng)在沒有飼養(yǎng)物的情況下培養(yǎng)的多能干細胞群獲取的細胞也是合 適的。突變型人胚胎干細胞系,例如BG01v(BresaGen,Athens,GA)也是合適的。
[0160] 在一個實施方案中,按照Thomson等的描述制備人胚胎干細胞。(美國專利號 5, 843, 780 ;Science282 :1145,1998 ;Curr. Top. Dev. Biol. 38 :133ff. , 1998 ;Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :7844,1995)。
[0161] 多能干細胞的培養(yǎng)
[0162] 在一個實施方案中,多能干細胞通常在以多種方式支持該多能干細胞的飼養(yǎng)細胞 層上培養(yǎng)??蛇x擇地,多能干細胞在基本上不含飼養(yǎng)細胞,但是仍然支持多能干細胞不經(jīng)受 相當大的分化的增殖的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。使用以先前培養(yǎng)另一種細胞類型為條件的培養(yǎng)基 支持不分化的在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)物中多能干細胞的生長??蛇x擇地,使用化學成分確定的培 養(yǎng)基支持不分化的在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)物中多能干細胞的生長。
[0163] 例如,Reubinoff 等(Nature Biotechnologyl8 :399_4〇4(2〇00))和 Thompson 等 (Science6Novemberl998 :Vol. 282. no. 5391,ρρ· 1145-1147)公開了使用小鼠胚胎成纖維 細胞飼養(yǎng)細胞層從人胚泡的多能干細胞系的培養(yǎng)。
[0164] Richards 等(Stem Cells21 :546_556, 2003)評估了一組 11 種不同的人類成人、 胎兒和新生兒飼養(yǎng)細胞層支持人類多能干細胞培養(yǎng)的能力。Richards等陳述:"在成體皮 膚成纖維細胞飼養(yǎng)物上培養(yǎng)的人類胚胎干細胞系保留了人類胚胎干細胞形態(tài)并且仍然是 多能的"。
[0165] US20020072117公開了產生在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)中支持靈長類動物多能干細胞生長的 培養(yǎng)基的細胞系。使用的細胞系是從胚胎組織獲得的或從胚胎干細胞分化的間充質細胞和 成纖維細胞樣細胞系。US20020072117還公開了該細胞系作為初始飼養(yǎng)細胞層的用途。
[0166] 在另一個例子中,Wang等(Stem Cells23 :1221_1227,2005)公開了在來源于人類 胚胎干細胞的飼養(yǎng)細胞層上人類多能干細胞長期生長的方法。
[0167] 在另一個例子中,Stojkovic 等(Stem Cells2005 23 :306-314,2005)公開了來源 于人類胚胎干細胞自發(fā)分化的飼養(yǎng)細胞系統(tǒng)。
[0168] 在另一個例子中,Miyamoto 等(Stem Cells22 :433-440, 2004)公開了從人胎盤處 獲得的飼養(yǎng)細胞的來源。
[0169] Amit等(Biol. R印rod68 :2150-2156,2003)公開了來源于人包皮的飼養(yǎng)細胞層。
[0170] 在另一個例子中,Inzunza等(Stem Cells23 :544-549,2005)公開了來自人生后 包皮成纖維細胞的飼養(yǎng)細胞層。
[0171] US6642048公開了在無飼養(yǎng)物培養(yǎng)中支持靈長類動物多能干(pPS)細胞生長的培 養(yǎng)基,以及可用于生產這樣的培養(yǎng)基的細胞系。US6642048陳述:"本發(fā)明包括從胚胎組織 獲得的或從胚胎干細胞分化的間充質細胞和成纖維細胞樣細胞系。在本公開中描述和例示 了取得上述細胞系,加工培養(yǎng)基和使用該條件培養(yǎng)基生長干細胞的方法。"
[0172] 在另一個例子中,W02005014799公開了用于哺乳動物細胞維持、增殖和分化的條 件培養(yǎng)基。W02005014799陳述:"根據(jù)本發(fā)明產生的培養(yǎng)基以鼠科動物細胞,尤其是那些稱 為MMH(Met鼠科動物肝細胞)的已分化且永生化的轉基因肝細胞的細胞分泌活性為條件。"
[0173] 在另一個例子中,Xu等(Stem Cells22 :972_980,2004)公開了從已經(jīng)遺傳修飾以 過表達人端粒酶逆轉錄酶的人類胚胎干細胞衍生物獲得的條件培養(yǎng)基。
[0174] 在另一個例子中,US20070010011公開了維持多能干細胞的化學成分確定的培養(yǎng) 基。
[0175] -種可供選擇的培養(yǎng)系統(tǒng)使用補充有能夠促進胚胎干細胞增殖的生長因子的 無血清培養(yǎng)基。例如,Cheon 等(BioReprod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870, 0ctoberl9, 2005)公開了一種無飼養(yǎng)物、無血清的培養(yǎng)系統(tǒng),其中胚胎干細胞在補充有能夠 觸發(fā)胚胎干細胞自我更新的不同生長因子的非條件血清替換(SR)培養(yǎng)基中維持。
[0176] 在另一個例子中,Levenstein 等(Stem Cells24 :568_574,2006)公開了在沒有成 纖維細胞或條件培養(yǎng)基的情況下,使用補充有bFGF的培養(yǎng)基長期培養(yǎng)人類胚胎干細胞的 方法。
[0177] 在另一個例子中,US20050148070公開了在沒有血清和成纖維細胞飼養(yǎng)細胞的確 定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類胚胎干細胞的方法,該方法包括:在包含白蛋白、氨基酸、維生素、 礦物質、至少一種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代替物、至少一種胰島素或胰島素代替物的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)干細胞,該培養(yǎng)基基本上不含哺乳動物胎兒血清并且包含至少大約l〇〇ng/ml的能 夠活化成纖維細胞生長因子信號傳導受體的成纖維細胞生長因子,其中該生長因子從并非 僅僅是成纖維細胞飼養(yǎng)層的來源提供,在沒有飼養(yǎng)細胞或條件培養(yǎng)基的情況下該培養(yǎng)基支 持干細胞以未分化的狀態(tài)增殖。
[0178] 在另一個例子中,US20050233446公開了一種用于培養(yǎng)干細胞的確定成分培養(yǎng)基, 包括未分化的靈長類動物原始干細胞。在溶液中,該培養(yǎng)基與培養(yǎng)的干細胞相比基本上是 等滲的。在給定的培養(yǎng)中,特定的培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基以及支持該原始干細胞基本上未 分化的生長所必需的量的bFGF、胰島素和抗壞血酸。
[0179] 在另一個例子中,US6800480陳述,"在一種實施方案中,提供了一種用于以基本上 未分化的狀態(tài)生長靈長類動物來源的原始干細胞的細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基,其包括有效支持靈長 類動物來源的原始干細胞生長的低滲透壓、低內毒素的基礎培養(yǎng)基。該基礎培養(yǎng)基與有效 支持靈長類動物來源的原始干細胞生長的營養(yǎng)血清以及選自飼養(yǎng)細胞和來源于飼養(yǎng)細胞 的細胞外基質組分的基質組合。該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑、以及選自核苷和 丙酮酸鹽的第一生長因子。"
[0180] 在另一個例子中,US20050244962陳述:"在一個方面本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)靈長 類動物胚胎干細胞的方法。在基本上不含哺乳動物胎兒血清(優(yōu)選還基本上不含任何動物 血清)和有從并非僅僅是成纖維細胞飼養(yǎng)層的來源提供的成纖維細胞生長因子的培養(yǎng)物 中培養(yǎng)干細胞。在一種優(yōu)選的形式中,通過添加足夠的成纖維細胞生長因子使以前需要來 維持干細胞培養(yǎng)的成纖維細胞飼養(yǎng)層不必要。"
[0181] 在另一個例子中,W02005065354公開了一種基本上無飼養(yǎng)物和無血清的確定成分 的、等滲的培養(yǎng)基,包括:a)基礎培養(yǎng)基;b)足夠支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長 的量的bFGF ;c)足夠支持基本上未分化的哺乳動物千細胞生長的量的胰島素;和d)足夠 支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長的量的抗壞血酸。
[0182] 在另一個例子中,W02005086845公開了一種用于維持未分化的干細胞的方法,所 述方法包括使干細胞接觸足夠維持該細胞未分化狀態(tài)的量的轉化生長因子β (TGFi3)家 族蛋白質成員、成纖維細胞生長因子(FGF)家族蛋白質成員或煙酰胺(NIC)足夠的時間以 獲得需要的結果。
[0183] 可以把多能干細胞平板接種到合適的培養(yǎng)基質上。在一個實施方案中,合適的培 養(yǎng)基質是細胞外基質組分,例如來源于基底膜或可以形成粘著分子受體-配體對的一部分 的那些。在一個實施方案中,合適的培養(yǎng)基質是MATRIGEL?(Becton Dickenson) oMATRIGEL? 是來自Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤細胞的可溶制劑,其在室溫下是凝膠以形成重建的基 底膜。
[0184] 作為替換物其它細胞外基質組分和組分混合物是合適的。取決于增殖的細胞類 型,這可以包括單獨的或以不同組合的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、內功素、硫酸乙酰 肝素等等。
[0185] 可以以合適的分布和在有促進細胞存活、增殖和保留需要的特性的培養(yǎng)基的情況 下把多能干細胞平板接種到基質上。所有這些特性得益于小心注意接種分布并且本領域技 術人員能夠容易地確定。
[0186] 合適的培養(yǎng)基可以由下列組分組成,例如Dulbecco ' s改進的Eagle ' s培 養(yǎng)基(DMEM)、Gibco#l 1965-092 ;Knockout Dulbecco ' s 改進的 Eagle ' s 培養(yǎng)基(K0 DMEM)、Gibco#10829-018 ;Ham,s F12/50 % DMEM 基礎培養(yǎng)基;200mM L-谷氨酰胺、 Gibco#15039-027 ;非必需氨基酸溶液、Gibcolll40-050 ;β-巰基乙醇、Sigma#M7522 ;人類 重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、Gibco#13256-029。
[0187] 多能干細胞的分化
[0188] 在本發(fā)明的一個實施方案中,在培養(yǎng)中多能干細胞增殖,同時維持它們的多能性。 細胞隨時間的多能性改變能夠通過檢測與多能性相關的標記的表達水平的改變而確定。可 選擇地,多能性改變能夠通過檢測與分化相關的標記或與另一種細胞類型相關的標記的表 達水平的改變而監(jiān)測。
[0189] 在一個替代的實施方案中,多能干細胞在培養(yǎng)中增殖然后以促進它們分化成為另 一種細胞類型的方式處理。其它細胞類型可以是表達定形內胚層譜系特征標記的細胞。可 選擇地,該細胞類型可以是表達胰腺內胚層譜系特征標記的細胞??蛇x擇地,該細胞類型可 以是表達胰腺內分泌譜系特征標記的細胞??蛇x擇地,該細胞類型可以是表達β細胞譜系 特征標記的細胞。
[0190] 根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細胞可以通過本領域任何合適的方法分化成為 多種其它細胞類型。例如,根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細胞可以分化成為神經(jīng)細胞、心 臟細胞、肝細胞、等等。
[0191] 例如,根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細胞可以根據(jù)W02007030870中公開的方 法分化成為神經(jīng)祖細胞和心肌細胞。
[0192] 在另一個例子中,根據(jù)本發(fā)明的方法處理的多能干細胞可以根據(jù)美國專利 6, 458, 589中公開的方法分化成為肝細胞。
[0193] 表達定形內胚層譜系特征標記的細胞的形成
[0194] 多能干細胞可以通過本領域的任何方法分化成為表達定形內胚層譜系特征標記 的細胞。
[0195] 例如,多能干細胞可以根據(jù) D' Amour et al,Nature Biotechnology23, 1534-1541 (2005)中公開的方法分化成為表達定形內胚層譜系特征標記的細胞。
[0196] 例如,多能干細胞可以根據(jù) Shinozaki et al,Developmentl31,1651-1662 (2004) 中公開的方法分化成為表達定形內胚層譜系特征標記的細胞。
[0197] 例如,多能干細胞可以根據(jù)McLean et al,Stem Cells25, 29-38 (2007)中公開的 方法分化成為表達定形內胚層譜系特征標記的細胞。
[0198] 例如,多能干細胞可以根據(jù) D ' Amour et al,Nature Biotechnology24, 1392-1401 (2006)中公開的方法分化成為表達定形內胚層譜系特征標記的細胞。
[0199] 定形內胚層譜系特征標記選自 S0X17、GATA4、Ηη?·-3β、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、 Brachyury、Mix 樣同源框蛋白質、FGF4CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、 CXCR4、C-Kit、⑶99和0TX2。適合在本發(fā)明使用的是表達至少一種定形內胚層譜系特征標 記的細胞。在本發(fā)明的一個方面,表達定形內胚層譜系特征標記的細胞是原條前體細胞。在 一個替代的方面,表達定形內胚層譜系特征標記的細胞是中內胚層細胞。在一個替代的方 面,表達定形內胚層譜系特征標記的細胞是定形內胚層細胞。
[0200] 表達胰腺內胚層譜系特征標記的細胞的形成
[0201] 多能干細胞可以通過本領域的任何方法分化成為表達胰腺內胚層譜系特征標記 的細胞。
[0202] 例如,多能干細胞可以根據(jù) D ' Amour et al,Nature Biotechnology24, 1392-1401 (2006)中公開的方法分化成為表達胰腺內胚層譜系特征標記的細胞。
[0203] 胰腺內胚層譜系特征標記選自Pdxl、HNF-1 β、PTFla、HNF-6、HB9和PR0X1。適合 在本發(fā)明使用的是表達至少一種胰腺內胚層譜系特征標記的細胞。在本發(fā)明的一個方面, 表達胰腺內胚層譜系特征標記的細胞是胰腺內胚層細胞。
[0204] 表達胰腺內分泌譜系標記的細胞的形成
[0205] 多能干細胞可以通過本領域的任何方法分化成為表達胰腺內分泌譜系特征標記 的細胞。
[0206] 例如,多能干細胞可以根據(jù) D ' Amour et al,Nature Biotechnology24, 1392-1401 (2006)中公開的方法分化成為表達胰腺內分泌譜系特征標記的細胞。
[0207] 例如,多能干細胞可以通過Nature Biotechnology24,1392-1401 (2006)中公開的 方法分化成為表達胰腺內分泌譜系特征標記的細胞。
[0208] 例如,多能干細胞可以通過 D' Amour et al,Nature Biotechnology,2006 中公 開的方法分化成為表達胰腺內分泌譜系特征標記的細胞。
[0209] 胰腺內分泌譜系特征標記選自 NGN-3、NeuroD、Islet-1、Pdx-1、NKX6. 1、Pax-4、 Ngn-3和PTF-1 α。在一個實施方案中,胰腺內分泌細胞能夠表達至少一種下列激素:胰島 素、胰高血糖素、生長激素釋放抑制激素和胰多肽。適合在本發(fā)明使用的是表達至少一種胰 腺內分泌譜系特征標記的細胞。在本發(fā)明的一個方面,表達胰腺內分泌譜系特征標記的細 胞是胰腺內分泌細胞。該胰腺內分泌細胞可以是胰腺激素表達細胞??蛇x擇地,該胰腺內 分泌細胞可以是胰腺激素分泌細胞。
[0210] 在本發(fā)明的一個方面,該胰腺內分泌細胞是表達β細胞譜系特征標記的細胞。 表達β細胞譜系特征標記的細胞表達Pdxl和至少一種下列轉錄因子:NGN-3、Nkx2. 2、 他叉6.1、他111'〇〇、181-1、!1即-3 0、麻?4、?314和?316。在本發(fā)明的一個方面,表達0細胞 譜系特征標記的細胞是β細胞。
[0211] 三維支持物
[0212] 對本發(fā)明來說適合使用的支持材料包括泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織品和無 紡結構形式的合成和天然材料,其已經(jīng)用于體外和體內重建或再生生物組織,以及遞送 趨化性試劑以誘導組織生長,適于在本發(fā)明的方法的實踐中使用。參見,例如,在美國專 利5, 770, 417、美國專利6, 022, 743、美國專利5, 567, 612、美國專利5, 759, 830、美國專 利6, 626, 950、美國專利6, 534, 084、美國專利6, 306, 424、美國專利6, 365, 149、美國專利 6, 599, 323、美國專利6, 656, 488、美國公布申請2004/0062753Α1、美國專利4, 557, 264和美 國專利6, 333, 029中公開的材料。
[0213] 為了形成與藥物試劑結合的支持物,可以在形成支持物之前把藥物試劑與聚合物 溶液混合??蛇x擇地,可以把藥物試劑包被到制造的支持物上,優(yōu)選在有藥物載體的情況 下。藥物試劑可以以液體、細碎的固體或任何其它適當?shù)奈锢硇问酱嬖???蛇x擇地,可以把 賦形劑加入該支持物以改變藥物試劑的釋放速度。在一個替代的實施方案中,支持物與至 少一種抗炎的藥物化合物結合,例如在美國專利6, 509, 369中公開的化合物。
[0214] 支持物可以與至少一種抗凋亡的藥物化合物結合,例如在美國專利6, 793, 945中 公開的化合物。
[0215] 支持物也可以與至少一種纖維化抑制劑藥物化合物結合,例如在美國專利 6, 331,298中公開的化合物。
[0216] 支持物還可以與至少一種能夠增強血管發(fā)生的藥物化合物結合,例如在美國公布 申請2004/0220393和美國公布申請2004/0209901中公開的化合物。
[0217] 支持物也可以與至少一種免疫抑制藥物化合物結合,例如在美國公布申請 2004/0171623中公開的化合物。
[0218] 本發(fā)明通過下列實施例進一步說明,但不受其限制。 實施例
[0219] 實施例1
[0220] 以細胞簇傳代和維持hESC
[0221] 在絲裂霉素 C滅活的原始小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上維持人類胚胎干細胞系HI 和H9。在重復傳代過程中把hES細胞從MEF飼養(yǎng)物轉換到MATRIGEL?。
[0222] 組織培養(yǎng)皿的MATRIGEL?包被:在4 °C解凍生長因子減少的 MATRIGEL?(Becton_Dickinson,Bedford,Mass.)然后在冷的 DMEM/F12(Invitrogen, Carlsbad, CA)中1 : 30稀釋。把足夠覆蓋的體積加入每個6cm皿(2ml)或六孔板的每個 孔(1ml),并且在室溫孵育lhr。平板在幾小時之內使用或者在4°C存儲最多2星期。
[0223] 人類胚胎干細胞培養(yǎng):通過在含lmg/ml膠原酶IV(Sigma_Aldrich,St. Louis,M0) 的DMEM/F12中孵育10分鐘,隨后用吸量管刮擦從飼養(yǎng)層收獲未分化的人類胚胎干細胞集 落(H9和H1)。在lOOOrpm離心4分鐘沉淀細胞團并且用2ml吸量管溫和地分散沉淀以破 裂集落為細胞小簇。在補充有 bFGF(8ng/ml;R&D Systems,Minneapolis,MN)的 MEF-CM 中 把這些細胞簇接種到MATRIGEL?包被的皿上,在5ml生長培養(yǎng)基中每6cm皿50-150集落。 每日更換培養(yǎng)基。在MEF-CM中的MATRIGEL TM上的集落變大并且當它們占有 70-80%表面 區(qū)域時傳代,大約每3-4天。集落中的hES細胞具有高的核質比例并具有顯著的核仁,與飼 養(yǎng)物上維持的hES細胞相似(圖1)。已分化的細胞相當于培養(yǎng)中總細胞的少于5%。
[0224] 對于在MATRIGEL?上的MEF-CM中的細胞的常規(guī)傳代,細胞在含lmg/ml膠原酶IV 的DMEM/F12中孵育直至60分鐘并且通過強烈的DMEM/F12流刮擦從皿移走。沉淀、分散細 胞,并以1 : 3或1 : 4的比例接種。
[0225] 實施例2
[0226] 人類胚胎干細胞以單細胞傳代:酶評估
[0227] 為了容易處理hES細胞,傳代技術可以使用需要較短孵育時間并且不包括刮擦步 驟的其它酶溶液。另外,用膠原酶以細胞簇傳代細胞不允許接種的細胞的數(shù)值定量。許多 酶溶液可以用來在一個快速的步驟中釋放單細胞。通過下列實驗鑒定引起最少細胞損壞并 且不阻礙細胞附著或細胞生長的快速作用的酶。
[0228] 在六孔皿中以簇生長的人類胚胎干細胞H9p33細胞用下列酶孵育;TrypLE? Express、TrypLETMSelect、胰蛋白酶/EDTA(0·05%)或胰蛋白酶(0·25%),于36°C2分鐘。 除胰蛋白酶之外的所有酶在2分鐘之內釋放細胞。于36°C在5分鐘之后完成用胰蛋白酶 的釋放。以200, 000細胞/孔再接種細胞進MATRIGEL?包被的六孔平板并允許擴增三天。 人類胚胎干細胞還用膠原酶以簇傳代(30分鐘孵育)并在MATRIGEL?包被的孔上以1 : 5 稀釋度再接種,與計數(shù)的TrypLE? Express細胞相似。三天之后,通過TrypLE? Express5 分鐘孵育釋放hESC。用0.01%臺盼藍孵育細胞然后計數(shù)(表I)。對于測試的所有酶緊接 著釋放之后的細胞成活力大于98%。使用膠原酶的人類胚胎干細胞傳代是標準傳代方法。 三天培養(yǎng)之后,TrypLE? Select和TrypLE? Express兩者產生的回收細胞計數(shù)與膠原酶相 似。胰蛋白酶/EDTA和胰蛋白酶在維持細胞附著/生長上效果顯著較差。TrypLE? Select 和TrypLE? Express是評估的最好的酶并且在時程實驗,實施例3中進一步測試。
[0229] 實施例3
[0230] 人類胚胎干細胞以單細胞傳代:酶暴露時間的優(yōu)化
[0231] TrypLE? Select和TrypLE? Express證明是測試的所有酶中最佳的。為了確定 這些酶與hES細胞的理想孵育時間,TrypLE? Select和TrypLE? Express與H9p34hESC簇 在37°C孵育2分鐘或10分鐘。細胞從孔移走、計數(shù)并通過離心沉淀。把200, 000細胞/孔 的等分試樣接種進六孔平板。細胞生長三天隨后用TrypLE? Express釋放并在有0.01 % 臺盼藍的情況下計數(shù)。
[0232] 對于兩種酶的兩種孵育時間細胞成活力均大于98%。表III表明接種36hrs之后 回收的細胞數(shù)目/孔。用TrypLE? Express傳代的細胞在三天之后達到初始的接種密度。 這表明接種之后大多數(shù)細胞不重新附著;然而,附著的細胞能夠增殖和擴增。假如一旦附 著,細胞以相同的速率擴增,這些數(shù)據(jù)證明用TrypLE? Express處理2分鐘產生最好的附著 率。然后在所有隨后的實驗中把2分鐘的TrypLE? Express處理用于產生單細胞。
[0233] 實施例4
[0234] 人類胚胎干細胞單細胞和細胞簇分化為定形內胚層
[0235] 胚胎干細胞可以分化為多種細胞譜系。以單細胞傳代的人類ES細胞對幫助細胞 輸入定量和容易處理提供了顯著的改進。確定了這些單個hES細胞分化的能力。
[0236] 細胞簇和單細胞的接種:在減少的生長因子MATRIGEL?上的H9或H1細胞簇6cm 平板與2ml含膠原酶(lmg/ml)的DMEM : F12在37°C孵育直至60分鐘。通過吸取和刮擦 移去細胞并以900rpm離心4分鐘。然后把細胞簇接種進1 : 15或1 : 30減少的生長因 子MATRIGEL?包被的六孔板。該傳代方法產生接種細胞簇(cc)??蛇x擇地,在減少的生長 因子MATRIGEL?上的H9或H1細胞簇的6cm平板與TrypLE? Express (2ml)在37°C孵育5 分鐘并通過吸取分散。在以900rpm離心4分鐘之后,把細胞接種進1 : 10減少的生長因 子MATRIGEL?包被的六孔板并稱為單細胞(sc)。
[0237] 定形內胚層分化:把大約60至70%融合的H9和Hlsc和cc培養(yǎng)物暴露于補充 有 0· 5% FBS、10ng/ml Wnt3a(R&D Systems)和 100ng/ml 活化素 A(AA ;R&D Systems)的 DMEM : F12培養(yǎng)基2天,隨后用補充有2% FBS和lOOng/ml活化素 A的DMEM/F12培養(yǎng)基 處理另外的三天。
[0238] 通過FACS分析培養(yǎng)物的CXCR4、⑶99和⑶9表達以及通過實時PCR分析S0X-17、 S0X-7、甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、goosecoid(GSC)、HNF-3P 和 GATA4。AFP 和S0X-7被認為是內臟內胚層標記,而GATA4、HNF-3 β和S0X-17代表定形內胚層標記,以 及GSC、Bry和CXCR4代表原條的標記。按照觀察到的產生的CXCR4陽性細胞百分數(shù),單細 胞以與細胞簇相似的程度分化至DE (圖2)。
[0239] 實施例5
[0240] hES單細胞和細胞簇分化為胰腺內胚層
[0241] 還測試了在改進的 Novocell (Baetge,EE et al.,Nature Biotechnology (2006), 24 (11),1392-1401.)公布的流程之后的進一步分化以確定hES單細胞的分化能力。在實施 例4中描述的DE流程之后細胞進一步分化為胰腺內胚層。
[0242] 胰腺內胚層分化:使用來自實施例4的細胞簇和單細胞兩者,一個H9(p37)DE實 驗進一步分化為胰腺內胚層。在定形內胚層流程完成之后,細胞與含F(xiàn)GF10(50ng/ml ;R&D Systems)、sonic hedgehog 抑制劑、KAAD 環(huán)王巴明(cyclopamine) (2.5uM;Sigma-Aldrich) 和2%FBS的DMEM : F12培養(yǎng)基孵育3天。接著,細胞與含F(xiàn)GF10(50ng/ml)、KAAD環(huán)王巴明 (2. 5uM)、視黃酸(luM ;Sigma-Aldrich)和 1% B27(Invitrogen)的 DMEM-低葡萄糖孵育另 外的三天。接著,細胞與含Exendin4 (50ng/ml ;Sigma_Aldrich)、DAPT (luM ;Calbiochem)和 1% B27的DMEM-低葡萄糖孵育另外的三天。對于每種細胞類型,從六孔板的一個孔獲取RNA 樣品然后通過實時PCR在該步驟分析胰腺標記Pdxl、Nkx6. l、Nkx2. 2、Pax4、NeuroD、HNF3b、 Ptfla、膜島素和 AFP。使用包含 50ng/ml,HGF、IGF(R&D Systems),和 Exendin4 (50ng/ml), 和1% B27的CMRL培養(yǎng)基(Invitrogen)繼續(xù)分化三天。在該時期重復相同胰腺內胚層標 記的評估。來自相同系的未經(jīng)處理的hES細胞的RNA樣品與處理的樣品平行經(jīng)受實時PCR。 把處理的樣品針對未經(jīng)處理的對照組標準化為1的倍數(shù)改變。監(jiān)測并在單細胞和細胞簇之 間比較Pdxl表達。在單細胞和細胞簇之間胰腺內胚層標記表達的誘導是相當?shù)模▓D3)。 因此,hES單細胞具有與hES細胞簇相似的固有的分化能力。
[0243] 實施例6
[0244] hES細胞以單細胞傳代
[0245] hES細胞以單細胞傳代可以幫助擴大培養(yǎng)的能力和易于制造過程。
[0246] 單細胞產生和傳代的描述:H9細胞如上所述在MATRIGEL?上以簇生長。在第38 代,6cm平板的H9細胞在37°C與2ml TrypLE? Express孵育5分鐘。在DMEM : F12中重 懸浮細胞并以900rpm離心4分鐘。以1 : 4比例再接種細胞到1 : 30生長因子減少的 MATRIGEL?包被的平板上。大約5次傳代之后,在再接種之前計數(shù)細胞并以14, 000細胞/ cm2的密度平板接種。以每4天的間隔繼續(xù)傳代和按該密度再接種。因為由單細胞產生,細 胞保持致密結構但是從未形成緊密的簇(比較圖1和圖4)。
[0247] 實施例7
[0248] hES單細胞多能性的分析
[0249] 對于任何傳代技術hES細胞多能性的維持是必須的。因此,在使用TrypLE? Express多次傳代之后評估了單細胞的多能性。
[0250] FACS多能性分析:H9單細胞以簇培養(yǎng)38次傳代隨后以單細胞16次傳代,包括一 個深低溫保藏凍融。然后通過FACS分析細胞多能性標記的表達。利用與TrypLE? Express 溶液孵育5分鐘從培養(yǎng)平板移走粘附細胞。釋放的細胞在DMEM : F12培養(yǎng)基中重懸浮并 通過離心回收,隨后在由PBS中的2% BSA(Sigma-Aldrich,St. Louis,M0)、0· 05%疊氮化 鈉組成的染色緩沖液中洗滌和重懸浮。視情況,使用〇. 1% T-球蛋白(Sigma)溶液對細 胞進行Fc受體封閉15分鐘。等分試樣(大約105細胞)如表III中指出的與藻紅蛋白 (phycoerythirin,PE)或別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)綴合的單克隆抗體(每10 6 細胞5μ 1抗體)或者與非綴合的原始抗體一起孵育。對照包括適當同種型匹配的抗體、未 染色的細胞和僅僅用二級綴合抗體染色的細胞。所有與抗體的孵育在4°C進行30分鐘,之 后用染色緩沖液洗滌細胞。用非綴合原始抗體染色的樣品與二級綴合PE或APC標記的抗 體在4°C孵育另外的30分鐘。使用的二級抗體的列表參見表III。沉淀洗滌的細胞并在染 色緩沖液中重懸浮,然后使用FACS陣列(BD Biosciences)儀鑒定細胞表面分子,收集至少 10, 000個事件。hESC膠原酶傳代的Hlp40和H9scpl6具有相當?shù)亩嗄苄缘鞍踪|表達型(圖 5)。
[0251] 實施例8
[0252] 人類胚胎干細胞單細胞核型穩(wěn)定性分析
[0253] 經(jīng)過多次傳代hES單細胞的核型應該仍然是穩(wěn)定的。H9單細胞以簇培養(yǎng)38次傳 代隨后以單細胞多次傳代。通過標準G顯帶核型分析(Cell Line Genetics,Madison,WI) 確定H9細胞的核型。評估了總共20個G顯帶的細胞并且通過FISH(熒光原位雜交)分析 了 200個間期核。在這些分析的細胞中沒有發(fā)現(xiàn)染色體畸變。細胞遺傳學分析顯示這些細 胞具有正常數(shù)目的常染色體和最常見的46的染色體數(shù)目。在第13代和第20代實施H9單 細胞的核型分析。第20代的細胞經(jīng)受了一次深低溫保藏凍融事件。第13和20代的細胞 是核型正常的(圖6)。
[0254] 實施例9
[0255] hES單細胞和hES細胞簇分化為定形內胚層
[0256] 對于最后的效用,以單細胞傳代的hES細胞必須保持它們的分化潛力。單細胞經(jīng) 受如下定形內胚層流程。用TrypLE? Express多次傳代之后的H9細胞(sc-p)用TrypLE? Express從傳代的單細胞(第6和21代)釋放(sc)到MATRIGEL?(1 : 10稀釋)上以分 化。把大約60至70%融合的H9sc單細胞層暴露于補充有0. 5%FBS、10ng/ml Wnt3a和 100ng/ml活化素 A的DMEM : F12培養(yǎng)基2天,隨后用補充有2% FBS和100ng/ml活化素 A的DMEM/F12培養(yǎng)基處理另外的三天。
[0257] 在第5天,通過FACS分析細胞的CXCR4、⑶99和⑶9表達以及通過實時PCR分 析 SOX-17、S0X-7、甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury (Bry)、gooscecoid (GSC)、HNF-3 β 和 GATA4。AFP和S0X-7被認為是內臟內胚層標記,而GATA4、HNF-3 0和S0X-17代表定形內 胚層標記,并且GSC、Bry和CXCR4代表原條的標記。多次傳代的單細胞(第6和21代)保 持它們分化為DE的能力,與細胞簇(第36-55代)相似(圖7)。
[0258] 實施例10
[0259] hES單細胞分化為胰腺內胚層
[0260] 依附下列步驟細胞進一步分化為胰腺內胚層;與含F(xiàn)GF10 (50ng/ml)、sonic hedgehog抑制劑、KAAD環(huán)王巴明(2. 5uM)和2%FBS的DMEM : F12培養(yǎng)基孵育三天,隨后 與含F(xiàn)GF10(50ng/ml)、KAAD環(huán)王巴明(2. 5uM)、視黃酸(luM)和1% B27的DMEM-低葡萄糖 孵育三天。在第11天進行細胞的評估。一些培養(yǎng)物在含Exendin4(50ng/ml)、DAPT(luM) 和1 % B27的DMEM-低葡萄糖中繼續(xù)處理三天。在第14天,通過實時PCR分析樣品的胰腺 標記Pdxl、Nkx6. l、Nkx2. 2、?&14、恥111'〇0、!1即313、?丨打3、胰島素和4--。一些培養(yǎng)物使用包 含50ng/ml,HGF、IGF、和Exendin4、和1% B27的CMRL培養(yǎng)基繼續(xù)分化另外的三天。在在 第17天末重復相同胰腺內胚層標記的評估。胰腺內胚層標記Nkx2. 2、NeuroD、HNF6、HNF3b 主要在第14和17天末表達。Pdxl表達在每一處理時期逐漸增加(圖8)。
[0261] 實施例11
[0262] 在MEF飼養(yǎng)物上分化hES單細胞
[0263] 為了達到hES細胞最佳分化為胰腺內胚層,定形內胚層群必須是最大的。當前,在 MEF飼養(yǎng)物上生長hES產生最高可達到水平的定形內胚層和胰腺內胚層。為了確定hES單細 胞是否能夠達到這個目標,把Hlscp4以14, 000細胞/cm2接種到MEF飼養(yǎng)物上。細胞在包 含含 20% Knock-out Serum Replacement (Invitrogen)、lX 非必需氨基酸(invitrogen)、 8ng/ml bFGF、ImM L-谷氨酰胺和lmM2-巰基乙醇溶液的DMEM-F12的ES細胞培養(yǎng)基中生 長。7天后細胞達到60-70%融合,把定形內胚層流程應用于該細胞。特別地,每孔100ul添 加含100ng/ml活化素 A、10ng/ml Wnt3a和0.5%FBS的DMEM : F12培養(yǎng)基2天,隨后用含 100ng/ml活化素 A和2% FBS的DMEM : F12培養(yǎng)基處理3天。然后用TrypLE? Express 移去細胞并且通過FACS分析細胞的CXCR4、⑶99和⑶9表達(圖9)。多于90%的細胞表 達CXCR4和⑶99。少于8%的細胞表達⑶9,像期望的那樣。如通過CXCR4陽性細胞數(shù)目確 定的,在MEF飼養(yǎng)物上接種單個H1細胞改進了定形內胚層分化。
[0264] 實施例12
[0265] 在96孔板中分化hES單細胞
[0266] 以簇傳代hES細胞的一個常見困難是它們難以定量并且不以勻速生長。單細胞具 有可以生長為融合的單細胞層并且可以在傳代之前計數(shù)以為了實驗目的確保相等接種的 優(yōu)點。這些屬性是成功的篩選確認的先決條件。
[0267] 把hES H9scpl8以14,000細胞/cm2的密度接種進用1 : 30生長因子減少的 MATRIGEL?包被的Packard View96孔板(Perkin-Elmer)。細胞在MEF條件培養(yǎng)基中生 長3到4天然后使用DE分化流程處理。40孔的亞組用標準流程(含10ng/ml Wnt3a、 100ng/ml活化素 A和(λ 5% FBS的DMEM : F12, 2天)處理。40孔的第二亞組用GSK3b抑 制劑 IX(100nM;EMD Chemicals,La Jolla,CA)代替 Wnt3a 處理。這繼之以用含 lOOng/ ml活化素 A和2%FBS的DMEM : F12處理兩個亞組3天。在培養(yǎng)的最后,用4%多聚甲 醛在室溫下固定細胞20分鐘,用PBS洗滌3次,然后在100ul PBS中存儲過夜。用0. 5% Triton X-lOO(Sigma-Aldrich)在室溫下透化處理細胞20分鐘或者在4°C處理5分鐘,然 后用PBS洗漆3次并用含4%雞血清(Invitrogen-Gibco,Carlesbad,CA)的PBS室溫下 封閉30分鐘。稀釋一級抗體(山羊抗hSoxl7(R&D Systems)并以1 : 100稀釋度添加到 4%雞血清中,室溫下lhr。在PBS中1 : 200稀釋二級抗體,Alexa Fluor488雞抗山羊 IgG (Invitrogen-Molecular Probes, Carlesbad,CA)并在用 PBS洗漆 3 次之后加入到細胞。 為 了復染細胞核,把 5μ M Draq5 (Alexis Platform,LSufelfirigen, Switzerland)加入細 胞,室溫下5分鐘。用PBS洗滌細胞一次并保留在100 μ 1/孔PBS中用于成像以確定已分 化的DE細胞數(shù)目。在IN CelllOOO分析器(GE Healthcare ;Piscataway,NJ)上讀取平板 的孔到孔細胞數(shù)目定量和Soxl7染色。用Wnt3a處理產生每孔最高數(shù)量的細胞核,在孔之 間很少變異(圖10)。用Gsk3 0抑制劑處理顯示弱的細胞成活力。明顯地,Wnt3a處理允 許單個ES細胞在96孔規(guī)格以穩(wěn)固的和可再生的方式形成DE。
[0268] 實施例13
[0269] 使用hES單細胞的篩選試驗
[0270] 在證明單細胞適于96孔規(guī)格的接種和分化之后,確定了用新化合物處理的靈敏 度。hES H9scpl9以14, 000細胞/cm2的密度接種進用1 : 30生長因子減少的MATRIGEL? 包被的96孔板中。細胞在MEF條件培養(yǎng)基中生長3-4天然后在DE分化實驗中處理。以1 或3 μ Μ的濃度一式三份地測試了總共13種新化合物,在DE分化流程中代替Wnt3a的小分 子抑制劑。把包含Wnt3a(10ng/ml)或Gsk3b抑制劑IX(100nM)的孔用作陽性對照。所有 分化孔用含單一化合物加上l〇〇ng/ml活化素 A和0. 5% FBS的DMEM : F12處理2天隨后 在沒有化合物的情況下用含l〇〇ng/ml活化素 A和2%FBS的DMEM : F12處理2天。在該 流程的最后,如上面實施例11中描述的固定、透化處理、封閉和染色細胞以確定Soxl7表達 和細胞核。然后在IN CelllOOO分析器上讀取平板。該篩選表明在DE分化流程中H9scp21 對13種化合物中的3種以類似于Wnt3a的方式作出反應(圖11)。化合物A在1 μ Μ較低 的劑量有效而化合物Β和C在1和3μΜ兩者都有效。在有效處理范圍(大于60% Soxl7 陽性細胞)中,孔之間的標準差都是小的。因此,單細胞通過篩選技術鑒定新化合物的能力 是穩(wěn)定的。
[0271] 實施例14
[0272] 單個hES細胞在滾瓶中的擴增
[0273] 為了易于規(guī)模擴大用于制造目的,hES細胞需要容易地擴增為大的數(shù)量。當前,膠 原酶處理以傳代hES細胞不適于在滾瓶或振蕩器燒瓶中的擴大。重復地以單細胞擴增和生 長的HES細胞具有均勻地粘附到不同表面的能力。在該實施例中,測試了滾瓶作為潛在的 擴大容器。H9scpl9以14, 000細胞/cm2接種進1 : 30減少的生長因子MATRIGEL?包被的 480cm2滾瓶(6. 7 X 106細胞;Corning, Acton, ΜΑ)。用每瓶100ml體積的MEF條件培養(yǎng)基 來維持細胞,每2天更換。對于24hrs瓶設置為20rev/hr而對于剩余時間增至60rev/hr。 經(jīng)過4天評價期細胞均勻地粘附到滾瓶并且顯著地擴增。使用TrypLE? Express移去細胞 并計數(shù)?;厥沼嫈?shù)表明獲得了每瓶13X106細胞,表明與原始接種相比發(fā)生了最少的細胞 加倍。我們估計少于一半的最初接種的細胞附著到滾瓶,暗示在滾瓶中發(fā)生了更大的實際 細胞擴增。這證明以單細胞傳代的hES細胞可以在自動化滾瓶系統(tǒng)中擴增。將實施進一步 的實驗以確定隨同多能性的維持一起的擴增率。
[0274] 實施例15
[0275] 單個hES細胞的轉染
[0276] 把DNA引入細胞以產生轉基因細胞類型是有用的特征。DNA可以包含表達載體或 報告基因以易于區(qū)別或允許細胞的選擇。已經(jīng)證明hES細胞難以在簇中轉染。然而,hES單 細胞可以更加適于轉染技術。
[0277] 用TrypLE? Express傳代H9p33細胞并以20, 000細胞/cm2接種到1 : 30減少的 生長因子MATRIGEL?包被的平板上。用膠原酶傳代H9p33細胞并從一個6cm平板接種進用 1 : 30減少的生長因子MATRIGEL?包被的六孔板的一個孔。3天之后,用CMV-GFP轉染細胞, 其中6--在01^病毒啟動子下在所有細胞中表達。特別地,在25(^10?^-11^1培養(yǎng)基中稀 釋 2 或 4 μ g DNA 并且在 250 μ 1 Opti-MEM 中加入 8ul Lipofectamine2000 (Invitrogen)。 室溫下5分鐘之后合并混合物。在加入2ml MEF條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞之前合并的試劑 在室溫下孵育20分鐘。其后每24小時用MEF條件培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。3天之后,用4%多 聚甲醛在室溫下固定細胞20分鐘然后用PBS洗滌兩次并在PBS中4°C保存過夜。為了復染 細胞核,把5μ M Draq5 (Alexis Platform)加入細胞,室溫下5分鐘。用PBS洗滌細胞一次 并保存在lml/孔PBS中用于在IN Cell 1000分析器上成像以確定轉染效率(圖12)。HES 單細胞在轉染效率上顯示出為hES簇兩倍的改進。因此,hES單細胞具有改進的轉染能力 并且更容易遺傳修飾。隨著最佳化,也許使用其它轉染方法或試劑,可能實現(xiàn)單細胞ES細 胞轉染更加引人注目的改進。
[0278] 實施例16
[0279] 在飼養(yǎng)細胞層上培養(yǎng)的hES細胞簇轉變?yōu)樵诩毎饣|上培養(yǎng)的單個hES細胞需 要除去飼養(yǎng)細胞
[0280] 使用酶,例如胰蛋白酶、重組胰蛋白酶(TrypLE?)或Accutase?(無脊椎動物來源 的胰蛋白酶樣酶)的哺乳動物細胞傳代是當前在研究和生產裝置中原代和永生化細胞系 兩者細胞培養(yǎng)的標準。這些酶產生同質的單細胞懸浮液,其可以以適于在高通量規(guī)格384 孔板或多升規(guī)模可變的(scaleable)培養(yǎng)容器的多種裝置中平板接種的可重復的方式計 數(shù)、分析、操作和傳代。
[0281] 考慮到單細胞傳代的明顯優(yōu)點,對開發(fā)以單細胞傳代人類胚胎干細胞的方法有相 當大的興趣。然而,當前最好的使用人類胚胎干細胞的實際操作要求細胞通過手動破裂或 使用維持胚胎細胞簇的酶(膠原酶或中性蛋白酶)傳代來以簇傳代。在這個領域過去的研 究已經(jīng)產生了可以在飼養(yǎng)物(Cellartis SCEDTM461系)上以單細胞傳代的細胞的產生,或 使用Accutase?從膠原酶傳代的簇到MATRIGEL?上的單細胞的單細胞的產生(R. Bajpai et al.,2008)。
[0282] 在此是開發(fā)單細胞傳代方法以使用TrypLE?或Accutase?在成批傳代方法中把 hES細胞直接從飼養(yǎng)物帶到matrigel的嘗試。結果表明使用TrypLE?或Accutase?成批 傳代把基于簇形式飼養(yǎng)物的傳代的hES細胞直接帶到MATRIGEL?而沒有MATRIGEL?上基于 簇的膠原酶傳代的中間步驟是無效的,這歸因于已分化細胞群的出現(xiàn),因此較少可能產生 同質的和穩(wěn)固的hES細胞培養(yǎng)物。
[0283] 結果
[0284] 努力把hES細胞從基于飼養(yǎng)物的培養(yǎng)轉移到無飼養(yǎng)物的培養(yǎng),我們傳代了已經(jīng)在 hESC培養(yǎng)基中由MEF飼養(yǎng)層支持并在六孔板的10cm2孔上生長了 5天的H1第37代hES細 胞。細胞使用TrypLE?、Accutase?或lmg/ml的膠原酶傳代。
[0285] 在添加酶到細胞之前,我們吸出了耗費的培養(yǎng)基,添加1ml PBS (無 Ca2+,或Mg2+) 到每個孔,吸出,然后添加 lml室溫的酶(膠原酶、Accutase?或TrypLE?)。Accutase?或 TrypLE?達到室溫之后以存儲濃度使用。膠原酶從-80°C冰箱移出,解凍,與9ml DMEM/F12 混合,無菌過濾,并在使用之前達到室溫。
[0286] 37°C下在酶中孵育細胞lOmin。10分鐘的處理之后Accutase?或TrypLE?使所有 細胞完全從皿中升起(lift)。10分鐘的孵育之后膠原酶沒有升起細胞,因此在10分鐘的 孵育之后使用l〇ml玻璃吸量管刮擦細胞。把含2% Probumin的lml DMEM-F12加入每個孔 并將孔中合并的總體積轉入50ml無菌錐形管,確保升起和懸浮盡可能多的細胞。
[0287] 以200Xg離心細胞5分鐘隨后另外用2% Probumin洗滌和以200Xg離心5分 鐘。然后在MEF條件培養(yǎng)基中重懸浮細胞并以1比3. 5的比例平板接種到MATRIGEL?(在 DMEM中1 : 30稀釋)包被的T25燒瓶上,然后置于37°C,5% C02的濕潤孵育箱中。
[0288] 通過使用改進的Neubauer血-細胞計數(shù)器計數(shù)來計算細胞數(shù)量。用Accutase? 升起的細胞具有3. 8百萬細胞/10cm2孔的密度。用TrypLE?升起的細胞具有3. 7百萬細胞 /10cm2孔的密度。由于集落形式膠原酶不能通過血細胞計數(shù)器計數(shù)??紤]到1比3. 5的分 流比,我們以2. 72百萬細胞/T25燒瓶或108, 000細胞/cm2的接種密度平板接種Accutase 處理的細胞,以2. 65百萬細胞/T25燒瓶或105, 000細胞/cm2的接種密度平板接種TrypLE? 處理的細胞。我們假定以相似的密度(105, 000至108, 000細胞/cm2)接種膠原酶處理的 孔,因為在酶處理之前孔與孔之間hES密度沒有看得出的差異。一個另外的燒瓶用膠原酶 升起的細胞平板接種以用于在下次傳代中計數(shù)的目的。
[0289] 每日更換補充有16 μ g/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基維持細胞4天。培養(yǎng)4天之后 培養(yǎng)物融合,并且單細胞處理的hES細胞形成了具有偶見成纖維細胞區(qū)塊(pocket)的hES 細胞單細胞層,而簇傳代的hES細胞形成大的集落形式簇的hES細胞(圖13)。然后這些細 胞再次傳代。
[0290] 如先前描述的,37°C下在酶中孵育細胞lOmin。10分鐘的處理之后Accutase?或 TrypLE?使細胞從塑料和MATRIGEL?中升起。膠原酶沒有升起細胞,因此細胞在37°C進一 步孵育總計45分鐘。用Accutase?升起另外的膠原酶燒瓶。然后用改進的Neubauer血細 胞計數(shù)器計數(shù)單細胞。
[0291] 酶孵育之后把含2% Probumin的2ml DMEM-F12加入每個燒瓶,從燒瓶中上下吸 取總體積(?4ml) 5-10次以便懸浮盡可能多的細胞。然后把懸浮液轉入50ml錐形管并以 200 Xg離心5min。然后在補充有16 μ g/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中重懸浮細胞,然后以 1 : 4的比例平板接種到用1 : 30 MATRIGEL?預包被的T25燒瓶。
[0292] Accutase?傳代的細胞培養(yǎng)4天之后具有總計5. 6百萬細胞(223, 000細胞/cm2) 的密度,TrypLE?傳代的細胞培養(yǎng)4天之后具有總計5. 05百萬細胞(202, 000細胞/cm2)的 密度,而膠原酶傳代的細胞培養(yǎng)4天之后具有總計3. 45百萬細胞(138, 000細胞/cm2)的 密度??紤]到細胞以1 : 4的比例傳代,對于Accutase?傳代以58, 000細胞/cm2的密度 平板接種細胞,對于TrypLE?傳代是51,000細胞/cm2,和35, 000細胞/cm2。
[0293] 然后生長細胞另外6天,每日更換補充有16ng/ml bFGF的MEF條件培養(yǎng)基。用膠 原酶傳代的細胞形成密集的同質細胞的大的集落并且已分化的/成纖維細胞樣細胞是稀 少的,而用Accutase?或TrypLE?傳代的細胞生長非常緩慢,隨著時間停止生長或長滿可能 由分化中的hES細胞形成的成纖維細胞樣細胞(圖14)。
[0294] 這些結果暗示從飼養(yǎng)物到無飼養(yǎng)物(MATRIGEL?)培養(yǎng)轉換的使用手動傳代或支 持簇形式傳代的酶(膠原酶或中性蛋白酶)的中間階段對使細胞在啟動單細胞傳代之前適 應MATRIGEL?上的無飼養(yǎng)物培養(yǎng)是最好的。
[0295] 遍及本文件引用的出版物在此通過引用全文并入。盡管本發(fā)明的多個方面已經(jīng)在 上面通過參考實施例和優(yōu)選方案說明了,將理解本發(fā)明的范圍不是通過上述說明而是通過 在專利法的原理下適當解釋的下列權利要求限定。
【權利要求】
1. 用于維持多能干細胞的方法,包括下列步驟: (a) 獲得多能干細胞簇; (b) 在MEF條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多能干細胞簇; (c) 用酶釋放該多能干細胞為單細胞;和 (d) 平板接種該單個多能干細胞到組織培養(yǎng)基質上,所述組織培養(yǎng)基質包含細胞外基 質以及bFGF或者成纖維細胞條件培養(yǎng)基; 其中所述酶為絲氨酸蛋白酶;引起最少細胞損壞;并且以約0.5 g/Ι至2.5 g/Ι的濃度 存在; 其中所述酶用于培養(yǎng)細胞2分鐘;并且 其中在釋放細胞后細胞成活力增強并且沒有獲得染色體異常。
2. 用于維持多能干細胞的方法,包括下列步驟: (a) 獲得多能干細胞簇; (b) 在MEF條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多能干細胞簇; (c) 用酶釋放該多能干細胞為單細胞;和 (d) 平板接種該單個多能干細胞到組織培養(yǎng)基質上,所述組織培養(yǎng)基質包含細胞外基 質以及MEF條件培養(yǎng)基; 其中所述酶為絲氨酸蛋白酶;引起最少細胞損壞;并且以約0.5 g/Ι至2.5 g/Ι的濃度 存在; 其中所述酶用于培養(yǎng)細胞2-5分鐘;并且 其中在釋放細胞后細胞成活力增強并且沒有獲得染色體異常。
【文檔編號】C12N5/0735GK104250632SQ201410379925
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2008年6月30日 優(yōu)先權日:2007年7月1日
【發(fā)明者】S.內爾遜 申請人:生命掃描有限公司