一種蛋白酶體亞單位突變體的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種蛋白酶體亞單位突變體的應(yīng)用。具體涉及核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白酶體亞單位突變體在制備胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑盒中的應(yīng)用；該突變體可用于制備胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑。本發(fā)明開拓了蛋白酶體亞單位突變體LMP7-145(Gln→Lys)在制備胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑中的應(yīng)用價(jià)值，通過檢測(cè)LMP7-145(Gln→Lys)的突變，以引起受檢者和臨床醫(yī)生的高度警惕。
【專利說明】一種蛋白酶體亞單位突變體的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及一種蛋白酶體亞單位突變體的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌是目前世界上腫瘤相關(guān)死亡的第二位腫瘤，并且近乎一半的胃癌發(fā)生在中 國(guó)。與其他惡性腫瘤相似，胃癌的發(fā)生是基于基因與環(huán)境相互作用的一個(gè)復(fù)雜的，多因素 的，多步驟過程。目前的研究顯示，遺傳和環(huán)境因素間的相互作用導(dǎo)致了患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)上 升。遺傳傾向在胃癌的發(fā)生中起了重要作用。先前的流行病學(xué)研究也證實(shí)了遺傳多態(tài)性和 胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間有著重要的關(guān)聯(lián)。
[0003] 在腫瘤細(xì)胞表面的HLA-I類抗原的表達(dá)，不僅對(duì)于炎癥相關(guān)反應(yīng)而且對(duì)于抗癌免 疫反應(yīng)中特異性免疫毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原起至關(guān)重要的作用。有報(bào)道稱HLA-I類抗原 能夠清除胃癌細(xì)胞，HLA-I類抗原可能在對(duì)抗腫瘤的自身免疫反應(yīng)中起重要作用。除此之 夕卜，下調(diào)胃癌HLA-I類抗原的表達(dá)與腫瘤的預(yù)后及腫瘤組織學(xué)相關(guān)。因此HLA-I類抗原可 能在胃癌的進(jìn)展中起重要作用。
[0004] 由腫瘤抗原衍生的多肽的形成有幾個(gè)步驟，這些多肽由HLA-I類抗原提呈給同源 CTLs。詳細(xì)的說就是，腫瘤抗原被蛋白酶體（LMP2和LMP7)分解成短鏈多肽，這些多肽被 TAP轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，HLA-I類抗原與β2微球蛋白及多肽結(jié)合。一旦多肽結(jié) 合，HLA-I類抗原異源三聚體復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放并通過特定分泌途徑轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面， 隨后發(fā)揮作用。
[0005] 目前沒有涉及LMP7_145(Gln -Lys)突變與胃癌風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究報(bào)道，也未見 LMP7-145(Gln - Lys)基因突變?cè)噭┖袘?yīng)用于胃癌篩查中的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種蛋白酶體亞單位突變體的應(yīng)用，可用 于胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查。
[0007] 技術(shù)方案：蛋白酶體亞單位突變體LMP7_145(Gln - Lys)在制備胃癌危險(xiǎn)人群檢 測(cè)篩查試劑盒中的應(yīng)用。
[0008] 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的蛋白酶體亞單位突變體在制備胃癌危險(xiǎn)人群檢 測(cè)篩查試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 一種胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑盒，包括檢測(cè)如SEQ ID NO. 1所示核苷酸的引物。
[0010] 所述胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑盒，所述引物為：正義： 5，-TCATGGCGCTACTAGATGTATG-3 ,;反義：5' -AACTCTTTGTCCTAACTTGCAC-3，。
[0011] 所述胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑盒，還包括Taq酶，PCR buffer，MgC12, dNTPs，限 制性內(nèi)切酶BsmI和瓊脂糖。
[0012] 通過病例對(duì)照研究，用PCR-RFLP方法測(cè)定核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示的 LMP7-145(Gln - Lys)基因突變。胃癌病例和對(duì)照的基因型分布都符合Hardy-Weinberg 平衡定律。與Gln/Gln基因型和Gin等位基因相比，攜帶LMP7-145 (Gin - Lys) Gln/Lys和 Lys/Lys基因型和Lys等位基因的受試者明顯增加了胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（Gln/Lys vs.Gln/ Gin ρ = 0· 049,校正后0R= 1. 32,95% Cl = 1.00 - 1.73 ;Lys/Lys vs. Gln/Gln p = 0.041， 校正后 OR = 2. 13,95 % Cl = 1. 03 - 4. 39)，（p = 0· 004,校正后 OR = 1. 39,95 % Cl = 1. 11 - 1. 74)。相比于攜帶野生Gln/Gln基因型的個(gè)體，攜帶變異基因型Gln/Lys+Lys/Lys 的個(gè)體顯著地增加了患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)（P = 0. 017,校正后OR = 1. 38,95% Cl = 1. 06 - 1. 80)。
[0013] 通過上述研究，可以確定LMP7-145(Gln -Lys)基因突變，與胃癌的發(fā)生關(guān)系密 切，若檢測(cè)LMP7-145(Gln - Lys)基因發(fā)生突變，則可確定被檢測(cè)人屬于胃癌危險(xiǎn)人群。 LMP7-145(Gln - Lys)基因突變?cè)噭┖型耆梢杂糜趯?duì)胃癌危險(xiǎn)人群進(jìn)行檢測(cè)篩查中。
[0014] 有益效果：本發(fā)明開拓了 LMP7-145 (Gin - Lys)在制備胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試 劑中的應(yīng)用價(jià)值，通過檢測(cè)LMP7-145 (Gin - Lys)的突變，以引起受檢者和臨床醫(yī)生的高度 警惕。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖 1 是 LMP7-145 (Gin - Lys)代表性的 Gln/Lys，Lys/Lys，Gln/Gln 的基因 型PCR圖；PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BsmI消化，然后在3 %瓊脂糖凝膠上分離。Marker : DLlOOOmarker ;泳道 2,6:Gln/Lys 雜合子（351，205,146bp);泳道 l，3,4:Gln/Gln 純合子 (205，146bp);泳道 5,7:Lys/Lys 純合子（351bp)。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面的實(shí)施例可使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本 發(fā)明。
[0017] 實(shí)施例1 :
[0018] 1材料與方法
[0019] ⑴受試者
[0020] 這是一項(xiàng)以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究，包含了 502例胃癌病例和502例非癌對(duì) 照。所有的病例都是從2009年至2014年在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院連續(xù)收集的，并且 這些病例都經(jīng)病理組織學(xué)確診為胃癌。排除的標(biāo)準(zhǔn)是繼發(fā)或復(fù)發(fā)的腫瘤病人。對(duì)照組是隨 機(jī)選自于同一時(shí)期的普外科，這些對(duì)照都沒有惡性腫瘤史且年齡（±5歲）和性別與病例組 相匹配。病例與對(duì)照病例都是來自于江蘇或周邊地區(qū)的沒有聯(lián)系的漢族個(gè)體。年齡，性別， 高血壓史，糖尿病史，吸煙史，住址，腫瘤位置，病理組織學(xué)分級(jí)，浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨 床分期這些信息均收集自調(diào)查表或醫(yī)療記錄。曾經(jīng)或目前吸煙每天大于10支以上，持續(xù)至 少兩年的個(gè)體，被定義為吸煙者。
[0021] (2)基因型
[0022] LMP7_145(Gln - Lys)基因突變?cè)噭┖邪ǎ阂粚?duì)引物（正義： 5 ' -TCATGGCGCTACTAGATGTATG-3 '，反義：5 ' -AACTCTTTGTCCTAACTTGCAC-3，，Taq 酶， PCR 131^€61'，]\%(：12，(1階1^，限制性內(nèi)切酶881111，瓊脂糖；具體為241^10\?〇?131^€61'(]\^1 Fermentas) , 1. 75 mmol /T, MgC12,0. 15 mmol /T, dNTP, 1 unit Taq polymerase (MBI fermentas)，0· 25 μ mol/L 各引物，瓊脂糖。
[0023] 采集受試者外周靜脈血3mL，EDTA-K2抗凝，基因組DNA是通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提取自外 周血白細(xì)胞。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。 PCR 反應(yīng)條件，最初 95°C預(yù)變性 2 min 后，95°C 35s，57.5°C 30s，72°C延伸 45s，72°C lOmin。 共30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增DNA。得到的351bp長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶BsmI (New England BioLabs，Beverly，ΜΑ)在65度狀態(tài)下持續(xù)酶切16小時(shí)，隨后在3%瓊脂糖凝膠上分離，并 使用1.0 g/L Goldview染料染色以決定基因型。對(duì)LMP7-145(Gln -Lys)，野生型純合子 Gln/Gln顯示了一個(gè)2個(gè)條帶為205,146bp，而純合子突變型Lys/Lys在351bp處形成1條 帶，雜合子突變Gln/Lys則分為三個(gè)條帶分別為351，205，146bp。大約10%的樣品被隨機(jī) 選出并進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示是一致的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因分型實(shí)驗(yàn)，PCR產(chǎn)物被直接 測(cè)序,結(jié)果是100 % -致的。
[0024] (3)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0025] 所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都是使用SPSS 20. 0 (SPSS Inc.，Chicago, IL，USA)軟件進(jìn)行 的。在此分析中，5%被定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且所有的分析檢測(cè)都是雙側(cè)的。不符合正態(tài) 分布的數(shù)值變量由中位數(shù)來概括，并使用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)分析。用Pearson's X 2檢 驗(yàn)來分析分類變量分布的差別。用擬合優(yōu)度評(píng)估LMP7-145 (Gin - Lys)的Hardy-Weinberg 平衡。多態(tài)性和胃癌風(fēng)險(xiǎn)間的聯(lián)系是通過〇R和95%可信區(qū)間來評(píng)估。粗的OR通過使用 Woolf近似法計(jì)算得到，校正后0R值通過非限制性logistic回歸法來校正年齡，性別，高血 壓史，糖尿病史，吸煙史與住址等情況。
[0026] 2 結(jié)果
[0027] (1) LMP7-145 (Gin - Lys)基因型檢測(cè)
[0028] LMP7-145 (Gin - Lys)得到的351bp長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶BsmI (New England BioLabs，Beverly，ΜΑ)在65度狀態(tài)下持續(xù)酶切16小時(shí)，隨后在3%瓊脂糖凝膠 上分離，并使用1.0 g/L Goldview染料染色以決定基因型。對(duì)LMP7-145(Gln -Lys)，野 生型純合子Gln/Gln顯示了一個(gè)2個(gè)條帶為205,146bp，而純合子突變型Lys/Lys在351bp 處形成1條帶，雜合子突變Gln/Lys則分為三個(gè)條帶分別為351，205，146bp，結(jié)果見圖1。
[0029] (2)胃癌病例和對(duì)照組的基本情況
[0030] 所有受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息和其它的參數(shù)顯示在表格1中。病例組與對(duì)照組在 高血壓史，糖尿病史和住址分布上沒有明顯的差別。胃癌病人中吸煙者的數(shù)量要多于對(duì)照 組（24. 5% vs. 16. 9% )
[0031] 表格 1
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 蛋白酶體亞單位突變體LMP7-145 (Gin -Lys)在制備胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑 盒中的應(yīng)用。
2. 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的蛋白酶體亞單位突變體在制備胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè) 篩查試劑盒中的應(yīng)用。
3. -種胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑盒，其特征在于包括檢測(cè)如SEQ ID NO. 1所示核苷 酸的引物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑盒，其特征在于所述引物為： 正義：5' -TCATGGCGCTACTAGATGTATG-3'; 反義：5，-AACTCTTTGTCCTAACTTGCAC-3，。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述胃癌危險(xiǎn)人群檢測(cè)篩查試劑盒，其特征在于還包括Taq酶，PCR buffer，MgCl2，dNTPs，限制性內(nèi)切酶BsmI和瓊脂糖。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104195233SQ201410360290
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】楊力, 徐澤寬, 張智弘, 王連生, 馬翔, 楊超, 唐然, 徐皓, 張殿彩, 郭人花 申請(qǐng)人:楊力