一種多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株及其融合瘤苗和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株及其融合瘤苗和制備方法，該細(xì)胞株有Foxp3和A20基因，所用轉(zhuǎn)染細(xì)胞為大鼠胰腺癌腫瘤細(xì)胞系DSL6A/C1。本發(fā)明的多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株及其融合瘤苗的制備方法，通過構(gòu)建過表達(dá)Foxp3和A20miRNA修飾Treg的DSL6A/C1細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的融合疫苗，獲得既有DC特殊功能又表達(dá)腫瘤抗原的新型腫瘤疫苗。采用Foxp3-A20共轉(zhuǎn)染修飾的腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞融合疫苗可進(jìn)一步增強(qiáng)其抗胰腺癌免疫效應(yīng)。融合疫苗不僅具有完整的腫瘤抗原，而且具有抗原遞呈細(xì)胞的特性，能夠有效地遞呈腫瘤抗原給T淋巴細(xì)胞，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，是腫瘤免疫治療的新方向，為腫瘤病人的治療提供了新思路，具有潛在的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株及其融合瘤苗和制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株及其融合瘤 苗和制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在腫瘤免疫過程中，T細(xì)胞的免疫功能起關(guān)鍵作用。特別是與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (reguLatory T cell, Treg)的免疫抑制性作用有密切的關(guān)系，因此清除患者體內(nèi)的Treg 有望改善患者的免疫功能。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，清除癌癥患者體內(nèi)Treg后Treg水平會很 快恢復(fù)并容易引起自身免疫疾病，因而靶向Treg的腫瘤治療策略應(yīng)從"清除（depletion) " 轉(zhuǎn)變?yōu)?抑制（inhibition) "，即抑制體內(nèi)Treg的數(shù)量和功能。目前，F(xiàn)oxp3是目前公認(rèn)的 Treg細(xì)胞的最敏感的標(biāo)志。Foxp3作為在胸腺中表達(dá)的自身抗原，其mRNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì) 胞（Dendritic cell，DC)以后形成的接種疫苗有能力刺激Foxp3特異性的CTL，引起Treg 的抑制和抗腫瘤免疫的加強(qiáng)，最重要的是，F(xiàn)oxp3疫苗優(yōu)先導(dǎo)致腫瘤組織中表達(dá)Foxp3的 Treg的抑制而不是抑制外周血中Treg,以及對Treg抑制的延長，降低了自身免疫反應(yīng)的危 險。Michael等人將過表達(dá)的Foxp3轉(zhuǎn)入DC后，可以通過DC細(xì)胞激活T細(xì)胞，調(diào)節(jié)APC反 應(yīng)，過表達(dá)Foxp3的DC能夠在體外明顯抑制Treg細(xì)胞以及⑶8+T細(xì)胞的增殖。鋅指蛋白 A20沉默的樹突狀細(xì)胞顯示出自發(fā)的、增強(qiáng)的共刺激分子和促炎癥因子的表達(dá)，而對于T細(xì) 胞亞型則有著不同的效果一它抑制Treg并強(qiáng)烈激活腫瘤浸潤性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和產(chǎn)生 IL-6和TNF- α的輔助性T細(xì)胞，是一個難以抗拒的Treg調(diào)節(jié)的抑制物。樹突狀細(xì)胞和腫 瘤細(xì)胞融合，可以獲得既有DC特殊功能又表達(dá)腫瘤抗原的雜合體，但是DC攝取腫瘤抗原誘 導(dǎo)免疫激活還是抑制，取決于腫瘤細(xì)胞釋放危險信號（GM-CSF、MCP1及熱休克蛋白等）還是 抑制性信號（TGF-β p ID0和iNOS等）。在危險信號的調(diào)節(jié)下，激活Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答清 除腫瘤；而在抑制性信號的作用下，激活Th2應(yīng)答，不能有效清除腫瘤。美國華盛頓大學(xué)醫(yī) 學(xué)中心實驗發(fā)現(xiàn)，在人胰腺癌及小鼠胰腺癌模型（Pan02)，腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)物可引起CCR5趨 化因子受體配體的增加，同時，與⑶4+F 〇xp3_效應(yīng)T細(xì)胞相比，⑶4+F〇Xp3+Treg S更優(yōu)先表達(dá) CCR5,通過減少腫瘤細(xì)胞產(chǎn)物CCL5,或者通過給予CCR5抑制劑，則CCR5/CCL5信號被打破， Treg向腫瘤的聚集減少，而小鼠對照組的腫瘤細(xì)胞也變小了，因此，這項研究表明，通過阻 斷Treg向腫瘤的聚集，可能能解決免疫逃避的問題，與DC疫苗聯(lián)合應(yīng)用能更好的治療胰腺 癌。基因修飾的樹突狀細(xì)胞融合疫苗是指以基因工程的方法將一些釋放危險信號或者阻斷 抑制信號的細(xì)胞因子（如IL-12和TGF-β J或者調(diào)節(jié)功能相關(guān)基因（如A20和Foxp3)導(dǎo) 入腫瘤細(xì)胞（或DC細(xì)胞）后再與DC (或者腫瘤細(xì)胞）進(jìn)行融合，融合細(xì)胞能持續(xù)分泌這些 細(xì)胞因子，比單純的融合疫苗更為有效。近來腫瘤疫苗已發(fā)展成為一種重要的腫瘤生物治 療手段。與手術(shù)治療、放射治療相比，毒副作用小，特異性高，作用范圍更廣泛。在腫瘤治療 研究中越來越引起重視。目前針對各種腫瘤而設(shè)計了多種的轉(zhuǎn)基因瘤苗，如將各種細(xì)胞因 子轉(zhuǎn)染相關(guān)的腫瘤細(xì)胞以改善腫瘤細(xì)胞的遺傳背景，提高免疫原性，誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種多基因轉(zhuǎn)染 腫瘤細(xì)胞株，構(gòu)建過表達(dá)Foxp3和A20miRNA修飾Treg的DSL6A/C1細(xì)胞。本發(fā)明的另一目 的是提供一種融合瘤苗，獲得既有DC特殊功能又表達(dá)腫瘤抗原的新型腫瘤疫苗。本發(fā)明還 有一目的是提供一種上述多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株的制備方法。本發(fā)明還有一目的是提供一 種上述融合瘤苗的制備方法。
[0004] 技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0005] -種多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株，負(fù)載過表達(dá)Foxp3質(zhì)粒和A20miRNA質(zhì)粒，所用轉(zhuǎn)染 細(xì)胞為大鼠胰腺癌腫瘤細(xì)胞系DSL6A/C1。
[0006] 一種多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株的制備方法：構(gòu)建負(fù)載過表達(dá)Foxp3質(zhì)粒和A20miRNA 質(zhì)粒，采用慢病毒法共轉(zhuǎn)染到DSL6A/C1細(xì)胞，抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
[0007] -種融合瘤苗，為所述的多基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株與樹突狀細(xì)胞的融合疫苗，既有DC特 殊功能又表達(dá)腫瘤抗原。
[0008] -種融合瘤苗的制備方法：構(gòu)建負(fù)載過表達(dá)Foxp3質(zhì)粒和A20miRNA質(zhì)粒，采用慢 病毒法共轉(zhuǎn)染到DSL6A/C1細(xì)胞，抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，熒光拍照，利用PEG法與樹突狀細(xì) 胞融合而構(gòu)建融合疫苗。
[0009] 有益效果：有現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株及其融合瘤苗的制 備方法，通過構(gòu)建過表達(dá)Foxp3和A20miRNA修飾Treg的DSL6A/C1細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的融 合疫苗，獲得既有DC特殊功能又表達(dá)腫瘤抗原的新型腫瘤疫苗。采用F 〇Xp3-A20共轉(zhuǎn)染修 飾的腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞融合疫苗可進(jìn)一步增強(qiáng)其抗胰腺癌免疫效應(yīng)。融合疫苗不僅具 有完整的腫瘤抗原，而且具有抗原遞呈細(xì)胞的特性，能夠有效地遞呈腫瘤抗原給T淋巴細(xì) 胞，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，是腫瘤免疫治療的新方向，為腫瘤病人的 治療提供了新思路，具有潛在的應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是A20miRNA干擾效果比較圖；
[0011] 圖2是PMIDM498-1在突光顯微鏡下同一視野的突光和可見光照片圖；
[0012] 圖3是Lenti-PMIDM498-1感染細(xì)胞后96小時各孔的熒光照片圖；
[0013] 圖4是Lenti-13MR0056-1-LR-1感染細(xì)胞后96小時各孔的熒光照片圖；
[0014] 圖5是DSL6A/C1細(xì)胞抗生素最佳篩選劑量結(jié)果圖；
[0015] 圖 6 是 DSL-6A/C1-A20-GFP、DSL-6A/Cl-Foxp3-Red、、DSL-6A/Cl-Foxp3-A20 這三 株細(xì)胞混合穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株可見光和熒光圖；
[0016] 圖7是RT-PCR檢測干擾后DSL6A/C1細(xì)胞A20miRNA表達(dá)結(jié)果圖；
[0017] 圖8是RT-PCR檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)Foxp3后DSL6A/C1細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)結(jié)果圖；
[0018] 圖 9 是 RT-PCR 檢測 Foxp3-A20-DSL6A/Cl 細(xì)胞 A20miRNA 表達(dá)結(jié)果圖；
[0019] 圖 10 是 RT-PCR 檢測 Foxp3-A20-DSL6A/Cl 細(xì)胞 Foxp3 表達(dá)結(jié)果圖；
[0020] 圖11是Western Blot檢測干擾后DSL6A/C1細(xì)胞A20蛋白表達(dá)結(jié)果圖；其中， 1. DSL-6A/C1 ;2· DSL-6A/Cl-Nega-表達(dá)；3. DSL-6A/Cl-Foxp3 ;
[0021] 圖12是Western Blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)Foxp3-DSL6A/Cl細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)結(jié)果圖；其 中，1. DSL-6A/C1 ;2· DSL-6A/Cl-Nega-表達(dá)；3. DSL-6A/Cl-Foxp3 ;
[0022] 圖13是Western Blot檢測Foxp3-A20的DSL6A/C1細(xì)胞A20蛋白表達(dá)結(jié)果圖； 其中，1. DSL6A/C1 ;2· DSL6A/Cl-Nega ;3· DSL6A/C1-A20 ;4· DSL6A/Cl-A20-Nega ;5· DSL6A/ Cl-Foxp3 ；6.DSL6A/Cl-Foxp3-Nega ；7.DSL6A/Cl-Foxp3-A20 ；
[0023] 圖14是Western Blot檢測Foxp3_A20的DSL6A/C1細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)結(jié)果圖； 其中，1. DSL6A/C1 ;2. DSL6A/Cl-Nega ;3. DSL6A/C1-A20 ;4.DSL6A/Cl-A20-Nega ;5. DSL6A/ Cl-Foxp3 ;6·DSL6A/Cl-Foxp3-Nega ;7·DSL6A/Cl-Foxp3-A20 ;
[0024] 圖15是大鼠成熟DC細(xì)胞培養(yǎng)的光鏡細(xì)胞圖；
[0025] 圖16是流式鑒定大鼠 DC細(xì)胞表型結(jié)果圖，其中，⑶83陽性檢測率為72. 11% ;
[0026] 圖17是流式鑒定大鼠 DC細(xì)胞表型結(jié)果圖，其中，⑶86陽性檢測率為79. 35% ;
[0027] 圖18是流式鑒定大鼠 DC細(xì)胞表型結(jié)果圖，其中，MHCII的陽性率為93. 52% ;
[0028] 圖19是DSL6A/Cl-Foxp3-A20與DC融合細(xì)胞的光鏡細(xì)胞圖；
[0029] 圖20是⑶83融合疫苗表型鑒定結(jié)果圖；
[0030] 圖21是⑶86融合疫苗表型鑒定結(jié)果圖；
[0031] 圖22是免疫磁珠分選純化融合疫苗的A20-FITC流式結(jié)果圖；
[0032] 圖23是免疫磁珠分選純化融合疫苗的Foxp3-PE流式結(jié)果圖；
[0033] 圖24是免疫磁珠分選純化融合疫苗的0X62-PE流式結(jié)果圖；
[0034] 圖25是流式鑒定⑶4+T細(xì)胞分選純度結(jié)果圖；
[0035] 圖26是流式鑒定⑶8+T細(xì)胞分選純度結(jié)果圖；
[0036] 圖27是MTT法檢測不同融合細(xì)胞增殖的影響結(jié)果圖；
[0037] 圖28是Transwell法法檢測不同融合細(xì)胞侵襲力的影響結(jié)果圖；
[0038] 圖29是不同組別不同效靶比大鼠細(xì)胞殺傷率LDH法檢測結(jié)果圖；
[0039] 圖30是ELISpot檢測不同組別大鼠⑶4+T細(xì)胞IFNi和IL-2分泌情況結(jié)果圖；
[0040] 圖31是ELISpot檢測不同組別大鼠⑶4+T細(xì)胞IL-2和IFN- γ陽性率結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不受這些實施例子的限 制。以下實施例中，未詳盡說明的操作為常規(guī)操作，所使用的主要材料和試劑如下：
[0042] 1)對象：大鼠 DSL6A/C1細(xì)胞購自于美國biohermes公司；DC細(xì)胞株來源于南通大 學(xué)動物實驗中心提供的SD6-8周雄性大鼠，過表達(dá)Foxp3的慢病毒載體、A20miRNA干擾慢 病毒載體購于美國Invitrogen公司。
[0043] 2)主要試劑
[0044] 美國Invitrogen公司：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PVDF膜、蛋白酶抑制劑混合物Protease Inhibitor, cocktail, PMSF、Opti-MEM培養(yǎng)液、10XRT緩沖液，大中抽質(zhì)粒盒，慢病毒表達(dá) 載體PMIDM498-1，pLPl、pLP2、pLP/VSVG，293T 細(xì)胞，DMEM、MEM，pLenti6. 3-MCS-IRES2-DsRed Monomer，pcDNA6.2-GW/EmGFP_miR，殺稻癌菌素 Blasticidin S HC1，Lipofectamine2000， Packaging Mix，Trypsin，Trizol，RNase H，蛋白酶抑制劑混合物 Protease Inhibitor cocktail〇
[0045] 美國gibco公司：雙抗，胰蛋白酶-EDTA，磷酸鹽緩沖鹽水PBS，胎牛血清FBS， RPMI1640 培養(yǎng)液，IL-4、GM-CSF、TNF- α (美國 p印rotech 公司），M199 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0046] 美國 BD 公司：FITC-CD83、FITC-CD86, anti-CD83PE、anti-CD86FITC，紅細(xì)胞裂解 液，大鼠 IFN-γ和IL-2ELISP0T檢測試劑盒。
[0047] 美國Sigma公司：壯觀霉素，Polybrene。美國Axygen公司：DNA凝膠回收試劑盒。
[0048] 德國Miltenyi公司：大鼠⑶4+、⑶8+抗體免疫磁珠，磁珠分選緩沖液，LD分離柱。
[0049] 美國 Ebioscience 公司：APC-anti-rat CD4 單克隆抗體，F(xiàn)ITC-anti-rat CD8 單克 隆抗體，F(xiàn)ITC-MHCII、PE-0X62。
[0050] 美國 AMRESC0 公司：MTT。美國 Costar 公司：Tanswell plate。美國 Promega 公司： LDH檢測試劑盒。英國NEB公司：PacI、AscI、T4DNA ligase。北京全式金生物技術(shù)有限公 司：stbl3 感受態(tài)細(xì)胞。瑞士 Roche 公司：SYBR green mixtures。Fermentas 公司：RT-PCR 試劑盒。美國Thermo公司：ECL發(fā)光液，美國Santacruz公司：Anti_A20和Anti_F0XP3,康 成生物：Anti-GAPDH-HRP。
[0051] 3)主要試劑配制：
[0052] ① LB液體培養(yǎng)基：5g酵母，10g蛋白胨，10g氯化鈉，900mL雙蒸水，完全溶解后加 至1L。②慢病毒稀釋用培養(yǎng)基配置：DMEM+2% FBS+8ug/mL的Polybrene。③氯化銨紅細(xì)胞 裂解液（10X 的儲存液）：8. 4g NaHC03(100mM)+3. 7g EDTA二鈉（10mM)，加水至 900mL，然后 用IN的HC1或IN的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 4。最后加水至1升。該10X的儲存液可在4°C 保存6個月。工作液的配制：在使用前蒸餾水稀釋10倍即可。（1份儲存液加上9份水）。 ④HAT選擇性培養(yǎng)系統(tǒng)：100XHT:50mL去離子水+68mg次黃嘌呤（H)+19mg胸腺嘧啶核苷 (T)，70°C水浴助溶使充分溶解。100XA:50mL去離子水+0. 88mg氨基喋呤（A)，加1. Omol. L NaOHO. 25mL助溶，lmol.L HC1調(diào)節(jié)pH值至7. 4。⑤HAT選擇性培養(yǎng)液：DMEM完全培養(yǎng) 基100mL+HT母液lmL+A母液lmL，0. 75% NaHC03調(diào)節(jié)pH值至7. 2?7. 4。HT選擇性培養(yǎng) 液：DMEM完全培養(yǎng)基100mL+HT母液lmL，0· 75% NaH-C03調(diào)節(jié)pH值至7. 2?7. 4。⑥MTT 溶液配制：MTT以PBS配制成5mg/mL儲備液，0. 22 μ m濾膜除菌分裝，避光4°C保存。⑦M(jìn)TT 溶解液配方：10 g十二烷基硫酸鈉，25mL二甲基酰胺，25mL水，lmL冰醋酸，1. 25mLlmol/L鹽 酸，調(diào)ρΗ4· 7。⑧1 XPBST液0· 5mLTween-20加入1 XPBSlOOOmL中，混勻后即刻使用，現(xiàn)用 現(xiàn)配。
[0053] 實施例1 Foxp3過表達(dá)、A20miRNA質(zhì)粒構(gòu)建及測定
[0054] (l)Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0055] 針對祀基因 Rat Foxp3NCBI 查找序列 ΝΜ_001108250· 1，利用 Invitrogen 設(shè) 計軟件設(shè)計擴(kuò)增序列，用PacI/AscI把NM_001108250. 1目的序列進(jìn)行酶切，按酶切 體系（10Xbuffer5uL，12GS0498-l(Rat Foxp3 基因序列）10uL，PacI、AscI 各 luL， 加雙餾水至 23uL，37 °C )，酶切 2 小時，用 PacI/AscI 把 pLenti6. 3-MCS-IRES2-DsRed Monomer(過表達(dá)Foxp3基因的目的載體，美國Invitrogen)，按酶切體系（10Xbuffer5uL， pLenti6. 3-MCS-IRES2-DsRed Monomer2uL，PacI、AscI 各 luL，加雙餾水至 41uL，37°C )，酶 切2小時，電泳，并回收酶切的目的片段。用T4DNA ligase連接回收的片段與載體，按連接 體系（Ligation bufferluL，VectorluL，F(xiàn)ragment2uL，T4DNA ligase(400U/uL)0.5uL，力口 雙餾水至5. 5uL)室溫連接2小時，取5 μ 1連接產(chǎn)物加入lOOuL Stbl3感受態(tài)細(xì)胞的離心 管中，輕甩混勻在冰上孵育30min，42°C水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻30min。 向管中加入lmL LB液體培養(yǎng)基（5g酵母，lOg蛋白胨，lOg氯化鈉，900mL雙蒸水，完全溶解 后加至1L)，混勻后37°C，2200rpml小時，離心5500rpm 3min，超凈工作臺中倒上上清，留 100uL涂板。用移液器吹吸菌體重懸，吸取菌液涂LB板（含50ng/mL氨芐霉素），37°C正置 lh，待無液體流動后倒置培養(yǎng)板過夜，以LB/氨芐霉素平板上長出單菌落為轉(zhuǎn)化成功。從轉(zhuǎn) 化的平板上挑取多個單克隆進(jìn)行測序驗證，結(jié)果正確。
[0056] (2)A20miRNA干擾載體的構(gòu)建
[0057] 針對靶基因 Rat A20NCBI 查找序列 ΧΜ_003748656· 1，利用 Invitrogen miRNA 設(shè)計 軟件設(shè)計兩對miRNA寡聚單鏈DNA及陰性對照序列寡聚單鏈DNA (表1)。將2對合成好的寡 聚單鏈DNA用ddH20溶解成100 μ M，互補(bǔ)單鏈各取5 μ L兩兩混合，按DNA退火體系（100 μ Μ top strand oligo>100 μ M bottom strand oligo 各 5uL,10Xoligo annealing buffer 2 μ L，雙餾水8uL)進(jìn)行退火，將2份oligo混合物在95°C加熱5分鐘，然后放置室溫20分 鐘，形成雙鏈DNA，將退火的雙鏈DNA繼續(xù)稀釋成10nM濃度，按酶連接體系（5X ligation buffer4uL， pcDNA6.2-GW/EmGFP_miR(A20miRNA 目的載體，美國 Invitrogen)2uL， ds oligo (10nM) 4uL，T4DNA ligase (1U/ μ L) luL，雙餾水 9uL)在室溫連接 30 分鐘，取 10 μ L 連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化l〇〇yL感受態(tài)細(xì)胞DH5a，涂LB平板（含SOyg/mL壯觀霉素）后，37°C孵育， 以LB/壯觀霉素平板上長出單菌落為轉(zhuǎn)化成功。每個轉(zhuǎn)化平板分別挑取3個克隆，搖菌抽 提質(zhì)粒后進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果如圖1所示，通過RT-PCR篩選效果最好的一對為miRNAl。
[0058] 表1 A20miRNA載體名稱及序列
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株，其特征在于：含有Foxp3和A20基因，所用轉(zhuǎn)染細(xì)胞為 大鼠胰腺癌腫瘤細(xì)胞系DSL6A/C1。
2. -種多基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于：構(gòu)建負(fù)載過表達(dá)Foxp3質(zhì)粒 和A20miRNA質(zhì)粒，采用慢病毒法共轉(zhuǎn)染到DSL6A/C1細(xì)胞，抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
3. -種融合瘤苗，其特征在于：為權(quán)利要求1所述的多基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株與樹突狀細(xì)胞 的融合疫苗，既有DC特殊功能又表達(dá)腫瘤抗原。
4. 一種融合瘤苗的制備方法，其特征在于：構(gòu)建負(fù)載過表達(dá)Foxp3質(zhì)粒和A20miRNA質(zhì) 粒，采用慢病毒法共轉(zhuǎn)染到DSL6A/C1細(xì)胞，抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，熒光拍照，利用PEG法 與樹突狀細(xì)胞融合而構(gòu)建融合疫苗。
【文檔編號】C12N15/867GK104099297SQ201410356991
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】周國雄, 黃莉莉 申請人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院