一種實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測(cè)人星狀病毒和諾如病毒的探針、引物、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種特異性檢測(cè)人星狀病毒和諾如病毒的通用探針，特異性擴(kuò)增引物，含有所述探針及引物的試劑盒，以及利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法同時(shí)檢測(cè)人星狀病毒和諾如病毒的非診斷性的方法，所述的探針利用通用堿基，可以特異性的結(jié)合由特異性引物擴(kuò)增得到的來(lái)自人星狀病毒和諾如病毒的特異性片段，在PCR過(guò)程中可以同時(shí)檢測(cè)待測(cè)樣本中是否存在星狀病毒以及諾如病毒，所述的方法可以針對(duì)兒童糞便，肛拭子等樣本進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法具有周期短，效率高，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好等特點(diǎn)。同時(shí)本申請(qǐng)克服了現(xiàn)有技術(shù)中不能同時(shí)檢測(cè)星狀病毒和諾如病毒的缺陷，具有良好色市場(chǎng)應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】—種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)人星狀病毒和諾如病毒的探針、引物、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)檢測(cè)人星狀病毒和諾如病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)探針及其引物，以及所述的探針及引物在制備檢測(cè)人星狀病毒和諾如病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小兒腹瀉是世界行的常見(jiàn)病，嚴(yán)重危害兒童的身體健康和生命安全。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年有超過(guò)一千萬(wàn)小于5歲的兒童夭亡，而由于腹瀉引起的死亡占18%。另有文獻(xiàn)報(bào)道每年約有2百萬(wàn)幼兒因腹瀉及其并發(fā)癥死亡，發(fā)展中國(guó)家死亡率大于發(fā)達(dá)國(guó)家，而其中約85%死亡病例來(lái)源于世界上的欠發(fā)達(dá)國(guó)家。引起小兒腹瀉的常見(jiàn)病原超過(guò)20種，但病毒性腹瀉較為常見(jiàn)，也越來(lái)越受到臨床工作者的重視。急性小兒腹瀉的常見(jiàn)病原體有人輪狀病毒(Human Rotavirus, HRV)、腸道腺病毒(EntericAdenovirus, 90EAdV)、人杯狀病毒(Human Caliciviruses, HuCV)、星狀病毒(Astrovirus, AstV)與諾如病毒(Norovirus, NV)
坐寸ο
[0003]人星狀病毒是由Madeley在1975年首次在電鏡下觀察到的病毒，根據(jù)宿主的不同可以分為哺乳動(dòng)物 屬和禽類屬。1997年，Noel等將星狀病毒分為7個(gè)基因型，發(fā)現(xiàn)其與血清型的劃分一致，隨后各地又報(bào)道了血清型8的發(fā)現(xiàn)。星狀病毒屬于單股正鏈RNA病毒，基因組從5’端到3’端包括一個(gè)85nt的5’非編碼區(qū)，3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFla、ORFlb、0RF2)，I個(gè)約80nt的3’非編碼區(qū)以及一個(gè)30nt的poly A尾巴。其中ORFla和ORFlb編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是絲氨酸蛋白酶和RNA依賴的RNA聚合酶，0RF2編碼衣殼蛋白。目前現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)星狀病毒的方法主要為電鏡檢測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)、基因芯片檢測(cè)、核酸序列依賴擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid sequence based amplification, NASBA)檢測(cè)。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)易，是臨床常規(guī)選擇的檢測(cè)方法。
[0004]諾如病毒是1968年在美國(guó)俄亥俄州諾瓦克地區(qū)的一所學(xué)校中暴發(fā)的一起流行性腹瀉的患者糞便中發(fā)現(xiàn)的，因此而得名，是首個(gè)被確認(rèn)為引起人類急性胃腸炎的病毒。近年來(lái)隨著對(duì)諾如病毒分子生物學(xué)研究的進(jìn)展?，F(xiàn)在人們認(rèn)為諾如病毒是造成胃腸炎流行的首要原因，也是兒童和成人散發(fā)性胃腸炎的重要原因。常年都有諾如病毒感染病例發(fā)生，發(fā)病高峰為秋冬季，可通過(guò)食物、水源、接觸等多種途徑傳播，因而在一些公共場(chǎng)所如醫(yī)院、學(xué)校、軍隊(duì)中引起大規(guī)模爆發(fā)，人群危害較大。
[0005]諾如病毒是一個(gè)單股正鏈無(wú)包膜RNA病毒。屬于人杯狀病毒科,諾如病毒屬在電鏡下是有結(jié)構(gòu)的小圓病毒，直徑26~35nm,呈二十面體對(duì)稱,外殼是由180個(gè)同一種外殼蛋白組成的90個(gè)二聚體構(gòu)成。整個(gè)基因組分為三個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中ORFl編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(一個(gè)約200kD的多蛋白，被病毒編碼蛋白酶切割后產(chǎn)生病毒復(fù)制必需的RNA多聚酶蛋白，ORFl編碼包括保守的具有RNA多聚酶在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)蛋白);0RF2和0RF3編碼結(jié)構(gòu)蛋白:0RF2編碼57kD的主要結(jié)構(gòu)蛋白VPl ；0RF3編碼一個(gè)22kD的小結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)諾如病毒RNA多聚酶區(qū)和衣殼區(qū)的核酸序列，將NoV分為5個(gè)基因組:G I，G II，G III，G IV，G V，其中根據(jù)0RF2全基因組序列，GI可分為14個(gè)基因型，G II可分為19個(gè)基因型，其中我國(guó)主要感染的是G II 1，G II 3，G II 4?，F(xiàn)有技術(shù)中常用的檢測(cè)諾如病毒的方法是電鏡法、普通RT-PCR方法、多重RT-PCR檢測(cè)以及ELISA技術(shù)。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)有多種檢測(cè)星狀病毒以及諾如病毒的方法，以及可以同時(shí)檢測(cè)雙重?zé)晒舛恳徊絉T-PCR法同時(shí)檢測(cè)G I，G II型諾如病毒。但是，現(xiàn)有技術(shù)中并未有同時(shí)檢測(cè)星狀病毒和諾如病毒的檢測(cè)方法，本發(fā)明的目的即為克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，即通過(guò)一步RT-PCR方法檢測(cè)待測(cè)樣本中是否存在星狀病毒或諾如病毒，以此來(lái)提高檢測(cè)效率，節(jié)約檢測(cè)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的原理在于針對(duì)星狀病毒和諾如病毒的穩(wěn)定保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，并針對(duì)序列對(duì)比同源性較高區(qū)域設(shè)計(jì)共用探針，然后通過(guò)實(shí)施定量RT-PCR檢測(cè)待測(cè)樣本中是否存在星狀病毒或諾如病毒。
[0008]為高效、特異、靈敏的檢測(cè)出星狀病毒和諾如病毒，本發(fā)明在GenBank中現(xiàn)有的所有的星狀病毒和諾如病毒的基因序列進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析，分別找出了星狀病毒和諾如病毒的特異性保守區(qū)，并真對(duì)這些保守區(qū)域設(shè)計(jì)了引物及探針。通過(guò)對(duì)星狀病毒和諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)株的檢測(cè)，確定分別針對(duì)星狀病毒和諾如病毒的引物對(duì)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選得到一條靈敏度高、特異性好，且針對(duì)星狀病毒和諾如病毒的一條探針，即分別與星狀病毒的雙鏈基因組特異性結(jié)合的上游引物AstV-F和下游引物AstV-R、與諾如病毒的雙鏈基因組特異性結(jié)合的上游引物NoV-F和下游引物NoV-R以及能夠分別與上述兩對(duì)兒引物擴(kuò)增片段特異性結(jié)合的通用探針P，所述的探針P兩端分別結(jié)合熒光報(bào)告基團(tuán)(FLUO)和熒光淬滅基團(tuán)(QUEN)，其中熒光報(bào)告基團(tuán)任選自FAM，TET, JOE, HEX, VIC ;熒光淬滅基團(tuán)任選自TAMRA, DABCYL, BHQ。
[0009]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中提供了一條特異性結(jié)合星狀病毒和諾如病毒的通用探針，其中所述的探針序列為 FLU0-5’ -TTTCAMCCWTYTGAGGSCCCTGCCCCMAT-TAMRA-3’ -QUEN。其中，F(xiàn)LUO代表熒光報(bào)告基團(tuán)，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)可以選自本領(lǐng)域常規(guī)選用的熒光基團(tuán)，優(yōu)選的為FAM, TET, JOE, HEX, VIC,更優(yōu)選的為FAM, TET，最優(yōu)選的為FAM ；QUEN代表熒光淬滅基團(tuán)，所述的熒光淬滅基團(tuán)可以選自本領(lǐng)域常規(guī)選擇的淬滅基團(tuán)，優(yōu)選的為TAMRA, DABCYL, BHQ,更優(yōu)選的為TAMRA，BHQ,最優(yōu)選為TAMRA。所述探針的序列中，M、W、Y、S為通用堿基，其中代表A或C，W代表A或T，S代表G或C，Y代表C或T。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了可以特異性擴(kuò)增星狀病毒和諾如病毒的引物對(duì)，其中擴(kuò)增星狀病毒的上游引物為Astv-F5’ -CCATGCAGGGTTTCACTTCT-3’，擴(kuò)增星狀病毒的下游引物為AstV-R5’ -GATGGCATACACATCAGCTT-3’ ；擴(kuò)增諾如病毒的引物為NoV-F
[0011]5’ -TAAGAGGGACCTCCAATGGC-3’，擴(kuò)增諾如病毒的下游引物為 NoV-R
[0012]5，-GAATGGCCAAACTGTGTCAT-3，。
[0013]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例提供了一種同時(shí)檢測(cè)星狀病毒和諾如病毒的試劑盒，所述的試劑盒包括RT-PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控液，人星狀病毒和諾如病毒的陽(yáng)性質(zhì)控品等。其中所述的陰性質(zhì)控液為雙蒸水；其中所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為通過(guò)引物擴(kuò)增得到的特異性片段連接入質(zhì)粒而得到；其中所述的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs和PCR buffer ;其中所述的RT-PCR反應(yīng)液還包括可以特異性擴(kuò)增星狀病毒和諾如病毒的引物對(duì)，其中所述的引物對(duì)分別為擴(kuò)增星狀病毒的上游引物為AstV-F
[0014]5’ -CCATGCAGGGTTTCACTTCT-3’，擴(kuò)增星狀病毒的下游引物為 AstV_R5’ -
[0015]GATGGCATACACATCAGCTT-3’ ； 擴(kuò)增諾如病毒的引物為NoV-F5’ -TAAGAGGGACCTCCAATGGC-3’，擴(kuò)增諾如病毒的下游引物為NoV-R5’ -GAATGGCCAAACTGTGTCAT-3’ ；其中所述的RT-PCR反應(yīng)液還包括同時(shí)特異性結(jié)合人星狀病毒和諾如病毒的通用探針，所述的探針序列為為FLU0-5 ’ -TTTCAMCCWTYTGAGGSCCCTGCCCCMAT-TAMRA-3’-QUEN。其 中，F(xiàn)LUO代表熒光報(bào)告基團(tuán)，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)可以選自本領(lǐng)域常規(guī)選用的熒光基團(tuán)，優(yōu)選的為FAM，TET, JOE, HEX, VIC,更優(yōu)選的為FAM，TET,最優(yōu)選的為FAM ;QUEN代表熒光淬滅基團(tuán)，所述的熒光淬滅基團(tuán)可以選自本領(lǐng)域常規(guī)選擇的淬滅基團(tuán)，優(yōu)選的為TAMRA，DABCYL，BHQ，更優(yōu)選的為TAMRA，BHQ,最優(yōu)選為TAMRA。所述探針的序列中，M、W、Y、S為通用堿基，其中代表A或C，W代表A或T，S代表G或C，Y代表C或T。
[0016]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一種非診斷性的同時(shí)檢測(cè)人星狀病毒和諾如病毒的方法，其中所述的方法包括利用RNA提取試劑盒提取來(lái)自待測(cè)樣本的RNA樣本，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的方法得到cDNA樣本，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR的方法通特異性引物分別擴(kuò)增星狀病毒和諾如病毒的片段，并利用通用探針結(jié)合PCR擴(kuò)增得到的特異性片段，通過(guò)熒光信號(hào)判斷待測(cè)樣本中是否存在星狀病毒和諾如病毒。
[0017]在進(jìn)一步的實(shí)施例中所述的方法還包括利用RNA/DNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得糞便核酸樣本，并通過(guò)PCR擴(kuò)增星狀病毒和諾如病毒獲得PCR產(chǎn)物，所述產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后TA克隆到pGM-T載體，搖菌獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，進(jìn)行熒光PCR獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0018]在進(jìn)一步的實(shí)施例中，使用該體系檢測(cè)了兩例星狀病毒和諾如病毒陽(yáng)性糞便標(biāo)本，每個(gè)樣本重復(fù)三次；在更具體的實(shí)施例中，熒光PCR引物探針比例為，星狀病毒引物:諾如病毒引物:通用探針=2:2:1 ;進(jìn)一步的，所述的方法中的引物和探針的濃度分別為星狀病毒上下游引物濃度為0.5-1 μ mol/L,諾如病毒上下游引物濃度為0.5-1 μ mol/L，通用探針濃度為0.25-0.5 μ mol/L，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比，判斷待測(cè)樣本中目的檢測(cè)物的拷貝數(shù)。
[0019]進(jìn)一步的，逆轉(zhuǎn)錄采用大連寶生物PrimeScript?RT-PCR Kit,具體操作步驟，參照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，其中反應(yīng)體系為dNTP Mixturel μ L, random6mersl μ L,糞便核酸樣本 5 μ L, RNase Free dH20 補(bǔ)足至 10 μ L, 65 °C 變性 5min 后，加入 5 XPrimeScriptBuffer4 μ L> RNaseinhibitor0.5 μ L> PrimeScript RTase0.5 μ L> RNase Free dH20 補(bǔ)足至20 μ L。所述的反應(yīng)條件為42°C 45min,85°C 5min。
[0020]進(jìn)一步的，所述的方法采用如下體系擴(kuò)增星狀病毒和諾如病毒獲得PCR產(chǎn)物:cDNA樣本0.5 μ L，Taq DNA聚合酶2U/反應(yīng)，上下游引物為I μ L (0.5 μ mol/L), dNTPs0.2mmol/Ll μ L, 10Xbuffer2 μ I，余量用雙蒸水補(bǔ)齊20 μ L ;所述的PCR反應(yīng)條件為 94°C 5min,94°C 15sec，61°C 30sec，72°C 30sec，共 35 個(gè)循環(huán)，所述的 PCR 結(jié)果見(jiàn)圖 la，圖lb。
[0021]進(jìn)一步的，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆連接入pGM-T載體，所述的連接體系為:T4DNA連接酶1U，擴(kuò)增片段與載體摩爾濃度比為4-9:1，用雙蒸水補(bǔ)足10 μ L ;連接條件為16 °C連接過(guò)夜。
[0022]進(jìn)一步的，所述的連接有特異性片段的pGM-T經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，經(jīng)抗生素篩選獲得陽(yáng)性克隆，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證連接片段的正確性。
[0023]所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 X buffer5 μ I，25mmol/L Mg2+6.0 μ I，2.5mmol/L dNTP, 4.0 μ 1,10 μ mol/L 的兩種病毒的上下游引物(10 μ mol/L)均 1.0 μ I,兩種病毒通用TaqMan探針(10 μ mol/L)為0.5 μ 1，Taq酶1.0U，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒5.0 μ 1，加去離子水至50.0μ1。PCR反應(yīng)條件為:94°C C5min，94°C 15s、60°C 45s，共40循環(huán)。實(shí)驗(yàn)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖2a和圖2b。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn):1)可同時(shí)檢測(cè)待測(cè)樣品中的人星狀病毒和諾如病毒，并檢測(cè)其感染量，真實(shí)反映出樣本內(nèi)的病原體類型、拷貝數(shù)高低以及復(fù)制情況；2)與現(xiàn)有技術(shù)中的ELISA等檢測(cè)方法相比，本申請(qǐng)所述的方法具有更高的靈敏性，適用于大便、肛試子等多種樣本的檢測(cè)；3)針對(duì)病毒的特異性引物以及探針，具有更高的特異性，避免了與其他病原體如輪狀病毒、人腺病毒等交叉反應(yīng)；4)將PCR的敏感性以及探針的特異性結(jié)合，縮短了反應(yīng)時(shí)間、簡(jiǎn)化了操作步驟、提高了檢測(cè)效率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1PCR擴(kuò)增得到的星狀病毒和諾如病毒的特異性片段，其中a為星狀病毒，b為諾如病毒，M代表marker，水代表陰性對(duì)照。
[0026]圖2連接有人星狀病毒以及諾如病毒的特異性擴(kuò)增片段的質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，a為星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線，b為諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線，每張圖中從左至右分別為從左至右曲線分別為IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1, 10°拷貝質(zhì)粒。
[0027]圖3實(shí)際樣本的RT-PCR檢測(cè)，其中普通凝膠電泳圖為待測(cè)樣本的特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳，M代表marker，中間泳道為星狀病毒，右邊泳道為諾如病毒；溶解曲線圖代表待測(cè)樣本的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)重復(fù)，左邊為星狀病毒擴(kuò)增結(jié)果，右邊為諾如病毒擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028]為便于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明，現(xiàn)通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不囿于以下實(shí)施例，凡是本領(lǐng)域常規(guī)選用的方式，可適用于以下方法的技術(shù)手段均落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0029]實(shí)施例1引物、探針的設(shè)計(jì)
[0030]發(fā)明人在GenBank中所有的現(xiàn)有的星狀病毒和諾如病毒的基因序列進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析，選擇無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，分別找出了星狀病毒和諾如病毒的特異性保守區(qū)，并真對(duì)這些保守區(qū)域設(shè)計(jì)了引物及探針，其序列如下:
[0031]擴(kuò)增星狀病毒的上游引物為AstV-F5’-CCATGCAGGGTTTCACTTCT-3’，擴(kuò)增星狀病毒的下游引物為 AstV-R5’ -GATGGCATACACATCAGCTT-3’ ；
[0032]擴(kuò)增諾如病毒的引物為NoV-F5’ -TAAGAGGGACCTCCAATGGC-3’，擴(kuò)增諾如病毒的下游引物為 NoV-R5’ -GAATGGCCAAACTGTGTCAT-3’。[0033]同時(shí)可以特異性結(jié)合上述引物對(duì)擴(kuò)增得到的特異性片段的探針序列為:
[0034]FLU0-5，-TTTCAMCCWTYTGAGGSCCCTGCCCCMAT-TAMRA-3，-QUEN，其中，F(xiàn)LUO 代表熒光報(bào)告基團(tuán)，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)可以選自本領(lǐng)域常規(guī)選用的熒光基團(tuán)，優(yōu)選的為FAM, TET, JOE, HEX, VIC,更優(yōu)選的為FAM，TET,最優(yōu)選的為FAM ；QUEN代表熒光淬滅基團(tuán)，所述的熒光淬滅基團(tuán)可以選自本領(lǐng)域常規(guī)選擇的淬滅基團(tuán)，優(yōu)選的為TAMRA，DABCYL, BHQ，更優(yōu)選的為TAMRA，BHQ，最優(yōu)選為TAMRA。所述探針的序列中，M、W、Y、S為通用堿基，其中代表A或C，W代表A或T，S代表G或C，Y代表C或T。
[0035]實(shí)施例2樣本核酸提取
[0036]采用大連寶生物工程有限公司的TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0提取試劑盒。取待測(cè)樣本即選取2013年I月至2013年12月長(zhǎng)興縣人民醫(yī)院收治的腹瀉患兒的糞便標(biāo)本糞便標(biāo)本用生理鹽水制成混懸液，2000rpm離心后，取上清凍存于_80°C。對(duì)糞便標(biāo)本中病毒核酸的提取采用大連寶生物工程有限公司的TaKaRa MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0提取試劑盒提取樣本中的RNA,具體操作步驟，參照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。
[0037]實(shí)施例3糞便核酸樣本逆轉(zhuǎn)錄
[0038]逆轉(zhuǎn)錄采用大連寶生物PrimeScript?RT-PCR Kit,具體操作步驟，參照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，其中反應(yīng)體系為dNTP Mixturel μ L, random6mersl μ L,幾便樣本5 μ L, RNaseFree dH20 補(bǔ)足 至 10 μ L, 65 V 變性 5min 后，加入 5 X PrimeScript Buffer4 μ L、RNaseinhibitor0.5 μ L、PrimeScript RTase0.5 μ L、RNase Free dH20 補(bǔ)足至 20 μ L。所述的反應(yīng)條件為 42°C 45min,85°C 5min。
[0039]實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得
[0040]采用如下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增:cDNA樣本0.5 μ L，Taq DNA聚合酶2U/反應(yīng)，上下游引物為 I μ L (0.5 μ mol/L), dNTPs0.2mmol/Ll μ L, 10XPCR Mix2 μ L,余量用雙蒸水補(bǔ)齊20 μ L ;所述的 PCR 反應(yīng)條件為 94°C 5min,94°C 15sec，61°C 30sec，72°C 30sec，共 35 個(gè)循環(huán)，所述的PCR結(jié)果見(jiàn)圖la，圖lb。
[0041]所述的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆連接入pGM-T載體，所述的連接體系為:T4DNA連接酶1U,擴(kuò)增片段與載體摩爾濃度比為4-9:1，用雙蒸水補(bǔ)足10 μ L ;連接條件為16°C連接過(guò)夜。
[0042]將連接后的產(chǎn)物加入200 μ I制備好的感受態(tài)大腸桿菌DH5 α中，冰浴30分鐘后42°C熱激90秒后冰浴3分鐘；加入800μ I LB液體培養(yǎng)基，37 °C，150轉(zhuǎn)/分鐘搖菌I個(gè)小時(shí)后取1000 μ I菌液低速離心去700ul上清后剩余300ul菌液均勻涂布于氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)板上。倒置平板，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)12_16h，每個(gè)轉(zhuǎn)化平板分別挑取5個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證擴(kuò)增片段的序列正確性。
[0043]所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 X buffer5 μ I，25mmol/L Mg2+6.0 μ I，
2.5mmol/L dNTP, 4.0 μ 1,10 μ mol/L 的兩種病毒的上下游引物(10 μ mol/L)均 1.0 μ I,兩種病毒通用TaqMan探針(10 μ mol/L)為0.5 μ 1，Taq酶1.0U，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒5.0 μ 1，加去離子水至50.0μ1。PCR反應(yīng)條件為:94°C C5min，94°C 15s、60°C 45s，共40循環(huán)。實(shí)驗(yàn)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖2a和圖2b。
[0044]實(shí)施例5待測(cè)樣本的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
[0045]選取了各感染人星狀病毒和諾如病毒的糞便標(biāo)本各一份兒，按照實(shí)施例2所述的方法提取核酸，并按照實(shí)施例3所述的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA樣本。
[0046]使用實(shí)施例4所述的體系體系檢測(cè)了星狀病毒和諾如病毒陽(yáng)性糞便標(biāo)本各一例，每個(gè)樣本的逆轉(zhuǎn)錄cDNA樣本重復(fù)三次，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0047]實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物以及通用探針可以同時(shí)靈敏、特異性的檢測(cè)得到待測(cè)樣本中的人星狀病毒和諾如病毒，并且通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比，可以判斷待測(cè)樣本中的病毒的拷貝數(shù)。由此可見(jiàn)，本申請(qǐng)所述的探針、引物以及方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，取得了本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)料不 到的技術(shù)效果。
【權(quán)利要求】
1.一種利用RT-PCR方法檢測(cè)星狀病毒(Astrovirus)和諾如病毒(Norovirus)的通用探針，其序列為 FAM-1TTCAMCCWTYTGAGGSCCCTGCCCCMAT-TAMRA，其中 M、W、Y、S 為通用堿基，其中代表A或C，W代表A或T，S代表G或C，Y代表C或T。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中FLUO代表熒光報(bào)告基團(tuán)，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)選自本領(lǐng)域常規(guī)選用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，優(yōu)選的為FAM，TET, JOE, HEX, VIC，更優(yōu)選的為FAM，TET，其中最優(yōu)選的為FAM ;QUEN代表熒光淬滅基團(tuán)，所述的熒光淬滅基團(tuán)可以選自本領(lǐng)域常規(guī)選擇的淬滅基團(tuán)，優(yōu)選的為TAMRA，DABCYL, BHQ,更優(yōu)選的為TAMRA，BHQ,最優(yōu)選為TAMRA。
3.—種擴(kuò)增人星狀病毒的引物對(duì)，所述的引物的序列為上游引物為AstV-F5’ -CCATGCAGGGTTTCACTTCT-3’，下游引物為 AstV_R5’ -GATGGCATACACATCAGCTT-3’。
4.一種擴(kuò)增諾如病毒的引物對(duì)，所述的引物的序列為上游引物為NoV-F5’ -TAAGAGGGACCTCCAATGGC-3’，下游引物為 NoV_R5’ -GAATGGCCAAACTGTGTCAT-3’。
5.一種檢測(cè)星狀病毒和諾如病毒的試劑盒，所述的試劑盒包括權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的通用探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，所述的試劑盒還包括權(quán)利要求3和4所述的引物對(duì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其中還包括所述的試劑盒包括RT-PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控液，人星狀病毒和諾如病毒的陽(yáng)性質(zhì)控品。
8.一種非診斷性的檢測(cè)人星狀病毒和諾如病毒的方法，所述的方法包括如下步驟: 1)提取待測(cè)樣本中的RNA； 2)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板； 3)利用權(quán)利要求3和4所述的引物對(duì)擴(kuò)增cDNA模板，獲得特異性片段； 4)將步驟3)所得的特異性片段連接入T載體，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗生素篩選、測(cè)序獲得正確連接的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒； 5)利用權(quán)利要求1或2所述的探針以及權(quán)利要求3和4所述的引物利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)步驟4)制備的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中設(shè)置IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1, 10。濃度梯度； 6)選取待測(cè)樣本，利用步驟5)所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)，每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)重復(fù)； 7)對(duì)比待測(cè)樣本的溶解曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)樣板中人星狀病毒和諾如病毒的拷貝數(shù)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104017905SQ201410291136
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】施前鋒 申請(qǐng)人:長(zhǎng)興縣人民醫(yī)院