一種融合抗菌肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種融合抗菌肽及其制備方法。本發(fā)明將豬抗菌肽(PAMP37)和牛的抗菌肽(Indolicidin)串聯(lián)構(gòu)建了一種融合抗菌肽。并且利用大腸桿菌密碼子的偏愛性，設(shè)計(jì)了所述融合抗菌肽的DNA序列，并將其構(gòu)建到表達(dá)載體中，隨后進(jìn)行了融合抗菌肽的表達(dá)及純化，抗菌活性結(jié)果顯示，所得到的融合抗菌肽抗菌活性大大提高。本發(fā)明為新型抗菌免疫制劑的研制提供了優(yōu)良的候選肽，對有效替代或減少抗生素作為飼料添加劑的使用、提高畜產(chǎn)品安全性具有重要意義。
【專利說明】一種融合抗菌肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中基因工程生產(chǎn)藥物的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種融合抗菌肽及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]飼糧中長期或高劑量添加抗生素導(dǎo)致抗生素在畜產(chǎn)品中殘留，引起食品安全隱患，還會(huì)誘導(dǎo)耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生，使動(dòng)物體內(nèi)腸道菌群紊亂，動(dòng)物自身免疫功能下降，抵抗力降低等。
[0003]抗菌妝(AntibacterialPeptides),又叫抗微生物妝(Antimicrobial Peptides)或宿主防御肽(Host Defense Peptides),是機(jī)體先天免疫的重要組成成分,是許多生物體抵抗外來致病菌侵襲的第一道屏障。由于其獨(dú)特且多樣的生物學(xué)功能和作用機(jī)制引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注和研究，一方面研究抗菌肽在先天免疫中發(fā)揮作用的生物學(xué)基礎(chǔ)，一方面將其作為設(shè)計(jì)新型抗菌、抗感染制劑的分子模板。抗菌肽是自然進(jìn)化的產(chǎn)物，和微生物一起已經(jīng)存在了億萬年，盡管經(jīng)過長期的共同進(jìn)化，但抗菌肽并沒有丟失其殺滅或抑制微生物的能力，或產(chǎn)生使微生物逃逸抗菌肽的能力，所以說抗菌肽是研發(fā)新型高效抗生素替代品的重要突破。
[0004]螺旋抗菌肽是分布最廣泛的抗菌肽，大概占所有已知二級結(jié)構(gòu)抗菌肽的27%。當(dāng)形成α螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)通常親水性殘基和疏水性殘基分別位于螺旋的兩側(cè)，因此呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)依賴性的兩親結(jié)構(gòu)。螺旋抗菌肽在水相中一般不具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，但在富含脂類的細(xì)胞膜環(huán)境下形成典型的α螺旋結(jié)構(gòu)。在C端和N端的“帽子”結(jié)構(gòu)使得α螺旋抗菌肽更加穩(wěn)定，且不易受電解質(zhì)濃度的影響。此類抗菌肽主要通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)揮殺菌作用，導(dǎo)致膜上電解質(zhì)或其他信號物質(zhì)的逐級降解等。
[0005]抗菌肽市場應(yīng)用廣泛:在農(nóng)業(yè)上，可用于飼料添加劑，并且適合各種動(dòng)物的飼養(yǎng)；醫(yī)藥上，可以作為優(yōu)秀的抗菌素替代品，也被認(rèn)為是將來能克服癌癥、艾滋病很有希望的藥物；工業(yè)上，可以作為綠色防腐劑；人類生活上，可作為保健品與抗菌物的替代品。并且，隨著生物工程方法的不斷完善，抗菌肽的提取工藝的改進(jìn)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，使用工程細(xì)菌或酵母菌進(jìn)行抗菌肽的大量生產(chǎn)，抗菌肽的實(shí)際應(yīng)用范圍將進(jìn)一步擴(kuò)大，在人們的日常生活中發(fā)揮著十分重要的作用。
[0006]然而，現(xiàn)有的研究表明，許多天然的抗菌肽活性并不高，或者對真核細(xì)胞存在較高的細(xì)胞毒性，因此在作為新型抗生素替代品研制之前需要通過分子改良進(jìn)一步提高其活性，或降低其毒性。此外，細(xì)菌感染已經(jīng)成為影響畜牧業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要原因，尤其是耐藥菌株的出現(xiàn)，更是增加了疾病的治療難度。因此，在目前抗菌肽的研究中迫切需要改造已有抗菌肽和設(shè)計(jì)新抗菌肽分子用以創(chuàng)造高活力抗菌肽。
[0007]本發(fā)明創(chuàng)造性的將豬的抗菌肽和牛中性粒細(xì)胞的抗菌肽進(jìn)行了融合。豬的ΡΑΜΡ37是含有37個(gè)氨基酸殘基的抗菌多肽，不含半胱氨酸，其N端區(qū)域具有強(qiáng)堿性，可形成α螺旋結(jié)構(gòu)，利用該結(jié)構(gòu)可以在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成穿孔，因此對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有顯著殺傷作用。indolicidin是來源于牛中性粒細(xì)胞的抗菌多肽，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有很強(qiáng)的殺菌活性。其氨基酸序列為包含含有5個(gè)色氨酸的13個(gè)氨基酸的多肽，其C端是酰胺化的。抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，融合的抗菌肽較單獨(dú)的抗菌肽抗菌活性顯著提高。
[0008]本研究通過分子改良進(jìn)一步獲得高抗菌活性的融合抗菌肽，為新型抗菌免疫制劑的研制提供了優(yōu)良的候選肽，這對研發(fā)新型抗菌免疫制劑，有效替代或減少抗生素作為飼料添加劑的使用、提高畜產(chǎn)品安全性具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種高抗菌活性的融合抗菌肽。所述融合抗菌肽包含豬抗菌肽和牛抗菌肽。
[0010]進(jìn)一步的,所述融合抗菌肽包含豬抗菌肽PAMP37和牛抗菌肽(Indolicidin)。
[0011]更進(jìn)一步的,所述融合抗菌肽是將豬抗菌肽(PAMP37)和?？咕?Indolicidin)串聯(lián)一起得到的。
[0012]更近一步的，所述融合抗菌肽氨基酸序列為序列表中SEQ IDl0
[0013]本發(fā)明的目的是提供一種融合抗菌肽的重組DNA，所述的重組DNA是經(jīng)過密碼子優(yōu)化、適合在大腸桿菌表達(dá)融合抗菌肽。
[0014]進(jìn)一步的，所述融合抗菌肽的重組DNA序列為序列表中SEQ ID2。
[0015]本發(fā)明的目的是提供一種能夠表達(dá)上述融合抗菌肽的載體。優(yōu)選使用pET30a載體表達(dá)上述融合抗菌肽。
[0016]本發(fā)明的目的是提供一種能夠表達(dá)上述融合抗菌肽的細(xì)胞系。優(yōu)選使用大腸桿菌BL21表達(dá)上述融合抗菌肽。
[0017]本發(fā)明的目的是提供一種新型抗菌免疫制劑，所述的抗菌免疫制劑中含有上述的融合抗菌肽。
[0018]本發(fā)明的目的是提供一種高抗菌活性的融合抗菌肽的制備方法。
[0019]進(jìn)一步的，所述融合抗菌肽的制備方法包括:
[0020]5)將包含豬抗菌肽和?？咕牡亩嚯拇?lián)，得到的融合抗菌肽的氨基酸序；
[0021]6)根據(jù)密碼子的偏愛性，設(shè)計(jì)融合抗菌肽的重組DNA序列；
[0022]7)將重組DNA序列構(gòu)建到表達(dá)載體上；
[0023]8)將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行融合抗菌肽的表達(dá)。
[0024]更進(jìn)一步的，所述豬抗菌肽為PAMP37，所述牛抗菌肽為Indolicidin。
[0025]更進(jìn)一步的，設(shè)計(jì)的融合抗菌肽可通過合成或多重PCR等方法獲得。優(yōu)選進(jìn)行多重PCR引物所采用的序列選自序列表中SEQ ID4、SEQ ID5、SEQ ID6、SEQ ID7中的一條或幾條。
[0026]更進(jìn)一步的，將重組DNA通過酶切鏈接或同源重組等方式連接到表達(dá)載體上。
[0027]更進(jìn)一步的，對表達(dá)的融合抗菌肽進(jìn)行純化。
[0028]本發(fā)明的目的是提供融合抗菌肽、能夠表達(dá)融合抗菌肽的載體以及含有融合抗菌肽的抗菌免疫制劑在制備飼料添加劑、抗菌藥物制劑、保健品、防腐劑中的應(yīng)用。
[0029]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):[0030]I)本發(fā)明創(chuàng)造性的將豬抗菌肽PAMP37和牛的抗菌肽(Indolicidin)進(jìn)行多肽串聯(lián)，獲得了具有高抗菌活性的融合抗菌肽，所述融合抗菌肽為新型抗菌免疫制劑的研制提供了優(yōu)良的候選肽，這對研發(fā)新型抗菌免疫制劑，有效替代或減少抗生素作為飼料添加劑的使用、提高畜產(chǎn)品安全性具有重要意義；
[0031]2)本發(fā)明提供一種高抗菌活性的融合抗菌肽的制備方法，采用該制備方法可以高效獲得融合抗菌肽。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實(shí)施檢測。
[0034]實(shí)施例1抗菌肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和預(yù)測
[0035]為了增強(qiáng)抗菌肽的殺菌活性，將豬抗菌肽(PAMP37)和牛的抗菌肽(Indolicidin)串聯(lián)一起進(jìn)行構(gòu)建，得到的融合多肽的氨基酸序列為SEQ IDl:GLLSRLRDFLSDRGRRLGEKIERIGQKIKDLSEFFQSILPffKffPffffPffffRR。
[0036]利用大腸桿菌密碼子的偏愛性，設(shè)計(jì)了該序列的重組DNA序列(SEQ ID2)，經(jīng)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測得到該多肽N端為一個(gè)α螺旋，C端為線性結(jié)構(gòu)。
[0037]實(shí)施例2抗菌肽表達(dá)載體的構(gòu)建
[0038]I)優(yōu)化DNA序列使其適應(yīng)于大腸桿菌的密碼子偏愛性，增加載體構(gòu)建所用的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)融合多肽DNA序列(SEQ ID3)如下:
[0039]GGTACO GACGACGACGACAAGGCCGGTCTGCTGTCTCGTCTGCGTGACTTCCTGTCTGACCGTGGTCGTCGTCTGGGTGAAAAAATCGAACGTATCGGTCAGAAAATCAAAGACCTGTCTGAATTCTTCCAGTCTATCCTGCCGTGGA A ATGGCCGTGGTGGCCGTGGTGGCGTCGTT A A CTCGAG
[0040]黑色下劃線的序列為酶切位點(diǎn)(KpnI和XhoI)。
[0041 ] 將DNA序列分別合成多條引物，利用重疊PCR的方法，將多條引物擴(kuò)增拼接成完整的DNA序列。合成的引物序列見表1:
[0042]表1.合成引物的具體序列
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種融合抗菌肽，包含豬抗菌肽和?？咕?。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合抗菌肽，其特征在于，所述豬抗菌肽為PAMP37，所述?？咕鷬y為 Indolicidin0
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合抗菌肽，其特征在于，所述融合抗菌肽由豬抗菌肽和?？咕拇?lián)一起得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的融合抗菌肽，其特征在于，所述融合抗菌肽氨基酸序列為序列表中SEQ IDl。
5.一種融合抗菌肽的重組DNA，其特征在于，所述的重組DNA表達(dá)后得到權(quán)利要求1_4任意一項(xiàng)所述的融合抗菌肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組DNA，其特征在于，所述重組DNA序列為序列表中SEQID2。
7.—種載體,其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求5-6任意一項(xiàng)所述的重組DNA或者表達(dá)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的融合抗菌肽。
8.一種抗菌免疫制劑，所述的抗菌免疫制劑中含有權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的融合抗菌肽。
9.一種融合抗菌肽的制備方法，所述的制備方法包括: 1)將包含豬抗菌肽和牛抗菌肽的多肽串聯(lián)，得到的融合抗菌肽的氨基酸序； 2)根據(jù)密碼子的偏愛性，設(shè)計(jì)融合抗菌肽的重組DNA序列； 3)將重組DNA序列構(gòu)建到表達(dá)載體上； 4)將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行融合抗菌肽的表達(dá)。
10.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的融合抗菌肽、權(quán)利要求7所述的載體以及權(quán)利要求8所述的抗菌免疫制劑在制備飼料添加劑、抗菌藥物制劑、保健品、防腐劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/63GK104017086SQ201410284681
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】任建廷 申請人:任建廷