一種構(gòu)建高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸大腸桿菌工程菌株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種構(gòu)建高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸大腸桿菌工程菌株的方法，屬于代謝工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域。本發(fā)明在使用載體pACYCDuet-1過量表達(dá)5-氨基乙酰丙酸C5合成途徑關(guān)鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨醛氨基轉(zhuǎn)移酶的基礎(chǔ)上，將來源于大腸桿菌血紅素生物合成途徑中的尿卟啉原III合酶(uroporphyrinogen?III?synthase,UROS,hemD編碼)及糞卟啉原III氧化酶(coproporphyrinogen?III?oxidase,CPO,hemF編碼)，使用pCDFDuet-1單獨(dú)表達(dá)或共表達(dá)兩個酶基因，構(gòu)建重組菌株。通過發(fā)酵驗(yàn)證，單獨(dú)表達(dá)hemD或hemF以及共表達(dá)hemD和hemF，ALA產(chǎn)量均明顯提高。
【專利說明】一種構(gòu)建高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸大腸桿菌工程菌株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種構(gòu)建高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸大腸桿菌工程菌株的方法，屬于代謝工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]5_ 氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA),分子式為 C5O3NH9,分子量為131.13,熔點(diǎn)為149-151°C,它是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素B12等的關(guān)鍵前體物質(zhì)。ALA作為一種安全、選擇、滲透性好的光動力學(xué)藥物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸受到重視，已經(jīng)成功應(yīng)用于皮膚癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的診斷和光動力治療中。另外，ALA作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光活化農(nóng)藥，在農(nóng)藥領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，如作為一種無公害的綠色農(nóng)藥、除草劑以及植物生長調(diào)節(jié)劑等。
[0003]目前，ALA合成主要采用化學(xué)法合成，最早出現(xiàn)在上世紀(jì)50年代，直到20世紀(jì)90年代，相關(guān)研究才大量開展，并取得了一定的成績。但是由于化學(xué)合成反應(yīng)步驟繁瑣，副產(chǎn)物多，分離提純困難，ALA的得率也較低，并且環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，近年來，微生物發(fā)酵生產(chǎn)ALA已成為研究的熱點(diǎn)。自然界中，ALA的生物合成存在兩條途徑，一條是C4途徑，由
5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA編碼)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反應(yīng)組成，主要存在于一些光合細(xì)菌、真菌以及動物體內(nèi)。另外一條是C5途徑，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX編碼)催化下，生成谷氨酰_tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酸-tRNA還原酶(GluTR, hemA編碼)作用下生成谷氨酸-1-半醒(GSA),最后GSA由谷氨酸-1-半醛_2，1-氨基轉(zhuǎn)移酶(GSA-AM，hemL編碼)催化生成ALA。該途徑廣泛存在于植物、藻類以及細(xì)菌(如大腸桿菌)中。
[0004]早期，人們篩選到產(chǎn)ALA的光合細(xì)菌類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides),通過誘變育種法對其進(jìn)行誘變，篩選ALA的高產(chǎn)菌株，并通過發(fā)酵優(yōu)化等使得ALA的產(chǎn)量達(dá)到
7.2g/L。但由于光合細(xì)菌的特殊性，其成本較高，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。目前以C4途徑為基礎(chǔ)的生物轉(zhuǎn)化由于添加前體琥珀酸和甘氨酸生產(chǎn)ALA成本相對較高。
[0005]本發(fā)明在系統(tǒng)闡述分析大腸桿菌中C5途徑(圖1)調(diào)控機(jī)制，及表達(dá)5-氨基乙酰丙酸C5合成途徑關(guān)鍵酶基因hemL和hemA基礎(chǔ)上，進(jìn)一步表達(dá)來源于大腸桿菌血紅素生物合成途徑基因hemD及hemF，實(shí)現(xiàn)了 ALA產(chǎn)量的進(jìn)一步提高，且發(fā)酵周期明顯縮短，降低了生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌株，其在表達(dá)C5途徑關(guān)鍵基因hemL(編碼谷氨醛氨基轉(zhuǎn)移酶)和hemA(編碼谷氨酰-tRNA還原酶)的基礎(chǔ)上，共表達(dá)來源于大腸桿菌的尿卟啉原III合酶(hemD編碼)和/或糞卟啉原III氧化酶(hemF編碼)。
[0007]所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0008]所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0011]所述大腸桿菌優(yōu)選DH5a、JM109、W3110 或 BL21 (DE3)。
[0012]所述大腸桿菌進(jìn)一步優(yōu)選BL21 (DE3)。
[0013]所述hemL與hemA優(yōu)選以pACY⑶uet_l表達(dá)載體進(jìn)行共表達(dá)，得到表達(dá)載體PACYCDu e t-1_hemLA。
[0014]表達(dá)hemD或hemF時，優(yōu)選將hemD或hemF基因分別通過酶切位點(diǎn)Nde1、XhoI連接 pCDFDuet-1,得到重組表達(dá)載體 pCDFDuet-1-hemD 或 pCDFDuet-1-hemF。
[0015]表達(dá)hemD和hemF時，可以共用一個表達(dá)載體。優(yōu)選將hemD與pCDFDuet-1-hemF連接。進(jìn)一步優(yōu)選通過酶切位點(diǎn)BamHI和PstI與p⑶FDuet-1-hemF連接,得到重組表達(dá)載體 pCDFDuet-1-hemD-hemF。
[0016]本發(fā)明還提供一種構(gòu)建所述大腸桿菌工程菌株的方法，利用pACY⑶uet-Ι表達(dá)hemL和hemA，以pCDFDuet-Ι表達(dá)來源于大腸桿菌的尿卟啉原III合酶(hemD編碼)和/或糞卟啉原III氧化酶(hemF編碼)，獲得高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌株。
[0017]具體包括以下步 驟:
[0018]將來源于大腸桿菌的基因hemL與來源于傷寒沙門氏菌的基因hemA通過擴(kuò)增利用酶切位點(diǎn)BamHI和PstI連接表達(dá)載體pACYCDuet-1，獲得hemL與hemA基因的共表達(dá)載體pACY⑶uet-1-hemLA。將來源于大腸桿菌的hemD和hemF基因通過擴(kuò)增利用酶切位點(diǎn)NdeI和XhoI連接表達(dá)載體pCDFDuet-Ι中，分別得到載體pCDFDuet-1-hemD和pCDFDuet-1-hemF。同時將hemD基因與經(jīng)BamHI和PstI雙酶切的質(zhì)粒pCDFDuet-hemF連接，得到質(zhì)粒 pCDFDuet-1-hemD-hemF。
[0019]將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-hemLA 與 pCDFDuet-1-hemD 共轉(zhuǎn)化 Ε.coliBL21 (DE3)，獲得重組菌 LAD ;將構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pACYCDuet-1-hemLA 與 pCDFDuet-1-hemF共轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)，獲得重組菌LAF ;將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-hemLA與pCDFDuet-hemD-hemF 共轉(zhuǎn)化 E.coli BL21 (DE3)，獲得重組菌 LADF。
[0020]本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是應(yīng)用所述大腸桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)ALA。
[0021 ] 所述大腸桿菌工程菌優(yōu)選:
[0022]LAD:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD 或
[0023]LAF:Ε.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemF 或
[0024]LADF:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD-hemF。
[0025]所述發(fā)酵生產(chǎn)ALA涉及的培養(yǎng)基優(yōu)選:
[0026]斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5.0，瓊脂20，pH7.0 ；
[0027]種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5.0，ρΗ7.0，裝液量20mL/250mL ；
[0028]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2S0415, ΚΗ2Ρ045.0, Na2HPO4.12H2015, MgSO4.7Η201.0，酵母提取物(Yeast extract) 1.0,葡萄糖 20, pH7.0。
[0029]所述發(fā)酵生產(chǎn)ALA的培養(yǎng)條件優(yōu)選:
[0030]菌種培養(yǎng):甘油管劃線，然后挑取單菌落劃線平板37°C培養(yǎng)，作為種子來源；
[0031]種子培養(yǎng):平板挑取菌體，37°C，200r/min，根據(jù)要求添加氯霉素34μ g/mL，鏈霉素100 μ g/mL，培養(yǎng)約12h，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0032]發(fā)酵培養(yǎng):以2%接種量轉(zhuǎn)接，Oh時添加0.1-0.5mMIPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)，根據(jù)需要添加氯霉素(34 μ g/mL)以及鏈霉素(100 μ g/mL)，30-37°C，200r/min 培養(yǎng)，周期 28_36h。
[0033]本發(fā)明在表達(dá)C5途徑關(guān)鍵基因hemL和hemA的基礎(chǔ)上，共表達(dá)ALA代謝途徑的下游基因hemD和/或hemF，取得了意料不到的技術(shù)效果:所得大腸桿菌工程菌株LADF在3L發(fā)酵罐中能夠積累5-氨基乙酰丙酸1800mg/L，有效地利用C5途徑促進(jìn)5-氨基乙酰丙酸的合成，從而實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵法直接發(fā)酵葡萄糖合成5-氨基乙酰丙酸，縮短發(fā)酵周期、降低生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1:大腸桿菌中ALA C5合成途徑。
[0035]圖2:重組質(zhì)粒構(gòu)建酶切電泳圖；M:DL 5000Marker ；A:pACYCDuet-hemLA ；B:pCDFDuet-hemD ；C:pCDFDuet_hemF ;D，E:pCDFDuet-hemD_hemF。
[0036]圖3:重組菌搖瓶發(fā)酵 ALA 產(chǎn)量；LA:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLApCDFDuet-1 ；LAD:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemD ；LAF:E.coliBL21(DE3)pACYCDuet-hemLA pCDFDuet-hemF ；LADF:E.coli BL21(DE3)pACYCDuet-hemLApCDFDuet-hemD-hemF。
[0037]圖4:重組菌 LADF 發(fā)酵過程曲線圖；LADF:E.coli BL21 (DE3)pACYCDuet-hemLApCDFDuet-hemD-hemF。
【具體實(shí)施方式】
[0038]ALA分析方法:采用Mauzerall和Granick的分光光度法:將樣品稀釋至2mL,加入ImL的乙酸鹽緩沖液,0.5mL的乙酰丙酮,然后煮沸15min。冷卻至室溫,取2mL的反應(yīng)液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s試劑,反應(yīng)20min,利用分光光度計554nm下檢測。
[0039]培養(yǎng)基:
[0040]斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5.0，瓊脂20，ρΗ7.0 ；
[0041]種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5.0，ρΗ7.0，裝液量20mL/250mL ；
[0042]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2S0415, ΚΗ2Ρ045.0, Na2HPO4.12H2015, MgSO4.7Η201.0,Yeast extractl.0，Glucose20，ρΗ7.0。
[0043]培養(yǎng)條件:
[0044]菌種培養(yǎng):甘油管劃線，然后挑取單菌落劃線平板37°C培養(yǎng)，作為種子來源；
[0045]種子培養(yǎng):平板挑取菌體，37°C，200r/min，根據(jù)要求添加氯霉素34μ g/mL，鏈霉素100 μ g/mL，培養(yǎng)約12h，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0046]發(fā)酵培養(yǎng):以2%接種量轉(zhuǎn)接，Oh時添加0.1-0.5mM IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)，根據(jù)需要添加氯霉素(34 μ g/mL)以及鏈霉素(100 μ g/mL)，30-37 V，200r/min 培養(yǎng)，周期 28_36h。
[0047]實(shí)施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[0048](I)重組質(zhì)粒 pACYCDuet-1-hemLA, pCDFDuet-1-hemD, pCDFDuet-1-hemF,及pCDFDuet-1-hemD-hemF 的構(gòu)建
[0049]以大腸桿菌基因組為模板獲取hemL, hemD,以及hemF, hemA來源于傷寒沙門氏菌[0050] 引物如下(下劃線部分為酶切位點(diǎn))
【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，在表達(dá)C5途徑基因hemL和hemA的基礎(chǔ)上，共表達(dá)編碼尿卟啉原III合酶的基因hemD和/或糞卟啉原III氧化酶的基因hemF。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，hemA的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID N0.3 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID N0.4 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，以大腸桿菌DH5α、JM109、W3110 或 BL21(DE3)為表達(dá)宿主。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述hemL與hemA以pACY⑶uet-Ι為表達(dá)載體進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，得到表達(dá)載體pACY⑶uet-1-hemLA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，單獨(dú)或串聯(lián)表達(dá)hemD和hemF時，所用表達(dá)載體是pUC18、pUC19、pCL1920、pCDFDuet-1或pET系列質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，以pCDFDuet-1為表達(dá)載體。
9.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述大腸桿菌工程菌株的方法，利用pACY⑶uet-Ι表達(dá)hemL和hemA，以P⑶FDuet-1表達(dá)編碼尿卟啉原III合酶的基因hemD和/或糞卟啉原III氧化酶的基因hemF，轉(zhuǎn)化篩選獲得高產(chǎn)5_氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌株Escherichiacoli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-hemL-hemA pCDFDuet-1-hemD-hemF 或 Escherichia coliBL21 (DE3)/pACYCDuet-1-hemL-hemA pCDFDuet-1-hemD 或 Escherichia coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-hemL-hemA pCDFDuet-1-hemF。
10.應(yīng)用權(quán)利要求1-4任一所述大腸桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)ALA的方法，其特征在于，將工程菌株活化后，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，30-37°C，200r/min培養(yǎng)，發(fā)酵周期28_36h。
【文檔編號】C12P13/00GK104004701SQ201410274445
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】陳堅, 康振, 堵國成, 張俊麗 申請人:江南大學(xué)