一種小核糖核酸的電化學(xué)檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于微量微小RNA的電化學(xué)檢測(cè)方法，包括以下步驟：固定在電極表面報(bào)告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a；阻塞DNA與靶標(biāo)微小RNA分子結(jié)合，形成雙鏈b，使阻塞DNA從電極表面脫離；引物DNA與雙鏈b中阻塞DNA末端序列結(jié)合，自我復(fù)制形成DNA雙鏈c，并將靶標(biāo)微小RNA置換下來；被置換下來的靶標(biāo)微小RNA又重新回到工作電極表面，與其他的雙鏈a反應(yīng)，N次循環(huán)反應(yīng)后，電極表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的報(bào)告DNA也越來越多，進(jìn)而電化學(xué)信號(hào)也越來越強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子微小RNA的電化學(xué)檢測(cè)。同樣的原理還可推廣到DNA，siRNA的檢測(cè)中，應(yīng)用前景廣泛。
【專利說明】—種小核糖核酸的電化學(xué)檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及小核糖核酸檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種對(duì)痕量小核糖核酸的電化學(xué)單分子檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]microRNA (微小RNA)是一類長(zhǎng)度約為21~25個(gè)核苷酸的小分子RNA，通過與mRNA (信使RNA)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)microRNA普遍存在于多細(xì)胞生物中，而且數(shù)量可觀，約占整個(gè)基因組基因總數(shù)2%左右。microRNA在生物進(jìn)化過程中高度保守，并已被證實(shí)參與和調(diào)控了包括時(shí)序發(fā)育、細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞分化、激素分泌等在內(nèi)的多種生理過程，以及包括肺癌、白血病在內(nèi)的多種疾病發(fā)生過程。研發(fā)人員監(jiān)測(cè)大量已知microRNA在免疫反應(yīng)中表達(dá)的變化，從而發(fā)現(xiàn)其在生理病理狀態(tài)下的重要作用。除此之外研發(fā)人員還可以發(fā)現(xiàn)和鑒定出新的生物標(biāo)志物，從而達(dá)到監(jiān)測(cè)免疫細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和組織器官的分化的目的。由于miCToRNA細(xì)胞特異性以及“時(shí)空”特異性的特點(diǎn)，近年來其在干細(xì)胞定向分化和自我更新功能維持中的作用，逐漸被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)。通過監(jiān)測(cè)大量已知miCToRNA在免疫反應(yīng)中表達(dá)的變化，研發(fā)人員可以在較短的時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)新的干細(xì)胞分化的標(biāo)志microRNA ;此外通過對(duì)已知的microRNA標(biāo)志物表達(dá)量的檢測(cè)，可以達(dá)到對(duì)干細(xì)胞的多能性以及分化進(jìn)行監(jiān)測(cè)的目的。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)告，某些microRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。根據(jù)microRNA在人體中起到的調(diào)節(jié)蛋白生成的 殊作用，我們認(rèn)為其在未來臨床檢測(cè)應(yīng)用方面具有廣闊的前景。
[0003]現(xiàn)在常見的檢測(cè)祀標(biāo)microRNA的方法有深度測(cè)序(Deep Sequencing)基因芯片(Micro-Array)、實(shí)時(shí)突光定量 PCR(Real-time qPCR)等。
[0004]上述方法大多需要大型、較昂貴設(shè)備的支持，檢測(cè)成本較高，不適合常規(guī)的分析檢測(cè)，因此需要發(fā)展一種簡(jiǎn)單、成本低又靈敏的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)靶標(biāo)微小RNA的方法。本發(fā)明所述電化學(xué)單分子檢測(cè)方法是一種非常簡(jiǎn)便的分析方法，通過三電極系統(tǒng)中電信號(hào)的變化可以直接判斷出待測(cè)樣品中是否存在靶標(biāo)微小RNA，操作簡(jiǎn)單，抗干擾能力強(qiáng)，能快速、精確的實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)微小RNA的檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明提供一種靶標(biāo)微小RNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0007]步驟一固定在工作電極表面的報(bào)告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a，打開報(bào)告DNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；
[0008]步驟二靶標(biāo)microRNA與雙鏈a中的阻塞DNA結(jié)合，形成雙鏈b，使阻塞DNA從工作電極表面脫離，報(bào)告DNA自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；
[0009]步驟三引物DNA與雙鏈b中阻塞DNA末端序列結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成DNA雙鏈C，同時(shí)將靶標(biāo)microRNA置換下來；[0010]步驟四被置換下來的靶標(biāo)microRNA又重新回到工作電極表面，與其他的工作電極表面的雙鏈a發(fā)生反應(yīng)；
[0011]步驟五經(jīng)過上述N次循環(huán)反應(yīng)后，工作電極表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的報(bào)告DNA也越來越多，工作電極表面電信號(hào)會(huì)越來越強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子微小RNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)。
[0012]優(yōu)選的，所述報(bào)告DNA5'端帶有可以修飾到電極表面的基團(tuán)(如巰基，氨基等)，報(bào)告DNA3'端帶有電信號(hào)分子。
[0013]優(yōu)選的，所述阻塞DNA通過與報(bào)告DNA互補(bǔ)配對(duì)被固定與電極表面，
[0014]但不是直接連接與工作電極表面。
[0015]優(yōu)選的，所述阻塞DNA上有一段可以與靶標(biāo)微小RNA配對(duì)的堿基序列。
[0016]優(yōu)選的，靶標(biāo)microRNA是可以重復(fù)利用的。
[0017]優(yōu)選的,所述報(bào)告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a時(shí),報(bào)告DNA3'端電信號(hào)分子遠(yuǎn)離金電極表面，電信號(hào)減弱。
[0018]優(yōu)選的，所述報(bào)告DNA在單分子鏈狀態(tài)下形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)報(bào)告DNA3'端帶有電信號(hào)分子，靠近工作電極表面，增強(qiáng)電信號(hào)。
[0019]本發(fā)明提供一種靶標(biāo)microRNA的檢測(cè)方法，包括以下步驟:報(bào)告DNA與阻塞DNA形成雙鏈，雙鏈形成可在修飾到電極表面之前，亦可在報(bào)告DNA固定到電極表面之后；靶標(biāo)microRNA分子與阻塞DNA結(jié)合，形成雙鏈，并從電極表面脫離，報(bào)告DNA單鏈自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并使末端電信號(hào)分子靠近電極表面；之后引物DNA與阻塞DNA末端序列結(jié)合，并在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成雙鏈DNA，并將靶標(biāo)microRNA置換下來；被置換下來的靶標(biāo)microRNA又重新回到電極表面，與其他的報(bào)告-阻塞雙鏈作用，再結(jié)合引物，擴(kuò)增，置換，如此循環(huán)，電極表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的報(bào)告DNA也越來越多，進(jìn)而電信號(hào)也越來越強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量祀標(biāo)microRNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)。
[0020]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明所述電化學(xué)單分子檢測(cè)方法是一種非常簡(jiǎn)便的分析方法，通過三電極系統(tǒng)中電信號(hào)的變化可以直接判斷出待測(cè)樣品中是否存在靶標(biāo)microRNA,操作簡(jiǎn)單,抗干擾能力強(qiáng)，能快速、精確的實(shí)現(xiàn)對(duì)祀標(biāo)microRNA的檢測(cè),適于在臨床應(yīng)用，如肺癌、白血病、腫瘤等疾病的診斷。同樣的原理還可推廣到DNA，si RNA的檢測(cè)中，應(yīng)用前景廣泛。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明所述靶微小RNA的電化學(xué)檢測(cè)方法的技術(shù)流程圖。
[0022]圖2是應(yīng)用本發(fā)明所述微小RNA的電化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)的交流阻抗譜測(cè)試圖。
[0023]圖3是應(yīng)用本發(fā)明加入所述微小RNA反應(yīng)前后的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。
[0024]圖4是應(yīng)用本發(fā)明所述靶微小RNA的電化學(xué)檢測(cè)方法的一種靶微小RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明中涉及到的名詞:
[0026] 所述靶標(biāo)微小RNA:根據(jù)不同需要所要檢測(cè)的微小RNA種類。[0027]所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)包括三個(gè)部分:(I)環(huán)狀區(qū)，一般為長(zhǎng)度15~30堿基的序列，能與目標(biāo)分子特異結(jié)合；(2)莖干區(qū)，通常為長(zhǎng)度5~8堿基的互補(bǔ)序列，莖干區(qū)通過氫鍵共價(jià)連接形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；(3)帶電基團(tuán)，本發(fā)明所述報(bào)告DNA5'端帶有可以修飾到電極表面的基團(tuán)或分子(如巰基，氨基，生物素，抗生物素等)，報(bào)告DNA3,端帶有電信號(hào)分子。
[0028]所述引物DNA:是一小段單鏈DNA,作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn),在核酸合成反應(yīng)時(shí),作為每個(gè)多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3' -OH上，核苷酸以二酯鏈形式進(jìn)行合成，因此引物的3' -OH，必須是游離的。
[0029]所述DNA聚合酶:是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶，以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點(diǎn)開始復(fù)制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具備模板、引物、d NTP等的情況下)及其相輔的活性。
[0030]本發(fā)明涉及三組核酸序列，單鏈報(bào)告DNA (信標(biāo)DNA)，阻塞DNA (阻斷DNA)和引物DNA。其中，報(bào)告DNA末端一端帶有可以修飾到電極表面的基團(tuán)，(如疏基，氣基等)另一端則帶有電信號(hào)分子，且該報(bào)告DNA序列可以形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)。阻塞DNA為報(bào)告DNA的互補(bǔ)序列，同時(shí)其中有一段可以與靶標(biāo)微小RNA分子互補(bǔ)配對(duì)。
[0031]本發(fā)明提供一種靶標(biāo)微小RNA的電化學(xué)檢測(cè)方法，包括以下步驟:如圖1所示:
[0032]步驟一固定在工作電極表面的報(bào)告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a，打開報(bào)告DNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；
[0033]步驟二靶標(biāo)微 小RNA與雙鏈a中的阻塞DNA結(jié)合，形成雙鏈b，使阻塞DNA從工作電極表面脫離，報(bào)告DNA自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；
[0034]步驟三引物DNA與雙鏈b中阻塞DNA末端序列結(jié)合，形成雙鏈C，同時(shí)將靶標(biāo)微小RNA置換下來；
[0035]步驟四被置換下來的靶標(biāo)微小RNA又重新回到工作電極表面，與其他的工作電極表面的雙鏈a發(fā)生反應(yīng)；
[0036]步驟五經(jīng)過上述N次循環(huán)反應(yīng)后，工作電極表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的報(bào)告DNA也越來越多，工作電極表面電信號(hào)會(huì)越來越強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子微小RNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)。
[0037]所述步驟一中還包括按照靶標(biāo)微小RNA種類的不同，設(shè)計(jì)不同的阻塞DNA和報(bào)告DNA分子單鏈，設(shè)計(jì)成的阻塞DNA要有一端序列可以與靶標(biāo)微小RNA特異性結(jié)合；設(shè)計(jì)成的報(bào)告DNA分子單鏈包括三部分:(I)環(huán)狀區(qū)，一般為長(zhǎng)度15~30堿基的序列，能與阻塞DNA特異性結(jié)合；(2)莖干區(qū)，通常為長(zhǎng)度5~8堿基的互補(bǔ)序列，莖干區(qū)通過氫鍵共價(jià)連接形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；(3)帶電集團(tuán)，本發(fā)明所述報(bào)告DNA5'端帶有可以修飾到電極表面的基團(tuán)(如巰基，氨基等)，報(bào)告DNA3,端帶有電信號(hào)分子。利用本領(lǐng)域熟知的方法合成出上述符合要求的報(bào)告DNA之后,可以將報(bào)告DNA共價(jià)結(jié)合于工作電極表面,再將其與阻塞DNA形成雙鏈
a,或者可以先將報(bào)告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a之后,雙鏈a再共價(jià)結(jié)合于工作電極表面。
[0038]所述步驟二中報(bào)告DNA自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，會(huì)將報(bào)告DNA3'端帶有的電信號(hào)分子拉近工作電極，使工作電極表面產(chǎn)生電信號(hào)。本發(fā)明所述方法中所述檢測(cè)電信號(hào)強(qiáng)度的電極系統(tǒng)是三電極系統(tǒng)，其中工作電極優(yōu)選金電極。
[0039]所述步驟三中還包括引物DNA和DNA聚合酶的加入，引物DNA為本領(lǐng)域人員熟知的通用引物。根據(jù)樣品的不同，檢測(cè)靶標(biāo)微小RNA種類不同，所對(duì)應(yīng)的阻塞DNA序列也不同，選用哪一種通用引物還要根據(jù)阻塞DNA序列的不同而確定。引物DNA5'端是可連接于阻塞DNA3 ’端的，并且引起阻塞DNA單鏈分子在DNA聚合酶的作用下，形成DNA雙鏈分子C，在合成雙鏈分子c的同時(shí)，將靶標(biāo)微小RNA重新釋放出來，回到電極表面，進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)。
[0040]經(jīng)過上述N次循環(huán)反應(yīng)后，工作電極表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的報(bào)告DNA也越來越多，工作電極表面電信號(hào)會(huì)越來越強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子微小RNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)。
[0041]為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明提供的微小RNA的檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)描述，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施，但不能將他們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0042]實(shí)施例1:
[0043]I)根據(jù)所測(cè)樣品確定靶標(biāo)微小RNA序列為UAGC UUAU CAGA CUGA UGUU GA ；(3' -5')
[0044]2)根據(jù)所要檢測(cè)的靶標(biāo)微小RNA序列合成阻塞DNA，序列為-Mkk TCTC AACA TCAGTCTG ATAA GCAT ; (3' -5') [0045]3)根據(jù)阻塞 DNA 序列合成報(bào)告 DNA:Fc-TAT CAGA CTGA TGTT GAGA TTCTGATA-(C)6-SH-(C)6 ; (3' -5')
[0046]4)引物 DNA:GAGA TTCT (3' -5')
[0047]5)將合成的報(bào)告 DNA 分子溶于含有 IOmM Tris-HCl，IOmM TCEP，ImM EDTA，0.1MNaCl的溶液中，終濃度為I μ Μ。將金電極浸泡入上述溶液中,放置過夜。然后將金電極沖洗干凈，浸泡入ImM巰基己醇中半小時(shí)；再將金電極浸泡在I μ M濃度的阻塞DNA分子溶液中，靜置I小時(shí)，形成雙鏈a,打開報(bào)告DNA分子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)
[0048]6)將金電極插入樣品中,樣品中含有的祀微小RNA會(huì)與金電極表面的雙鏈a發(fā)生置換反應(yīng)，靶微小RNA與雙鏈a中的第二單鏈DNA分子結(jié)合，形成雙鏈b，使第二單鏈DNA分子從金電極表面脫離，第一單鏈DNA分子自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；
[0049]7)在上述混合液中加入引物DNA、DNA聚合酶和dNTP，聚合反應(yīng)形成雙鏈C，同時(shí)將待檢測(cè)樣品中的靶微小RNA置換下來；
[0050]8)被置換下來的靶微小RNA又重新回到金電極表面，與金電極表面其他的雙鏈a發(fā)生反應(yīng)。經(jīng)過上述N次循環(huán)反應(yīng)后，金電極表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的第一單鏈DNA分子也越來越多，此時(shí)，金電極電化學(xué)反應(yīng)會(huì)越來越強(qiáng)，最終達(dá)到250 μ A。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)上述靶標(biāo)微小RNA的電化學(xué)單分子的檢測(cè)；
[0051]9)圖2為報(bào)告DNA分子與阻塞DNA分子形成的雙鏈a修飾的工作電極的阻抗值變化；
[0052]10)圖3為加入微小RNA反應(yīng)前后電流的變化；
[0053]11)圖4為微小RNA濃度的對(duì)數(shù)值與峰電流大小的線性關(guān)系圖。
[0054]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。
【權(quán)利要求】
1.一種用于微量靶標(biāo)microRNA的電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以 下步驟: 步驟一報(bào)告DNA打開莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與阻塞DNA形成雙鏈a，并被固定到工作電極表面；或者報(bào)告DNA固定到電極表面后與阻塞DNA形成雙鏈a 步驟二靶標(biāo)microRNA與雙鏈a中的阻塞DNA結(jié)合，形成雙鏈b，使阻塞DNA從工作電極表面脫離，報(bào)告DNA自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)； 步驟三引物DNA與雙鏈b中阻塞DNA末端序列結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成DNA雙鏈C，同時(shí)將靶標(biāo)microRNA置換下來； 步驟四被置換下來的靶標(biāo)microRNA又重新回到工作電極表面，與其他的工作電極表面的雙鏈a發(fā)生反應(yīng)； 步驟五經(jīng)過上述N次循環(huán)反應(yīng)后，工作電極表面的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的報(bào)告DNA也越來越多，工作電極表面電信號(hào)會(huì)越來越強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量微小RNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的用于靶標(biāo)microRNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)方法，其特征在于，所述靶標(biāo)microRNA、報(bào)告DNA、阻塞DNA和引物DNA均為單鏈分子。
3.如權(quán)利要求1所述的用于靶標(biāo)microRNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)方法，其特征在于，所述報(bào)告DNA連接基團(tuán)和電信號(hào)分子，分別位于報(bào)告DNA分子兩端。
4.如權(quán)利要求1所述 的用于靶標(biāo)microRNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)方法，其特征在于，所述阻塞DNA通過與報(bào)告DNA互補(bǔ)配對(duì)被固定于電極表面，但不是直接連接于工作電極表面。
5.如權(quán)利要求1所述的用于靶標(biāo)microRNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)方法，其特征在于，所述阻塞DNA上有一段可以與靶標(biāo)microRNA配對(duì)的堿基序列。
6.如權(quán)利要求1所述的用于靶標(biāo)microRNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)方法，其特征在于，靶標(biāo)microRNA是可以重復(fù)利用的。
7.如權(quán)利要求1或3所述的用于靶標(biāo)microRNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)方法，其特征在于，所述報(bào)告DNA與阻塞DNA形成雙鏈a時(shí),報(bào)告DNA3'端電信號(hào)分子遠(yuǎn)離金電極表面，電信號(hào)減弱。
8.如權(quán)利要求3所述的用于靶標(biāo)microRNA的電化學(xué)單分子檢測(cè)方法，其特征在于，所述報(bào)告DNA在單鏈分子狀態(tài)下形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)報(bào)告DNA3'端帶有電信號(hào)分子，靠近工作電極表面，增強(qiáng)電信號(hào)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993097SQ201410259207
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】韓坤, 繆鵬, 王弼陡, 唐玉國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所