一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光基因傳感方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，該方法包括如下步驟：1、將網(wǎng)印板壓在層析紙上，涂蠟，然后加熱，層析紙從網(wǎng)印板上自然脫落，晾干；2、設(shè)計捕捉探針和信號探針；3、紙基微流控芯片的預(yù)處理；4、將待測DNA樣品與捕捉探針孵育，加入信號探針與待測DNA樣品雜交反應(yīng)，再加入HRP-SA孵育；最后，加入底液觸發(fā)增強型化學(xué)發(fā)光，發(fā)光信號由一臺CCD數(shù)字成像設(shè)備成像采集。相比于昂貴且復(fù)雜的光學(xué)成像系統(tǒng)，本發(fā)明采用簡單的CCD設(shè)備進行成像檢測；將增強型化學(xué)發(fā)光體系和生物素-鏈霉親和素親和放大體系相結(jié)合，極大地提高了紙基微流控芯片化學(xué)發(fā)光的檢測靈敏度，檢測限可達(dá)6.3×10-2pmol/L。
【專利說明】一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光基因傳感方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測單增李斯特菌hlyA基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因是一個功能性的DNA分子片段，是遺傳信息的基本單位，是所有物種最基本的決定性因素?；驒z測是指通過一定的檢測方法對靶核酸分子進行檢測，并分析靶核酸分子致病基因、疾病易感性基因等情況的一種技術(shù)。單核細(xì)胞增生李斯特菌(本文有些地方簡稱“單增李斯特菌”)作為一種重要的食源性致病菌可引起人和動物感染疾病，它是由多種毒力因子組成。自從1985年P(guān)arrisius小組報道李斯特菌溶胞素以來，已有很多證據(jù)證明單核細(xì)胞增生李斯特氏菌溶血素LLO是主要的致病因素，LLO是由hlyA基因編碼并且只存在于致病性菌株中。
[0003]目前為止，一些研究小組已經(jīng)研制了相關(guān)的基因檢測方法:電致化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法、熒光分析法、比色分析法等。相比于這些檢測方法，化學(xué)發(fā)光法具有低噪聲、靈敏度高、需要的檢測設(shè)備簡單等優(yōu)點，因此它成為一種強大的分析技術(shù)被廣泛運用于各種基因檢測和免疫分析中。
[0004]自2007年以來，紙基微流控芯片已經(jīng)得到非常迅速的發(fā)展。鑒于紙的普遍性、兼容性、毛細(xì)特性，它常常被用來進行微流體處理和樣品分析。相比于其它襯底材料的微流控芯片，紙基微流控芯片能夠?qū)崿F(xiàn)便攜、低成本、快速、現(xiàn)場檢測。到目前為止，一些加工方法已用于紙基微流控芯片 制作，比如:照相平板加工法、等離子處理法、剪紙法、蠟轉(zhuǎn)染法、噴墨印刷法等。相比于這些加工方法，蠟網(wǎng)印加工法的優(yōu)勢在于:制作容易、成本低、且所需設(shè)備簡單。
[0005]基于魯米諾-過氧化氫的化學(xué)發(fā)光體系是一種應(yīng)用非常廣泛的發(fā)光體系。由于辣根過氧化物酶穩(wěn)定性好、比活度高、特異性強，它常常被用作魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系的催化劑。然而，大分子間的空間位阻、發(fā)光強度低且衰減迅速等因素使得辣根過氧化物酶-魯米諾-過氧化氫發(fā)光體系穩(wěn)定性差且靈敏度低。
[0006]紙基微流控作為一種新發(fā)展起來的檢測平臺，應(yīng)用于DNA檢測的研究還特別少。就目前而言，僅Yu等人在這方面做了相關(guān)研究。Yu等人將傳統(tǒng)紙基蠟網(wǎng)印方法應(yīng)用于紙基反應(yīng)池制作；然后在網(wǎng)印好的反應(yīng)池上進行處理及標(biāo)記；通過DNA雜交的原理對靶DNA進行雜交捕獲；再通過引入標(biāo)記有信號物質(zhì)的信號探針與靶DNA雜交來放大信號，其中他們的信號物質(zhì)為碳量子點吸附的納米多孔金；最后通過高錳酸鉀底液觸發(fā)化學(xué)發(fā)光。
[0007]該方法的缺陷在于:
[0008](I)靶DNA長度低于50bp ;祀DNA長度越長，應(yīng)用范圍越廣，低于50bp顯然應(yīng)用的范圍很窄；
[0009](2)蠟網(wǎng)印方法中加熱過程為130°C (150s)，該溫度過高、時間過長，會導(dǎo)致紙張性能發(fā)生改變，不利于其后的檢測反應(yīng)；[0010](3)沖洗在反應(yīng)池中進行，這會導(dǎo)致沖洗不干凈，且多次沖洗會導(dǎo)致試劑交叉污染；
[0011](4)所采用的信號物質(zhì)——碳量子點吸附的納米多孔金，其合成過程比較復(fù)雜，并且信號物質(zhì)標(biāo)記信號探針的過程繁雜，時間較長；
[0012](5)采用微弱發(fā)光分析儀對化學(xué)發(fā)光信號進行采集分析，雖然能實現(xiàn)較低靈敏度檢測，但是該分析儀價格昂貴、導(dǎo)致檢測成本高，并且不具備高通量檢測的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，該方法操作簡便、靈敏度和特異性高，實現(xiàn)了對李斯特菌食品致病菌的檢測。
[0014]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0015]一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，包括如下步驟:
[0016](I)制作紙基微流控芯片
[0017]如圖1所示，將網(wǎng)印板壓在層析紙上(兩者緊貼)，然后在網(wǎng)印板上涂蠟，蠟透過網(wǎng)印板將層析紙浸潤；接著，將附著層析紙的網(wǎng)印板置于加熱板上加熱，帶層析紙的一面朝向加熱板；加熱后，層析紙從網(wǎng)印板上自然脫落，室溫冷卻晾干。制成的紙基微流控芯片其上面會有一個個的反應(yīng)池。 網(wǎng)印板可通過加熱擦拭去除多余的蠟。
[0018]所述的層析紙是Whatmanl號層析紙，大小優(yōu)選200mmX 200mm。
[0019]所述的網(wǎng)印板優(yōu)選200目尼龍網(wǎng)印版，反應(yīng)池直徑優(yōu)選4mm，沖洗通道優(yōu)選長4mm、寬 2mm。
[0020]所述的將網(wǎng)印板置于加熱板上加熱，優(yōu)選100°C加熱5s。
[0021](2)設(shè)計捕捉探針和信號探針
[0022]本發(fā)明方法所選取的目標(biāo)序列(本文有些地方也稱為“靶DNA”)是hlyA基因的198bp長鏈特異性片段(在本文中的代號是S2，其序列如SEQ ID N0.1所示)；所設(shè)計的捕捉探針(SI)其序列如SEQ ID N0.2所示，其3’端連接氨基；信號探針(S3)的序列如SEQ IDN0.3所示，其3’端連接生物素。
[0023]所設(shè)計的捕捉探針為31bp，其中22個連續(xù)堿基與靶DNA完全互補配對；設(shè)計的信號探針為18bp，與靶DNA的另一段序列完全互補配對。
[0024](3)紙基微流控芯片的預(yù)處理
[0025]將5 μ L0.3mol/L高碘酸鈉溶液滴入紙基微流控芯片的反應(yīng)池中；置于暗室中反應(yīng)lh，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；然后，將5 μ L5 X 10_7mol/L捕捉探針加入反應(yīng)池中，孵育30min，采用40 μ L Tris - HCl緩沖液沖洗4次；最后，將5 μ L0.5mg/mL NaCNBH3加入反應(yīng)池中，孵育lOmin，采用40 μ L Tris - HCl緩沖液沖洗4次，室溫晾干。
[0026](4)上樣后的分析檢測
[0027]將5μ L待測DNA樣品加入反應(yīng)池與捕捉探針進行雜交反應(yīng)，孵育30min，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；接著，將5 μ L5 X 10_7mol/L信號探針加入反應(yīng)池與待測DNA樣品雜交反應(yīng)，孵育30min，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；然后，將10 μ L HRP-SA (辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素)加入反應(yīng)池，孵育40min，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；最后，將10 μ L底液加入反應(yīng)池，觸發(fā)增強型化學(xué)發(fā)光，發(fā)光信號由一臺CCD (電荷耦合器件Charge CoupledDevice)數(shù)字成像設(shè)備成像采集；
[0028]若待測DNA樣品的化學(xué)發(fā)光強度值大于1，說明待測DNA樣品中含有hlyA基因；若待測DNA樣品的化學(xué)發(fā)光強度值小于或等于1，說明待測DNA樣品中不含有hlyA基因；根據(jù)實驗發(fā)現(xiàn)，空白對照的化學(xué)發(fā)光強度值都小于或等于I。所述的空白對照是不含有hlyA基因的DNA樣品。
[0029]化學(xué)發(fā)光強度=平均灰度值；
[0030]平均灰度值由系統(tǒng)自帶的圖像分析軟件計算出；
[0031]所述的CCD數(shù)字成像設(shè)備是廣州市明美科技有限公司產(chǎn)品，型號為MC15。本發(fā)明中增強型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)所采用的圖像分析軟件V 1.0為廣州明美科技有限公司開發(fā)。
[0032]所述的待測DNA樣品，是將待測菌株進行培養(yǎng)，然后提取DNA，用引物進行目標(biāo)序列的PCR擴增，擴增產(chǎn)物在95°C水浴中加熱5min，將雙鏈靶DNA熱變性成單鏈靶DNA，得到待測DNA樣品；所述的菌株培養(yǎng)、DNA提取和PCR擴增都用現(xiàn)有技術(shù)的方法即可。
[0033]所述的引物序列如下:
[0034]Lis-F:5，-GCCGT AAGTG CGAAA TC-3，(SEQ ID N0.4)
[0035]Lis-R: 5’ -ATAGG CAATG GGAAC TCC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0036]所述的底液由魯米諾、過氧化氫、對碘苯酚和水組成；底液的pH值是7.5~9.0,PH值優(yōu)選8.2 ;底液中魯米諾的濃度是5X 10_4mol/L，過氧化氫的濃度是4X 10_3mol/L，對鵬苯酚的濃度是 I X 10 4mol/L ~I X 10 3mol/L,優(yōu)選 4 X 10 4mol/L。
[0037]步驟(3)和(4)中有多次沖洗過程。為了實現(xiàn)高效率的沖洗，在反應(yīng)池的兩邊設(shè)計了兩個沖洗通道。在非沖洗過程中，通道與反應(yīng)池通過蠟隔離方式保持一定距離，保證反應(yīng)液集聚在反應(yīng)池內(nèi)不擴散，確保反應(yīng)順利進行；一旦開始沖洗，兩邊的沖洗通道通過折紙方法與反應(yīng)池相連接，然后在一邊的矩形池內(nèi)滴入緩沖液，待緩沖液流過反應(yīng)池到另一邊的矩形池時用足量吸液紙吸走液體。這樣反復(fù)幾次，反應(yīng)池內(nèi)的多余反應(yīng)試劑將被沖洗干凈；沖洗完成后沖洗通道與反應(yīng)池分開。相比于直接在反應(yīng)池中的沖洗方法，這種方法能夠避免多次沖洗造成的試劑污染，提高沖洗效率。
[0038]本發(fā)明的基本原理是:通過高碘酸鈉處理紙基微流控芯片反應(yīng)池產(chǎn)生大量醛基，醛基化的反應(yīng)池與氨基化的捕捉探針通過形成希夫堿固定結(jié)合，氰基硼氫化鈉用來穩(wěn)定共價鍵；加入待測DNA樣品與捕捉探針置于37°C下雜交反應(yīng)30min ;在反應(yīng)池加入生物素標(biāo)記的信號探針。與待測DNA樣品進行雜交，37°C孵育30min ;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，37°C孵育40min，通過生物素-鏈霉親和素的親和作用，將化學(xué)發(fā)光所需的酶引入檢測體系中，同時放大檢測信號；加入含有魯米諾、過氧化氫、對碘苯酚的底液來觸發(fā)增強型化學(xué)發(fā)光，對碘苯酚的增強作用使得增強型化學(xué)發(fā)光強度相對于無增強型化學(xué)發(fā)光在衰減緩慢的同時增強了 1000倍以上；通過一臺CXD數(shù)字成像設(shè)備對發(fā)光信號進行成像、采集與分析。
[0039]生物素容易與蛋白質(zhì)和核酸類等生物大分子結(jié)合而形成生物素衍生物，這不僅保持了大分子物質(zhì)的原有生物活性，而且比活度高，具有多價性；親和素與生物素間的結(jié)合具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專一性。親和素結(jié)合生物素的親和常數(shù)可為抗原-抗體反應(yīng)的百萬倍，二者結(jié)合形成復(fù)合物的解離常數(shù)很小，呈不可逆性；而且酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結(jié)合。生物素-鏈霉親和素親和放大體系應(yīng)用到當(dāng)前化學(xué)發(fā)光檢測體系中，不僅能夠增強體系的檢測靈敏度，而且還具有非常高的特異性。
[0040]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
[0041](I)相比于傳統(tǒng)的蠟網(wǎng)印加工方法，本發(fā)明的改良蠟網(wǎng)印加工方法運用于紙基微流控芯片制作過程中能夠更長時間將反應(yīng)液穩(wěn)定在反應(yīng)池中而不往四周擴散，參見圖7 ；形成的親水反應(yīng)區(qū)更精細(xì)；而且，改良蠟網(wǎng)印加工方法制作工藝簡單且極大地縮短了加熱時間。
[0042](2)【背景技術(shù)】所提到的文獻，其制作紙基芯片是涂蠟后，將紙撕下來單獨加熱；本發(fā)明是涂蠟后將吸附有紙的網(wǎng)版一起加熱，如此能夠?qū)⒏嗟南炌高^網(wǎng)版融在紙上，使得網(wǎng)印效果更好。
[0043](3)相對于其它襯底材料的微流控芯片，本發(fā)明的紙基微流控芯片材料更加普遍通用、成本低、且充分利用了紙纖維素的物理化學(xué)性質(zhì)。 [0044](4)相比于其它昂貴且復(fù)雜的光學(xué)成像系統(tǒng)，本發(fā)明采用簡單的CCD設(shè)備進行成像檢測；并且將增強型化學(xué)發(fā)光體系和生物素-鏈霉親和素親和放大體系相結(jié)合，極大地提高了紙基微流控芯片化學(xué)發(fā)光的檢測靈敏度，檢測限可達(dá)6.3X 10_2pmol/L。
[0045](5)相對于其它基因傳感方法常常檢測短片段的核酸序列，本發(fā)明的紙基微流控芯片檢測的靶DNA序列長達(dá)198bp，極大地提高了檢測方法應(yīng)用上的廣泛性。
[0046](6)相對于其它基因傳感方法常常檢測過濾純化后的核酸序列，本發(fā)明的紙基微流控芯片檢測的DNA樣品是非過濾純化的，這簡化了檢測過程和提高應(yīng)用上的廣泛性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1是本發(fā)明的紙基微流控芯片的制作過程示意圖。
[0048]圖2是實施例1的發(fā)光信號檢測結(jié)果圖；其中，a是待測DNA樣品的，b是空白對照的。
[0049]圖3是本發(fā)明方法中化學(xué)發(fā)光強度與對碘苯酚濃度的關(guān)系圖。
[0050]圖4是本發(fā)明方法中化學(xué)發(fā)光強度與底液pH值的關(guān)系圖。
[0051]圖5是本發(fā)明方法中化學(xué)發(fā)光強度與靶DNA濃度的關(guān)系圖。
[0052]圖6是實施例6中不同核酸序列組合的化學(xué)發(fā)光強度。
[0053]圖7是本發(fā)明方法制作的紙基微流控芯片與文獻方法制作的芯片其反應(yīng)池中模擬液的擴散效果圖；其中，上排是本發(fā)明的，下排是文獻方法的。
【具體實施方式】
[0054]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0055]實施例1
[0056]一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，包括如下步驟:
[0057](I)制作紙基微流控芯片
[0058]如圖1所示，將200目尼龍網(wǎng)印版(直徑4mm，沖洗通道長4mm、寬2mm)壓在200mm X 200mm Whatmanl號層析紙上(兩者緊貼)，然后在網(wǎng)印板上涂臘，臘透過網(wǎng)印板將層析紙浸潤；然后，將附著層析紙的網(wǎng)印板置于加熱板上加熱(100°c加熱5s)，帶層析紙的一面朝向加熱板；加熱后，層析紙從網(wǎng)印板上自然脫落，室溫冷卻晾干。制成的紙基微流控芯片其上面會有一個個的反應(yīng)池。
[0059](2)設(shè)計捕捉探針和信號探針
[0060]捕捉探針的序列如SEQ ID N0.2所示，信號探針的序列如SEQ ID N0.3所示。
[0061](3)紙基微流控芯片的預(yù)處理
[0062]將5 μ L0.3mol/L高碘酸鈉溶液滴入紙基微流控芯片的反應(yīng)池中；置于暗室中反應(yīng)lh，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；然后，將5 μ L5 X 10_7mol/L捕捉探針加入反應(yīng)池中，孵育30min，采用40 μ L Tris - HCl緩沖液沖洗4次；最后，將5 μ L0.5mg/mL NaCNBH3加入反應(yīng)池中，孵育lOmin，采用40 μ L Tris - HCl緩沖液沖洗4次，室溫晾干。
[0063](4)上樣后的分析檢測
[0064]將5 μ L待測DNA樣品(含有hlyA基因)加入反應(yīng)池與捕捉探針進行雜交反應(yīng)，孵育30min，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；接著，將5 μ L5 X liTmol/L信號探針加入反應(yīng)池與待測DNA樣品雜交反應(yīng)，孵育30min，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；然后，將10 μ LHRP-SA (辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素)加入反應(yīng)池，孵育40min，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；最后，將10 μ L底液加入反應(yīng)池，觸發(fā)增強型化學(xué)發(fā)光，發(fā)光信號由一臺CCD數(shù)字成像設(shè)備成像采集；
[0065]所述的底液由魯米諾、過氧化氫、對碘苯酚和水組成，其中魯米諾的濃度是5Χ 10_4mol/L，過氧化氫的濃度是4X 10_3mol/L，對碘苯酚的濃度是4X 10_4mol/L。
[0066]發(fā)光信號檢測結(jié)果如圖2所示，待測DNA樣品的化學(xué)發(fā)光強度值為5.414，空白對照(不含有hlyA基因)的化學(xué)發(fā)光強度值為0.474，說明待測DNA樣品中含有hlyA基因。
[0067]實施例2
[0068]一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，其步驟和材料均與實施例1相同。設(shè)置了若干實驗組，底液中對碘苯酚的濃度分別是lX10_2mOl/L、I X 10 3mol/L、4X 10 4mol/L、I X 10 4mol/L、I X 10 5mol/L。
[0069]各實驗組的化學(xué)發(fā)光強度值如圖3所示。
[0070]可以看出:對碘苯酚的增強作用存在閾值。當(dāng)對碘苯酚濃度較低時，幾乎對發(fā)光沒有增強作用，當(dāng)高于一個閾值(ΙΧΙΟΛιοΙ/?時，增強發(fā)光作用開始；在一定的濃度范圍(lX10_4mol/L~lX10_3mol/L)內(nèi)，發(fā)光趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加濃度到一個較大閾值(lX10_3mol/L)時，發(fā)光明顯減弱。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的可能原因是對碘苯酚濃度增高導(dǎo)致非輻射躍遷增加，從而導(dǎo)致發(fā)光減弱。
[0071]通過實驗研究，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法中對碘苯酚增強作用的濃度范圍大致為lX10_4mol/L~lX10_3mol/L，在濃度為4X 10_4mol/L時發(fā)光比較穩(wěn)定。因此，所述方法的最佳對碘苯酚濃度為4X 10_4mOl/L。
[0072]實施例3
[0073]一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，其步驟和材料均與實施例1相同。
[0074]由于辣根過氧化物酶催化作用的最佳pH值是中性或者弱酸性，而魯米諾化學(xué)發(fā)光在PH值為10.0左右時量子產(chǎn)率最高，因此，需要選擇一個能平衡兩者關(guān)系的pH值。[0075]設(shè)置若干實驗組，底液的pH值分別為7.0,7.5,8.0,8.2,8.5,9.0、10.0。
[0076]各實驗組的化學(xué)發(fā)光強度值如圖4所示。
[0077]可以看出，可接受的pH值是7.5~9.0，小于7.0和大于10.0的基本沒有發(fā)光。底液PH值為8.2時化學(xué)發(fā)光強度值最大且比較穩(wěn)定。
[0078]實施例4
[0079]一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，其步驟和材料均與實施例1相同。
[0080]設(shè)置若干實驗組，其中待測DNA樣品中靶DNA (hlyA基因)的濃度分別為1.9 X lO^pmol/L、1.9 X 100pmol/L、1.9 X IO1PmoVU 1.9 X 102pmol/L、1.9X 103pmol/L、
1.9X104pmol/L。
[0081]各實驗組的化學(xué)發(fā)光強度值如圖5所示。
[0082]由圖可知，化學(xué)發(fā)光強度隨著靶DNA濃度升高而升高。
[0083]靶DNA濃度的對數(shù)與化學(xué)發(fā)光強度呈一定線性關(guān)系。
[0084]檢測限采用的 計算方法是:XL = 3Xb+Sb(Xb為空白對照的平均化學(xué)發(fā)光強度值，Sb為空白對照的標(biāo)準(zhǔn)偏差)(10次重復(fù)實驗)，通過所得的XL值對應(yīng)的靶濃度得到檢測限。
[0085]本方法的檢測限為6.3 X 10_2pmo 1/Lο
[0086]實施例5
[0087]一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，其步驟和材料均與實施例1相同。
[0088]為了證明本發(fā)明方法對靶DNA特異性檢測，設(shè)計了單堿基變化的捕捉探針S4(其序列如SEQ ID N0.6所示，其3’端連接氨基)和單堿基變化的信號探針S5 (其序列如SEQID N0.7所示，其3’端連接生物素)，然后探究不同組合的核酸序列與化學(xué)發(fā)光強度之間的關(guān)系，組合如下:
[0089]組合A:捕捉探針S1+S2+信號探針S3 (這是本發(fā)明所采用的方法)
[0090]組合B:單堿基變化的捕捉探針S4+S2+信號探針S3 (這個式子表示的意思是用S4替代本發(fā)明方法的SI ;組合C和D的意思與此類似)
[0091]組合C:捕捉探針S1+S2+單堿基變化的信號探針S5
[0092]組合D:單堿基變化的捕捉探針S4+S2+單堿基變化的信號探針S5
[0093]組合E:捕捉探針Sl+E.coli (單鏈大腸桿菌PCR擴增產(chǎn)物)+信號探針S3
[0094]各組合的化學(xué)發(fā)光強度如圖6所示。
[0095]由圖可知，非完全互補配對的化學(xué)發(fā)光強度(組合B、C、D、E)僅僅是完全互補配對的(組合A) 20%左右。這證明了本發(fā)明的方法可以實現(xiàn)對單增李斯特菌hlyA基因的特異性片段進行特異性檢測。
[0096]實施例6
[0097]用實施例1步驟(1)的方法所制成的紙基微流控芯片，與采用文獻方法制得的紙基芯片，進彳丁對比實驗。
[0098]文獻:《Facileand sensitive paper-based chemiluminescence DNAbiosensorusing carbon dots dotted nanoporous gold signal amplification label))Wang, Y.H.，Wang, S.M.，Ge，S.G.，Wang, S.W.，Yanj M.，Zangj D.J.，Yuj J.H.，2013.Analytical Methods5，1328 - 1336.[0099]兩者同時滴入同樣體積的液體，觀察液體在反應(yīng)池中的擴散情況。結(jié)果如圖7所示。[0100]在長達(dá)40min孵育時間里，本發(fā)明的改良蠟網(wǎng)印方法得到的反應(yīng)池能夠保證大量的反應(yīng)液集聚在反應(yīng)池中，只在鮮育30~40min左右看到周邊有很小一圈浸濕的痕跡；而文獻方法制得的反應(yīng)池中的反應(yīng)液在滴入IOmin開始，池中的液體快速向外擴散，到達(dá)30min左右，池中已經(jīng)沒有明顯反應(yīng)液殘留，液體基本已經(jīng)擴散到了池周邊區(qū)域。
[0101]可見，本發(fā)明的改良蠟網(wǎng)印加工方法運用于紙基微流控芯片制作過程中能夠更長時間將反應(yīng)液穩(wěn)定在反應(yīng)池中而不往四周擴散，文獻方法所制得的芯片達(dá)不到這個效果。
[0102]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)制作紙基微流控芯片 將網(wǎng)印板壓在層析紙上，然后在網(wǎng)印板上涂蠟，將附著層析紙的網(wǎng)印板置于加熱板上加熱，帶層析紙的一面朝向加熱板；加熱后，層析紙從網(wǎng)印板上自然脫落，室溫冷卻晾干； 所述的將網(wǎng)印板置于加熱板上加熱，是100°c加熱5s ； (2)設(shè)計捕捉探針和信號探針 捕捉探針的序列如SEQ ID N0.2所示，其3’端連接氨基；信號探針的序列如SEQ ID N0.3所示，其3’端連接生物素； (3)紙基微流控芯片的預(yù)處理 將5 μ L0.3mol/L高碘酸鈉溶液滴入紙基微流控芯片的反應(yīng)池中；置于暗室中反應(yīng)lh，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；然后，將5 μ L5X 10_7mol/L捕捉探針加入反應(yīng)池中，孵育30min,采用40 μ L Tris - HCl緩沖液沖洗4次；最后，將5 μ L0.5mg/mL NaCNBH3加入反應(yīng)池中，孵育IOmin,采用40 μ L Tris - HCl緩沖液沖洗4次，室溫晾干； (4)上樣后的分析 檢測 將5 μ L待測DNA樣品加入反應(yīng)池與捕捉探針進行雜交反應(yīng)，孵育30min，采用Tris -HCl緩沖液沖洗4次；接著，將5 μ L5 X KTmol/L信號探針加入反應(yīng)池與待測DNA樣品雜交反應(yīng)，孵育30min，采用Tris-HCl緩沖液沖洗4次；然后，將10 μ L HRP-SA加入反應(yīng)池，孵育40min，采用Tris - HCl緩沖液沖洗4次；最后，將10 μ L底液加入反應(yīng)池，觸發(fā)增強型化學(xué)發(fā)光，發(fā)光信號由一臺CCD數(shù)字成像設(shè)備成像采集； 若待測DNA樣品的化學(xué)發(fā)光強度值大于1，說明待測DNA樣品中含有hlyA基因；若待測DNA樣品的化學(xué)發(fā)光強度值小于或等于1，說明待測DNA樣品中不含有hlyA基因； 化學(xué)發(fā)光強度值=平均灰度值 平均灰度值由系統(tǒng)自帶的圖像分析軟件計算出； 所述的底液由魯米諾、過氧化氫、對碘苯酚和水組成；底液的PH值是7.5~9.0，底液中對碘苯酌的濃度是1 X 10 4mol/L~1 X 10 3mol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，其特征在于:步驟(4)所述的待測DNA樣品，是將待測菌株進行培養(yǎng)，然后提取DNA，用引物進行目標(biāo)序列的PCR擴增，擴增產(chǎn)物在95 °C水浴中加熱5min，將雙鏈靶DNA熱變性成單鏈靶DNA，得到待測DNA樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，其特征在于:所述的引物序列如下:
Lis-F:5’ -GCCGT AAGTG CGAAA TC-3’
Lis-R:5’ -ATAGG CAATG GGAAC TCC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，其特征在于:步驟⑷中，底液的pH值為8.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控芯片增強型化學(xué)發(fā)光檢測hlyA基因的方法，其特征在于:步驟⑷的底液中，魯米諾的濃度是5X10_4mol/L，過氧化氫的濃度是4X10_3mol/L，對碘苯酚的濃度是4X 10_4mol/L。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004850SQ201410259179
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】章春筍, 劉菲菲 申請人:華南師范大學(xué)