桃ssap分子標記引物組合、分子標記組合及其在桃品種遺傳多樣性分析上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桃SSAP分子標記引物組合，包括LTR引物、選擇性擴增引物和尾巴引物；還公開了一種桃SSAP分子標記組合，包括10個分子標記JY01、JY02、JY03、JY04、JY05、JY06、JY07、JY08、JY09和JY10；并公開了上述桃SSAP分子標記組合在桃品種遺傳多樣性分析上的應(yīng)用。本發(fā)明通過設(shè)計桃逆轉(zhuǎn)座子LTR序列引物，選擇性擴增產(chǎn)物經(jīng)過熒光毛細管電泳檢測表明，擴增條帶清晰且豐富，更具有高效性、可靠性和實用性；另外本發(fā)明對選擇性擴增PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，通過加入尾巴序列改進了傳統(tǒng)選擇性擴增PCR反應(yīng)體系，為應(yīng)用該分子標記進行相關(guān)研究節(jié)省了成本。本發(fā)明中公布的SSAP分子標記組合在多個桃品種中均具有較高的多態(tài)性，且是穩(wěn)定存在的標記，可以用于桃品種鑒定及遺傳多樣性分析。
【專利說明】桃SSAP分子標記引物組合、分子標記組合及其在桃品種遺傳多樣性分析上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種桃SSAP分子標記引物組合、桃SSAP分子標記組合及其在桃品種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]\h\Prunus persica (L.) Batsch]屬于薔薇科(TPo1Saceae),李屬L.),種質(zhì)資源豐富，起源于我國西部地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計，我國擁有世界上最豐富的桃種質(zhì)資源，自然變異和人工選育積累了各種各樣的品種和優(yōu)系，三個國家級資源圃(北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所)保存的桃種質(zhì)資源共有1600多份。
[0003]大量的研究表明我國桃種質(zhì)資源在DNA分子水平上存在極其豐富的遺傳多樣性。充分了解桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性與譜系關(guān)系是種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳育種的基本要求和前提。豐富的遺傳變異也為品種鑒別和指紋圖譜的構(gòu)建帶來了可行性。
[0004]分子標記廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析以及輔助育種工作中。逆轉(zhuǎn)座子分子標記之一的 SSAP(sequence-specific amplification polymorphism)是根據(jù) AFLP 改進而來，它被認為 是多態(tài)性最豐富、靈敏度最高、反映的多態(tài)信息含量最多的一種類型，且該標記多為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數(shù)量幾乎是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種未緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。
[0005]目前，SSAP分子標記技術(shù)已經(jīng)成功用于葡萄、大麥、蘋果等物種的遺傳多樣性分析(Labra, 2004 ；Queen, 2004 ；Venturi，2006)，但是逆轉(zhuǎn)座子引物的開發(fā)具有種族特異性，不同物種之間的逆轉(zhuǎn)座子引物異質(zhì)性很大，至今尚無SSAP分子標記技術(shù)在桃品種遺傳多樣性分析應(yīng)用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種可用于桃品種遺傳多樣性分析的SSAP分子標記技術(shù)以及篩選具有較高多態(tài)性的桃SSAP分子標記引物組合。
[0007]為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種桃SSAP分子標記引物組合，包括LTR引物、選擇性擴增引物和尾巴引物；
其中LTR引物組序列包括:
LTR-1:5’ -TGGGGACTCCATTTTTACAACAG-3’(SEQ ID N0.1),
LTR-2:5’ -CATAGTTTTCATATTTTAGCAG-3’(SEQ ID N0.2),
LTR-3:5’ -TAGGGGCTGTTCTACATCAG-3’(SEQ ID N0.3),LTR-4:5’ -ATAATATGCATTCTGCATCAG-3’(SEQ ID N0.4),
LTR-5:5’ -CTACGAGTTGTTCTGCATCAG-3’(SEQ ID N0.5),
LTR-7:5’ -TCATCATTGATACTCTTACAG-3’(SEQ ID N0.6),
LTR-8:5’ -ACATTCCTAATTTCCAACAG-3’(SEQ ID N0.7),
LTR-12:5’ -TTGAGTTAGGGAAGGGGAAGC-3’(SEQ ID N0.8),
LTR-13:5’ -ATCTTGGAGTGTTTTCGCACA -3’(SEQ ID N0.9)；
特異選擇性擴增引物的序列包括:
M-cgt:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAACGT-3’ (SEQ ID N0.10)，
M-ggt:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGGT-3’ (SEQ ID N0.11),
M-gag:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGAG-3’ (SEQ ID N0.12)；
尾巴引物序列為:
Tail:5’ -<FAM>/〈HEX>/〈NED>/〈PET>TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ ( SEQ ID N0.13)。
[0008]本發(fā)明還公開了一種桃334?分子標記組合，包括10個分子標記幾01、幾02、幾03、JY04、JY05、JY06、JY07、JY08、JY09和JY10，為桃基因組DNA基于SSAP方法經(jīng)酶切、連接、預(yù)擴增，再加上上述的桃SSAP分子標記引物擴增而成，其中JYOl的引物組合為M-cgt&LTR-1，JY02的引物組合為M-cgt& LTR-2, JY03的引物組合為M_cgt& LTR-3, JY04的引物組合為M-cgt& LTR-4，JY05 的引物組合為M-cgt& LTR-7，JY06 的引物組合為M_cgt& LTR-12,JY07的引物組合為M-cgt& LTR-13, JY08的引物組合為M_ggt& LTR-1，JY09的引物組合為M-ggt& LTR-5, JYlO的引物組合為M-gag& LTR-8，以上所有引物組合均需要配合尾巴引物用于選擇性擴增反應(yīng)。
[0009]本發(fā)明還公開了上述的桃SSAP分子標記組合在桃品種遺傳多樣性分析上的應(yīng)用，其步驟包括:
(1)引物設(shè)計合成:除設(shè)計合成權(quán)利要求1所述的全部引物外，另外需要合成i&eI和EcoR I接頭引物以及預(yù)擴增PCR引物，
Mse I 接頭序列 Mse 1-adapter:5’ - GACGATGAGTCCTGAG-3 ’

Mse 1-adapter-plus:5， - TACTCAGGACTCAT -3，，
BcoR I 接頭序列 &oR 1-adapter:5，- CTCGTAGACTGCGTACC-3J

BcoR 1-adapter-plus:5’ - AATTGGTACGCAGTCTAC-3J,
預(yù)擴增反應(yīng)引物 &oR 1:5’ - GACTGCGTACCAATTC-3’
Mse 1:5’ - GATGAGTCCTGAGTAA-3’ ；
(2)DNA的提取:提取桃嫩葉中的基因組DNA ；
(3)酶切:用I和i&eI兩種限制性核酸內(nèi)切酶將步驟(2)提取的基因組DNA酶
切；
(4)連接:將MseI接頭序列混合制備Mse I接頭，將EcoR I接頭序列混合制備EcoRI接頭，將Mse I接頭和EcoR I接頭與酶切片段進行連接；
(5)預(yù)擴增:用預(yù)擴增PCR引物對連接后的產(chǎn)物進行預(yù)擴增；
(6)選擇性擴增:在預(yù)擴增產(chǎn)物中加入上游引物和下游引物進行擴增，上游引物為特異選擇性擴增引物組中的一個和Tail，下游引物為LTR引物中的一個，特異選擇性擴增引物和LTR引物的組合遵循10個分子標記的組合規(guī)則；(7)擴增產(chǎn)物檢測與分析:對擴增產(chǎn)物于ABI遺傳分析儀上進行分析，使用GeneMapper version 4.0 讀取擴增片段數(shù)據(jù)，然后利用 Microsoft Excel 2007 和FreeTree 分別進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及聚類分析。
[0010]進一步的，步驟(6)中上游引物和下游引物的組合規(guī)則按照權(quán)利要求2中所述的10個桃逆轉(zhuǎn)座子分子標記的組合規(guī)則。
[0011]進一步的，其詳細步驟為:
(1)引物設(shè)計合成:使用逆轉(zhuǎn)座子預(yù)測軟件LTR_STRUCversion 1.1對桃全基因組序列進行分析。在預(yù)測結(jié)果數(shù)據(jù)中優(yōu)先選擇兩端LTR序列相似度大于99%的逆轉(zhuǎn)座子，使用Primer Premier 5.0并參考3’端LTR區(qū)域序列設(shè)計SSAP分子標記中選擇性擴增所需的下游引物，在該引物設(shè)計時僅選擇從本區(qū)域5’端第一個堿基開始，同時替換第一個堿基為錯配堿基，設(shè)計引物長度為19_23bp，在特異選擇性擴增引物末端添加三個選擇性堿基，分別為GAG、CGT和GGT，從而形成不同引物組合，同時在其5 ’端添加18bp的通用引物序列(Ml3 )TGTAAAACGACGGCCAGT, Tail中的5’端分別添加四種不同的熒光基團，即FAM、HEX、PET和NED中選擇，便于后期使用遺傳分析儀進行擴增產(chǎn)物的檢測與分析；
(2)DNA的提取:①用液氮研磨I g左右的幼葉成粉末狀，取約0.4g樣品置于2 mL離心管中；
②加入1mL提取液后混勻，提取液的配方為:0.4 mol/L葡萄糖、3% PVPUO mmol/Lβ-巰基乙醇；
③4?,10000 rpm, 10 min,棄上清液,加入I mL提取液后混勻；
④4°C，10000rpm, 10 min，棄上清液，加入0.7 mL 65°C預(yù)熱的SDS裂解液，65°C水浴40min，期間不時輕輕搖動，水浴結(jié)束待冷卻后加入0.8 mL抽提混合液，混勻并于室溫下靜置10 min, SDS 裂解液的配方為:100 mmol/L Tris.Cl，pH 8.0,20 mmol/L EDTA, 1.4 mmol/LNacI, 1.5% SDS，抽提混合液的配方為:氯仿:乙醇:異戊醇=20:4:1 (V:V:V);
⑤4?,10000 rpm, 10 min,小心將上清液移入新的2 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置30 min ;小心吸出絮團狀沉淀，用70%乙醇洗滌，
⑥超凈工作臺吹干剩余乙醇后，用0.4mL TE溶液溶解DNA，TE溶液的配方為:10mmol/T, Tris*Cl, I mmol/L EDTA, pH 8.0 ；
⑦采用紫外分光光度計檢測DNA，確定其濃度和質(zhì)量，同時取f2 μ I在1.0%的瓊脂糖凝膠上檢測，DNA原液稀釋成濃度為100 ng/μ I的工作液保存于_20°C冰箱；
(3)酶切，該反應(yīng)體系為:基因組DNA模板200ng, 10XNEB Buffer 5 μ L,BSA(10 mg/mL) 0.2 μ L, Mse I (10 U/μ L) 0.25 μ L，EcoR 1(10 U/μ L) 0.25 μ L，ddH20 補足至25 μ L，混勻后 37°C保溫 6 h，75°C滅活 20 min ；
(4)連接:①接頭的制備:分別取EcoR1-adapter和EcoR 1-adapter-plus等體積的量混合配成10 μ mol/L的濃度，再加等量的H20稀釋成5 μ mol/L的終濃度；分別取Msel-adapter和Msel-adapter-plus等體積的量混合配成50 μ mol/L的濃度，在PCR儀上執(zhí)行以下程序:94°C，3 min ；65°C,10 min ；37°C,10 mim;25°C，10 mim，退火后_20°C保存?zhèn)溆茫?br> ②連接反應(yīng)體系:在酶切產(chǎn)物中加入5 μ L如下混合液:EcoR I接頭(5 μ mol/L) Iμ L, Mse I 接頭(50 μ mol/L) I μ L, 10XT4 Buffer 2 μ L，T4 連接酶(3 U/μ L) I uL,16°C連接過夜，65°C滅活20 min ；
(5)預(yù)擴增:預(yù)擴增20μ L反應(yīng)體系為:DNA酶切連接產(chǎn)物2 μ L，10XPCR Buffer 2μ L, dNTP Mix (10 nM each) 0.5 μ L, Mg2+ (25 mM) 2 μ L, BcoR I 預(yù)擴增引物(10 μ Μ)I μ I,Mse I 預(yù)擴增引物(10 μ Μ) I μ L，rTaq 酶(5 U/μ L) 0.2 μ L, ddH20 11.7 μ L,預(yù)擴增PCR程序如下:94°C 5 min, 94°C 30 s，56°C I min，30個循環(huán)，72°C I min, 72°C 10min ;反應(yīng)完成后，取5 μ L產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，其余產(chǎn)物于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> (6)選擇性擴增:將預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋10倍作為選擇性擴增的模板，選擇性擴增反應(yīng)體系體積為25 μ L，包括:選擇性擴增模板2 μ L,10XPCR Buffer 2 μ L, dNTP Mix (10 nMeach ) 1.0 μ L, Mg2+ (25 mM) 1.6 μ L，特異選擇性擴增引物(10 μ Μ) 1.6 μ L，LTR 引物(10 μ Μ) 0.4 μ L，尾巴引物(10 μ Μ) 2.0 μ L，rTaq 酶(5 U/μ L) 0.3 μ L，ddH2014.1 μ L0 選擇性擴增 PCR 程序如下:94°C 5 min, 94°C 30 s，65°C (-0.7/cyc) 30 s 13個循環(huán)，72°C I min, 94°C 30s, 56°C 30s 19個循環(huán)，72°C I min, 94°C 30s, 53°C 30s 8個循環(huán)，72°C I min，72°C 10 min，反應(yīng)完成后，取5 μ L產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，其余產(chǎn)物于-20°C保存?zhèn)溆茫?br> (7)擴增產(chǎn)物檢測與分析:經(jīng)上述擴增過程得到的PCR產(chǎn)物，取4μ I加ddH20稀釋至25 ul,吸取稀釋液加入到加有12 ul甲酰胺變性緩沖液(Formamide)和0.3ul內(nèi)標(LIZ500, 75-500 bp)的 96孔PCR上樣板中，95°C變性5 min,在ABI3130遺傳分析儀上進行檢測，用genemapper 4.0軟件進行片段大小讀數(shù),只統(tǒng)計長度范圍在100-500 bp內(nèi)的擴增產(chǎn)物片段，然后使用Microsoft Excel 2007和FreeTree分別進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及聚類分析，聚類圖的修改使用軟件Treeview 1.6.6。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
(I)本發(fā)明中10個桃SSAP分子標記的引物組合帶型穩(wěn)定、清晰且重復(fù)性好，在多個桃品種中均具有較高的多態(tài)性，利用這10個桃SSAP分子標記成功的對多個桃品種進行聚類分析，為桃品種鑒定以及遺傳多樣性分析建立了新的方法。
[0013](2)本發(fā)明將通用引物M13序列添加在特異選擇性擴增引物的5’端，同時加入已經(jīng)添加熒光基團的Tail序列共同用于選擇性擴增，經(jīng)驗證后發(fā)現(xiàn)該方法穩(wěn)定可靠，今后大量應(yīng)用該方法時，即使選用再多的分子標記組合，也只需要合成四條熒光引物即可，降低了實驗成本。
[0014](3)本發(fā)明的試驗步驟均為常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，成本低，在短時間內(nèi)可完成大批實驗材料鑒定。同時應(yīng)用熒光標記，在ABI3130遺傳分析儀(熒光毛細管電泳)上鑒定，效果可靠，可廣泛用于今后的桃種質(zhì)評價、創(chuàng)新、雜交育種親本選擇等研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為SSAP分子標記技術(shù)原理路線不意圖。
[0016]圖2為桃SSAP分子標記選擇性擴增產(chǎn)物的熒光毛細管電泳檢測圖，其中:A，M-cgt/LTR-7 ；B, M-cgt/LTR-12 ；C, M-ggt/LTR-1。
[0017]圖3為基于10個桃SSAP分子標記組合分型數(shù)據(jù)構(gòu)建的45份桃品種NJ法(Neighbour-joining)聚類圖，其中“Λ”代表半離核溶質(zhì)，“□”代表離核溶質(zhì)，“〇”代表粘核溶質(zhì)，“ ”代表Story-hard類型，“.”代表粘核不溶質(zhì)。
[0018]圖4為基于10個桃SSAP分子標記組合分型數(shù)據(jù)構(gòu)建的8份觀賞桃品種NJ法(Neighbour-joining)聚類圖。
[0019]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施方式做進一步說明。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
SSAP分子標記在桃品種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用，其步驟包括:
(1)引物設(shè)計合成:使用逆轉(zhuǎn)座子預(yù)測軟件LTR_STRUCversion 1.1對桃全基因組序列進行分析。在預(yù)測結(jié)果數(shù)據(jù)中優(yōu)先選擇兩端LTR序列相似度大于99%的逆轉(zhuǎn)座子，使用Primer Premier 5.0并參考3’端LTR區(qū)域序列設(shè)計SSAP分子標記中選擇性擴增所需的下游引物，在該引物設(shè)計時僅選擇從本區(qū)域5’端第一個堿基開始，同時替換第一個堿基為錯配堿基，設(shè)計引物長度為19_23bp，在特異選擇性擴增引物末端添加三個選擇性堿基，分別為GAG、CGT和GGT，從而形成不同引物組合，同時在其5 ’端添加18bp的通用引物序列(Ml3 )TGTAAAACGACGGCCAGT, Tail中的5’端分別添加四種不同的熒光基團，即FAM、HEX、PET和NED，便于后期使用ABI3130遺傳分析儀進行分型分析，引物序列見表1
表1:相關(guān)引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種桃SSAP分子標記引物組合，包括LTR引物、選擇性擴增引物和尾巴引物； 其中LTR引物序列包括:
LTR-1:5’ -TGGGGACTCCATTTTTACAACAG-3’(SEQ ID N0.1),
LTR-2:5’ -CATAGTTTTCATATTTTAGCAG-3’(SEQ ID N0.2),
LTR-3:5’ -TAGGGGCTGTTCTACATCAG-3’(SEQ ID N0.3),
LTR-4:5’ -ATAATATGCATTCTGCATCAG-3’(SEQ ID N0.4),
LTR-5:5’ -CTACGAGTTGTTCTGCATCAG-3’(SEQ ID N0.5),
LTR-7:5’ -TCATCATTGATACTCTTACAG-3’(SEQ ID N0.6),
LTR-8:5’ -ACATTCCTAATTTCCAACAG-3’(SEQ ID N0.7),
LTR-12:5’ -TTGAGTTAGGGAAGGGGAAGC-3’(SEQ ID N0.8),
LTR-13:5’ -ATCTTGGAGTGTTTTCGCACA -3’(SEQ ID N0.9)； 特異選擇性擴增引物的序列包括:
M-cgt:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAACGT-3’ (SEQ ID N0.10)，
M-ggt:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGGT-3’ (SEQ ID N0.11),
M-gag:5’ -TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGAG-3’ (SEQ ID N0.12)； 尾巴引物序列為:
Tail:5’ -<FAM>/〈HEX>/〈NED>/〈PET>TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ ( SEQ ID N0.13)。
2.一種桃SSAP分子標記組合，包括10個分子標記JY01、JY02、JY03、JY04、JY05、JY06、JY07、JY08、JY09和JYlO，為桃基因組DNA基于SSAP方法經(jīng)酶切、連接、預(yù)擴增，再加上權(quán)利要求I中所述的桃SSAP分子標記引物擴增而成，其中JYOl的引物組合為M-cgt& LTR-1,JY02的引物組合為M-cgt& LTR-2，JY03的引物組合為M_cgt& LTR-3，JY04的引物組合為 M-cgt& LTR-4，JY05 的引物組合為 M_cgt& LTR-7，JY06 的引物組合為 M_cgt& LTR-12,JY07的引物組合為M-cgt& LTR-13, JY08的引物組合為M_ggt& LTR_1，JY09的引物組合為M-ggt& LTR-5，JYlO的引物組合為M-gag& LTR-8，以上所有引物組合均需要配合尾巴引物用于選擇性擴增反應(yīng)。
3.—種權(quán)利要求2所述的桃SSAP分子標記組合在桃品種遺傳多樣性分析上的應(yīng)用，其步驟包括: (O引物設(shè)計合成:除設(shè)計合成權(quán)利要求1所述的全部引物外，另外需要合成i&el和EcoR I接頭引物及預(yù)擴增PCR引物，
Msel 接頭序列 i&el-adapter:5’ - GACGATGAGTCCTGAG-3’ ( SEQ ID N0.14)
i&el-adapter-plus:5’ - TACTCAGGACTCAT -3’ ( SEQ ID N0.15)， BcoR I接頭序列 FcoR 1-adapter:5^ CTCGTAGACTGCGTACC-3’ ( SEQ ID N0.16) BcoR 1-adapter-plus:5’ - AATTGGTACGCAGTCTAC-3’ ( SEQ ID N0.17)， 預(yù)擴增 PCR 引物 &OR 1:5’- GACTGCGTACCAATTC-3’ ( SEQ ID N0.18)
Mse1:5’ - GATGAGTCCTGAGTAA-3’ ( SEQ ID N0.19)； (2)DNA的提取:提取桃嫩葉中的基因組DNA ； (3)酶切:用I和i&el兩種限制性核酸內(nèi)切酶將步驟(2)提取的基因組DNA進行酶切； (4)連接:將JfeeI接頭序列混合制備JfeeI接頭，將I接頭序列混合制備I接頭，將i&el接頭和I接頭與酶切片段進行連接； (5)預(yù)擴增:用預(yù)擴增引物對連接后的產(chǎn)物進行預(yù)擴增； (6)選擇性擴增:在預(yù)擴增產(chǎn)物中加入上游引物和下游引物進行擴增，上游引物為特異選擇性擴增引物中的一個和Tail，下游引物為LTR引物中的一個，特異選擇性擴增引物和LTR引物的組合遵循10個桃SSAP分子標記的組合規(guī)則； (7)擴增產(chǎn)物檢測與分析:對擴增產(chǎn)物進行分析，讀取擴增片段數(shù)據(jù)，然后對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及聚類分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的桃SSAP分子標記組合在桃品種遺傳多樣性分析上的應(yīng)用，其詳細步驟為: Cl)引物設(shè)計合成:使用逆轉(zhuǎn)座子預(yù)測軟件LTR_STRUC version 1.1對桃全基因組序列進行分析；在預(yù)測結(jié)果數(shù)據(jù)中優(yōu)先選擇兩端LTR序列相似度大于99%的逆轉(zhuǎn)座子，使用Primer Premier 5.0并參考3’端LTR區(qū)域序列設(shè)計S-SAP分子標記中選擇性擴增所需的下游引物，在該引物設(shè)計時僅選擇從本區(qū)域5’端第一個堿基開始，同時替換第一個堿基為錯配堿基，設(shè)計引物長度為19_23bp，在特異選擇性擴增引物末端添加三個選擇性堿基，分別為GAG、CGT和GGT，從而形成不同引物組合，同時在其5’端添加18bp的通用引物序列(M13)TGTAAAACGACGGCCAGT,Tail中的5’端分別添加四種不同的熒光基團，即FAM、HEX、PET和NED，便于后期使用遺傳分析儀進行擴增產(chǎn)物的檢測與分析； (2)DNA的提取:①用液氮研磨I g左右的幼葉成粉末狀，取約0.4g樣品置于2 mL離心管中； ②加入1mL提取液后混勻，提取液的配方為:0.4 mol/L葡萄糖、3% PVPUO mmol/Lβ-巰基乙醇； ③4?,10000 rpm, 10 min,棄上清液,加入1 mL提取液后混勻； ④4。。，10000rpm, 10 min，棄上清液，加入0.7 mL 65°C預(yù)熱的SDS裂解液，65°C水浴40min，期間不時輕輕搖動，水浴結(jié)束待冷卻后加入0.8 mL抽提混合液，混勻并于室溫下靜置10 min, SDS 裂解液的配方為:100 mmol/L Tris.Cl，pH 8.0,20 mmol/L EDTA, 1.4 mmol/LNacI, 1.5% SDS，抽提混合液的配方為:氯仿:乙醇:異戊醇=20:4:1 (V:V:V); ⑤4?,10000 rpm, 10 min,小心將上清液移入新的2 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置30 min ;小心吸出絮團狀沉淀，用70%乙醇洗滌， ⑥超凈工作臺吹干剩余乙醇后，用0.4mL TE溶液溶解DNA，TE溶液的配方為:10mmol/T, Tris*Cl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0 ； ⑦采用紫外分光光度計檢測DNA，確定其濃度和質(zhì)量，同時取f2 μ I在1.0%的瓊脂糖凝膠上檢測，DNA原液稀釋成濃度為100 ng/μ I的工作液保存于_20°C冰箱； (3)酶切，該反應(yīng)體系為:基因組DNA模板200ng，10XNEB Buffer 5 μ L,BSA(10 mg/mL) 0.2μ L,#5el (10 U/μ L) 0.25 μ I, BcoR 1(10 U/μ L) 0.25 μ L，ddH20 補足至 25μ L，混勻后37°C保溫6 h，75°C滅活20 min ； (4)連接:①接頭的制備:分別取AcoR1-adapter和1-adapter-plus等體積的量混合配成10 μ mol/L的濃度，再加等量的H2O稀釋成5 μ mol/L的終濃度；分別取 1-adapter和#51<91-&(^。七61'11118等體積的量混合配成50 μ mol/L的濃度，在PCR儀上執(zhí)行以下程序:94°C，3 min ;65°C，10 min ；37°C,10 mim;25°C，10 mim，退火后_20°C保存?zhèn)溆茫? ②連接反應(yīng)體系:在酶切產(chǎn)物中加入5 4 1^如下混合液:&01? I接頭(5 μ mol/L) IyL，ifeeI 接頭(50 μ mol/L) lyL,10XT4 Buffer 2 yL，T4連接酶(3 U/μ L) I uL, 16°C連接過夜，65°C滅活20 min ； (5)預(yù)擴增:預(yù)擴增20μ L反應(yīng)體系為:DNA酶切連接產(chǎn)物2 μ L，10XPCR Buffer 2μ L, dNTP Mix (10 nM each) 0.5 μ L, Mg2+ (25 mM) 2 μ L, BcoR I 預(yù)擴增引物(10 μ Μ)I μ LJfeeI 預(yù)擴增引物(10 μ Μ) I yL，rTaq 酶(5 U/μ L) 0.2 μ L, ddH20 11.7 μ I, M擴增 PCR 程序如下:94°C 5 min, 94°C 30 s，56°C I min，30 個循環(huán)，72°C I min,72°C .10min ;反應(yīng)完成后，取5 μ L產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，其余產(chǎn)物于_20°C保存?zhèn)溆茫? (6)選擇性擴增:將預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋10倍作為選擇性擴增的模板，選擇性擴增反應(yīng)體系體積為25 μ L，包括:選擇性擴增模板2 μ L,10XPCR Buffer 2 μ L, dNTP Mix (10 nMeach ) 1.0 μ L7Mg2+ (25 mM) 1.6 μ L，特異選擇性擴增引物(10 μ Μ) 1.6 yL，LTR 引物(10 μ Μ) 0.4 μ L，尾巴引物(10 μ Μ) 2.0 μ L，rTaq 酶(5 U/μ L) 0.3 μ L，ddH20 .14.1μ L ;選擇性擴增PCR程序如下:94°C 5 min, 94°C 30 s,65°C (-0.7/cyc) 30 s 13個循環(huán)，.72°C I min, 94°C 30s, 56°C 30s 19 個循環(huán)，72°C I min, 94°C 30s, 53°C 30s 8 個循環(huán)，.72°C I min，72°C 10 min，反應(yīng)完成后，取5 μ L產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，其余產(chǎn)物于-20°C 保存?zhèn)溆茫? (7)擴增產(chǎn)物檢測與分析:經(jīng)上述擴增過程得到的PCR產(chǎn)物，取4μ I加ddH20稀釋至.25 ul，吸取稀釋液加入到加有12 ul甲酰胺變性緩沖液和0.3ul內(nèi)標的96孔PCR上樣板中，95°C變性5 min,在ABI3130遺傳分析儀上進行檢測,用genemapper 4.0軟件進行片段大小讀數(shù)，只統(tǒng)計長度范圍在100-500 bp內(nèi)的擴增產(chǎn)物片段。
【文檔編號】C12N15/11GK103966210SQ201410231891
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】焦云, 馬瑞娟, 俞明亮, 沈志軍 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院