一種煙草糖基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種煙草糖基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Sm-NgtP，該啟動(dòng)子Sm-NgtP分離于煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因中，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。采用引物對(duì)啟動(dòng)子Sm-NgtP進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到5個(gè)5’端缺失的啟動(dòng)子片斷，分別為啟動(dòng)子片段GTPA、GTPB、GTPC、GTPD和GTPE，利用上述五個(gè)啟動(dòng)子片段構(gòu)建植物表達(dá)載體，得到植物表達(dá)載體pGTPA、pGTPB、pGTPC、pGTPD和pGTPE，研究上述植物表達(dá)載體的活性發(fā)現(xiàn)，GTPC為受甲基茉莉酸和水楊酸雙重誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，GTPD是組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子，GTPC啟動(dòng)子片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，GTPD啟動(dòng)子片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
【專利說明】一種煙草糖基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種受茉莉酸和水楊酸雙重誘導(dǎo)的煙草內(nèi)源基因超強(qiáng)啟動(dòng)子的分離鑒定和應(yīng)用，通過分離和鑒定該啟動(dòng)子，可以將其應(yīng)用于植物的基因工程中，以達(dá)到植物某些基因的遺傳改良的誘導(dǎo)表達(dá)和功能研究，屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因已經(jīng)成為研究功能基因組學(xué)的有效手段，近年來通過轉(zhuǎn)基因途徑改良植物農(nóng)藝性狀正逐步得到可行性論證和普遍接受。啟動(dòng)子是基因5 ’端與RNA聚合酶及一些反式作用因子結(jié)合的DNA序列。真核生物中有三種RNA聚合酶，各與不同類型的啟動(dòng)子結(jié)合。RNA聚合酶I只轉(zhuǎn)錄rRNA，RNA聚合酶III負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄tRNA和5S rRNA。RNA聚合酶II負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)基因和部分snRNA的轉(zhuǎn)錄，其啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。從功能上可將這類啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)分為兩部分:普遍存在的、轉(zhuǎn)錄必需的核心啟動(dòng)子(corepromoter)區(qū)和特異啟動(dòng)子區(qū)。啟動(dòng)子含有一系列與特異蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，通常稱這些位點(diǎn)為順式作用元件(cis-element);這些特異蛋白則稱為反式作用因子(trans-factor)。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA盒等屬于核心啟動(dòng)子區(qū)；而調(diào)控基因表達(dá)活性的順式作用元件則歸為特異啟動(dòng)子區(qū)。
[0003]水楊酸(salicylic acid, SA)是植物體內(nèi)含量較低的一種內(nèi)源酹類小分子化合物。SA能誘導(dǎo)多種植物對(duì)病毒、真菌及細(xì)菌病害產(chǎn)生抗性。SA是誘發(fā)系統(tǒng)獲得性抗性的信號(hào)分子之一，涉及并參與植物的過敏反應(yīng)和SAR反應(yīng)，在植物的SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。SA作為植物激素和信號(hào)分子，直接或間接調(diào)控植物體發(fā)育過程中相關(guān)基因的表達(dá)。目前已經(jīng)分離出幾個(gè)受SA間接調(diào)控的順式作用元件。as-1 (Activation Sequence-1)類型水楊酸響應(yīng)元件。SA誘導(dǎo)檢測(cè)幾個(gè)源自花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子的調(diào)控元件，證實(shí)SA響應(yīng)兀件為位于-90和-46兩處的as_l兀件。用水楊酸處理煙草后，證實(shí)SA的誘導(dǎo)因子 ASF-1 (Activation Sequence Factor-1)與 as_l 兀件結(jié)合于兩個(gè) TGACG。LS7 兀件(TCTACGTCAC)和LS5元件(ACGTCATAGA)是從擬南芥PR-1 (病程相關(guān)基因I)基因啟動(dòng)子分離的SA誘導(dǎo)元件。SA通過激活路徑中的NPR1，活化了的NPRl激活轉(zhuǎn)錄因子TGA2以促進(jìn)TGA2轉(zhuǎn)錄因子與LS7、LS5元件結(jié)合，從而激活下游PR-1基因表達(dá)。W-box (TTGAC)發(fā)現(xiàn)于擬南芥NPRl基因啟動(dòng)子，是WRKY DNA結(jié)合蛋白的特異識(shí)別位點(diǎn)，WRKY基因的表達(dá)受SA的正調(diào)控。W-box突變會(huì)阻斷WRKY DNA結(jié)合蛋白的特異識(shí)別，致使啟動(dòng)子無法激活下游NPRl基因的表達(dá)，從而影響SA通過NPRl誘導(dǎo)的防衛(wèi)基因的表達(dá)。TCA-1 (tobacco nuclearproteinl)結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)由水楊酸誘導(dǎo)TCA-1結(jié)合的IObp序列(TCATCTTCTT)。該元件在大麥β -1-3-葡聚糖酶基因5’端非編碼區(qū)重復(fù)數(shù)次，現(xiàn)已知有超過30個(gè)受各種脅迫誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子含有這一元件。
[0004]茉莉酸(JasmonicAcid, JA)及茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)是亞麻酸衍生的具有環(huán)戊酮基團(tuán)的化合物。隨著20世紀(jì)80年代分子生物學(xué)的興起，人們對(duì)它們的生物合成和代謝的分子調(diào)控機(jī)理作了詳盡的研究，發(fā)現(xiàn)茉莉酸調(diào)控許多基因的表達(dá)。歸納起來有兩方面:一部分基因與植物發(fā)育有關(guān)；另一部分基因與自身防御系統(tǒng)有關(guān)，表現(xiàn)在對(duì)真菌感染、病蟲害、干旱、機(jī)械損傷以及滲透脅迫等逆境的應(yīng)激(吳勁松，種康.茉莉酸作用的分子生物學(xué)研究.植物學(xué)通報(bào)，2002，19 (2): 164-170)。目前通過對(duì)茉莉酸誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子的分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少茉莉酸誘導(dǎo)的響應(yīng)元件，但這些研究多集中在與植物自身防御系統(tǒng)有關(guān)的基因啟動(dòng)子上。T/G-box (AACGTG)，是一個(gè)bHLH-亮氨酸拉鏈JAMYC2和JAMYCIO蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，JAMYC2和JAMYCIO的表達(dá)受JAs的誘導(dǎo)。JAMYC超表達(dá)能增強(qiáng)馬鈴薯中JAs誘導(dǎo)的防衛(wèi)基因的表達(dá)，但并不導(dǎo)致這類基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的累積。JERE(jasmonate-and elicitor-responsive element),是一類最早在長(zhǎng)春花屬植物負(fù)責(zé)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的一個(gè)基因Str(strictosidine synthase)啟動(dòng)子中證實(shí)的MeJA和乙烯響應(yīng)的元件。JERE跟別的MeJA響應(yīng)元件不同的是包含一個(gè)GCC-box_like元件。JASEl (CGTCAATGAA)和 JASE2 (CATACGTCGTCAA)，發(fā)現(xiàn)于擬南芥 12_0_ 植物二 烯酸-10，11-還原酶(OPRl)基因的啟動(dòng)子的-179和-170間。啟動(dòng)子連接⑶S報(bào)告基因的研究和RNA雜交分析表明，OPRl基因受衰老和JA的上調(diào)控。啟動(dòng)子缺失和銜接掃描突變分析表明JASEl和JASE2是衰老和SA應(yīng)答的順式作用元件。脅迫響應(yīng)元件(Stress responsiveelement, SRE)是一個(gè)長(zhǎng)13bp的順式作用元件。Takeda等證實(shí)煙草長(zhǎng)末端重復(fù)序列反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ttol啟動(dòng)子中的SRE是響應(yīng)組織培養(yǎng)、損傷和MeJA誘導(dǎo)的順式調(diào)控元件。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明提供了一種來源于煙草糖基轉(zhuǎn)移酶中具有誘導(dǎo)型和超強(qiáng)活性的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠受甲基茉莉酸和水楊酸雙重誘導(dǎo)，本發(fā)明中還利用該啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體，利用甲基茉莉酸和水楊酸濃度控制，進(jìn)而通過遺傳轉(zhuǎn)化方法達(dá)到誘導(dǎo)各類目的基因表達(dá)的目的。
[0006]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種煙草糖基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Sm-NgtP，該啟動(dòng)子Sm-NgtP分離于煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因中，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]對(duì)上述啟動(dòng)子Sm-NgtP的基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子元件集中在-800~-50bp間。采用引物對(duì)啟動(dòng)子Sm-NgtP進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到5個(gè)5’端缺失的啟動(dòng)子片斷，分別為啟動(dòng)子片段GTPA、GTPB, GTPC、GTPD和GTPE，利用上述五個(gè)啟動(dòng)子片段構(gòu)建植物表達(dá)載體，得到植物表達(dá)載體pGTPA、pGTPB、pGTPC、pGTH)和pGTPE，研究上述植物表達(dá)載體的活性發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子片段GTPC為受甲基茉莉酸和水楊酸雙重誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，GTH)是組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子，GTPC啟動(dòng)子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，受甲基茉莉酸和水楊酸雙重誘導(dǎo)的GTro啟動(dòng)子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009]本發(fā)明中還提供了一種利用植物細(xì)胞表達(dá)目的基因的方法，包括以下步驟:用真核表達(dá)載體PGTPC或真核表達(dá)載體PGTro轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并培養(yǎng)，然后采用甲基茉莉酸和水楊酸誘導(dǎo)植物細(xì)胞表達(dá)目的基因；所述的植物為谷類植物，或者為棉花、煙草、油菜以及茄類植物中的任一種。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010] 圖1為本發(fā)明提供的啟動(dòng)子Sm-NgtP的核苷酸序列圖；[0011]圖2為本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA1301-Sm-NgtP表達(dá)載體；
[0012]圖3為五種啟動(dòng)子片段控制下的GUS基因在茉莉酸和水楊酸處理下的表達(dá)活性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于以下實(shí)施例。
[0014]本實(shí)施例中選取GTs基因作為候選基因，GTs全序列基因約3kb，根據(jù)GT基因編碼區(qū)上游的序列分析設(shè)計(jì)引物，分離出受茉莉酸和水楊酸雙重誘導(dǎo)的候選基因的啟動(dòng)子，將該啟動(dòng)子命名為Sm-NgtP，該啟動(dòng)子的核苷酸序列如圖1和SEQ ID N0.1所示，在圖1中，下劃線部分為擴(kuò)增Sm-NgtP啟動(dòng)子所用的引物序列，陰影顯示的是基本啟動(dòng)子元件序列，啟動(dòng)子元件核心序列用波浪線表示。
[0015]設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到五個(gè)啟動(dòng)子片段，分別為分別為啟動(dòng)子片段GTPA、GTPB、GTPC、GTro和GTPE，其中GTPC啟動(dòng)子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，GTTO啟動(dòng)子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。用限制性內(nèi)切酶Hind II1、Nco I雙酶切載體，回收純化長(zhǎng)片斷，再用T4連接酶將載體pCAMBIA1301雙酶切的長(zhǎng)片斷與啟動(dòng)子片斷連接起來，轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定后得到植物表達(dá)載體pGTPA、pGTPB、pGTPC、pGTPD、pGTPE，如圖2所示，本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA1301-Sm-NgtP表達(dá)載體。該載體含潮霉素抗性篩選基因(HRG)，啟動(dòng)子Sm-NgtP中的各片段被 融合到GUS基因5’端非翻譯區(qū)。
[0016]該啟動(dòng)子擴(kuò)增得到的五個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段代替pCAMBIA35S啟動(dòng)子與GUS融合構(gòu)建五個(gè)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化W38型煙草，獲得轉(zhuǎn)化植株。下面通過對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行GT啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)，以及花器官組織部位染色實(shí)驗(yàn)，研究該基因的組織表達(dá)特性以及受誘導(dǎo)的時(shí)空特性。
[0017]具體操作如下:
[0018]1、實(shí)驗(yàn)試劑
[0019]I) X-Gluc 染色液(IOmg.πιΤ1):20mg X-Gluc 溶于 2mL2, 2- 二甲諷基丙烷中。
[0020]2)磷酸緩沖溶液(2mol.1):稱 31.6g K2HPO4, 2.5g KH2PO4 溶于 IOOmL 二次水中，調(diào)至PH7.8。
[0021]3)鐵氰化鉀(0.05mol.1):0.1646g鐵氰化鉀溶于IOmL 二次水中。
[0022]4)亞鐵氰化鉀(0.05mol.1):0.2112g亞鐵氰化鉀溶于IOmL 二次水中。
[0023]5)0.5mol.L^1DTT:以0.01mol.1醋酸鈉為溶劑，配好后200 μ L/支分裝至Ijeppendorf 管，_7(TC 保存。
[0024]6)⑶S 反應(yīng)液(-20 °C 保存):蛋白提取液(no DTT) 25mL ；DTT (0.5M) 200 μ L ；MUG22mg。
[0025]7)⑶S 空白反應(yīng)液:蛋白提取液(no DTT) 25mL ；DTT (0.5M) 200 μ L0
[0026]8)反應(yīng)終止液:0.2mol.T1Na2CO3:10.6g Na2CO3 溶于 500mL 二次水中。
[0027]9)⑶S染液
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種煙草糖基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Sm-NgtP,其特征在于:該啟動(dòng)子Sm-NgtP的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種從權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子Sm-NgtP中分離出的啟動(dòng)子片段GTPC，其特征在于:該啟動(dòng)子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一種真核表達(dá)載體pGTPC，其特征在于:所述真核表達(dá)載體中的啟動(dòng)子為權(quán)利要求2中所述啟動(dòng)子片段GTPC。
4.一種從權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子Sm-NgtP中分離出的啟動(dòng)子片段GTTO，其特征在于:該啟動(dòng)子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
5.一種真核表達(dá)載體pGTPD，其特征在于:所述真核表達(dá)載體中的啟動(dòng)子為權(quán)利要求2中所述啟動(dòng)子片段GTro。
6.一種利用植物細(xì)胞表達(dá)目的基因的方法，其特征在于包括以下步驟:用權(quán)利要求3中所述的真核表達(dá)載體PGTPC或權(quán)利要求5中所述的真核表達(dá)載體PGTro轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并培養(yǎng)，然后采用甲基茉莉 酸和水楊酸誘導(dǎo)植物細(xì)胞表達(dá)目的基因；所述的植物為谷類植物，或者為棉花、煙草、油菜以及茄類植物中的任一種。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103952414SQ201410217346
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】王春臺(tái), 劉學(xué)群, 譚艷平, 徐鑫, 程鋼, 劉新瓊, 周杰 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)