一種三磷酸腺苷的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三磷酸腺苷的制備方法。本發(fā)明主要是以二磷酸腺苷為原料，在葡萄糖、磷酸根離子、銨離子、鎂離子等物質(zhì)的條件下，利用啤酒酵母泥將二磷酸腺苷經(jīng)生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷；再經(jīng)活性炭、大孔吸附樹脂、陰離子交換樹脂等分離、純化方法，得到三磷酸腺苷二鈉鹽。其生產(chǎn)工藝合適于工業(yè)化大生產(chǎn)，操作簡便、安全，轉(zhuǎn)化率高，在生物發(fā)酵過程中，降低有機溶劑的使用，減少了對環(huán)境的污染，低環(huán)保；另外本發(fā)明為三磷酸腺苷的生產(chǎn)提供了新途徑。
【專利說明】一種三磷酸腺苷的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別是一種三磷酸腺苷的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 三磷酸腺苷（ATP)是由一個腺嘌呤，一個核糖和一個三磷酸單位組成的核苷酸， 它是生物體內(nèi)重要的高能磷酸化合物。ATP水解為二磷酸腺苷（ADP)和正磷酸（Pi)或ATP 水解為一磷酸腺苷（AMP)和焦磷酸（PPi)時，有大量的自由能釋放出來?，F(xiàn)ATP已被證實 它在生命細(xì)胞的新陳代謝以及各種生化反應(yīng)的能量提供中扮演著極其重要的角色，是生命 活動及生化反應(yīng)所必需的高能化合物。
[0003] ATP是生物體內(nèi)重要的代謝物質(zhì)，作為代謝的中間體、輔酶和能量供應(yīng)者，參與生 物體內(nèi)的很多生化反應(yīng)。在臨床應(yīng)用上，ATP已作為一個治療試劑，對進(jìn)行性肌肉萎縮、中 風(fēng)后遺癥、心肌梗塞、心肌炎、冠狀動脈硬化、肝炎等病癥具有良好的治療和輔助治療作用。 通常，體弱病人身體合成ATP能力減弱，用它作補充能量，以增強機體抵抗力。近年來國 外學(xué)者結(jié)合ATP和AD (腺苷）、cAMP的構(gòu)效關(guān)系，及其受體的生理作用，認(rèn)為ATP在防治 腫瘤，調(diào)節(jié)神經(jīng)等方面具有明顯作用。因此，ATP的生物體外合成研究和臨床應(yīng)用實驗， 無論在生理醫(yī)學(xué)還是工業(yè)應(yīng)用上都具有重要意義。
[0004] 1929年Lohman從糖分解代謝旺盛的肌肉首次發(fā)現(xiàn)并提取ATP。在40年代末至50 年代，主要從兔子肌肉中提取獲得ATP，隨后以AMP為原料的化學(xué)合成法開始出現(xiàn)。60年 代，我國用菠菜光合磷酸化法制備ATP,還有用磨碎的或經(jīng)丙酮干燥的面包酵母以AMP或 腺苷為前提生物合成ATP，70年代后這一方法又有所改進(jìn)，如利用酵母自溶后的酶液或?qū)?酵母用表面活性劑處理再用于合成ATP，從而大幅度提高反應(yīng)效率。這種利用酵母細(xì)胞為 酶源進(jìn)行酶合成ATP的方法，一直沿用至今。80年代前后，用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)ATP的 方法開始見諸報道。進(jìn)入90年代后，研究報道有利用白地酶細(xì)胞的自溶作用生產(chǎn)ATP，亦 利用半導(dǎo)體代替葉綠體催化生成ATP的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種三磷酸腺苷的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是： 一種三磷酸腺苷的制備方法，其方法如下：加入純化水于反應(yīng)釜中，加熱，將葡萄糖、磷 酸根離子、銨離子、鎂離子等加入反應(yīng)釜中使其溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至5. 5-8. 5 ; 向反應(yīng)釜中加入啤酒酵母泥，緩慢升溫，當(dāng)溫度達(dá)到30_45°C時，加入二磷酸腺苷，此時開始 取樣測定三磷酸腺苷的轉(zhuǎn)化率，當(dāng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到95% (高效液相面積歸一化法）以上時，反應(yīng) 結(jié)束；反應(yīng)結(jié)束立即用1-6M的鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至2. 0-5. 0,終止反應(yīng)；并開始進(jìn)行壓濾， 當(dāng)反應(yīng)液壓濾結(jié)束后，再用純化水沖洗濾餅，將壓濾液和水洗液混勻。
[0007] 所述方法中磷酸根離子用磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉，銨 離子用氯化銨或磷酸銨，鎂離子用氯化鎂或硫酸鎂。各反應(yīng)物的用量按重量份計為： 二磷酸腺苷 1-2份 磷酸銨(或氯化銨）0.01-0. 1份 葡萄糖 1-2份 硫酸鎂(或氯化鎂）0.1-1份 磷酸氫二鉀(或磷酸二氫鉀或磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉） 0. 5-2. 5份 酵母泥 10-20份。
[0008] 將上述含有三磷酸腺苷的發(fā)酵混合液上活性炭床柱進(jìn)行除鹽，以純化水或pH=2 的稀酸水溶液為沖洗液，以〇. 2-0. 8BV/h的流速去除殘留在活性炭床柱的混合液，以 20-80%，pH7-10的乙醇水溶液為洗脫液(用氨水調(diào)pH值)，以0. 2-0. 8BV/h的流速進(jìn)行 等度洗脫，收集含有三磷酸腺苷的洗脫峰；將上述含有三磷酸腺苷的洗脫峰經(jīng)減壓濃縮 得濃縮液，上大孔吸附樹脂床柱進(jìn)行脫色，以純化水或pH=2的稀酸水溶液為沖洗液，以 0. 2-0. 8BV/h的流速去除殘留在大孔吸附樹脂床柱的混合液，收集含有三磷酸腺苷的沖洗 液；將上述含有三磷酸腺苷的沖洗液上陰離子交換樹脂床柱進(jìn)行分離、純化，以純化水或 pH=2的稀酸水溶液為沖洗液，以0. 5-1. 5BV/h的流速去除殘留在陰離子交換樹脂床柱的混 合液，洗脫液先以含氯化鈉或氯化鉀的〇. 02-0. 08mol/L，pHl-6的稀酸溶液，以0. 5-1. 5BV/ h的流速進(jìn)行洗脫：再以含氯化鈉或氯化鉀的0. 5-1. 5mol/L，pHl-6的稀酸溶液II進(jìn)行洗 脫，收集含有三磷酸腺苷的沖洗液。
[0009] 將洗脫液〖1收集液進(jìn)行納濾，當(dāng)納濾濃縮的體積為納濾前的1/4時，停止納濾。將 納濾濃縮液放入醇沉罐中進(jìn)行醇沉，醇沉濃度為85%，沉淀即為三磷酸腺苷固體。
[0010] 所述稀酸溶液、稀酸溶液I、稀酸溶液II各自獨立為下列之一：①鹽酸溶液、②硫 酸溶液、③甲酸溶液、④乙酸溶液。
[0011] 本發(fā)明主要是以二磷酸腺苷為原料，利用啤酒酵母泥將二磷酸腺苷經(jīng)生物發(fā)酵轉(zhuǎn) 化為三磷酸腺苷。其生產(chǎn)工藝合適于工業(yè)化大生產(chǎn)，操作簡便、安全，轉(zhuǎn)化率高，在生物發(fā)酵 過程中，降低了有機溶劑的使用，減少了對環(huán)境的污染，低環(huán)保；另外本發(fā)明為三磷酸腺苷 的生產(chǎn)提供了新途徑。
[0012] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
[0013] 實施例1 : 加入純化水于反應(yīng)釜中，加熱至40°C，將葡萄糖15g、磷酸氫二鉀15g、磷酸氫二鈉19g、 磷酸銨〇. 75g、氯化鎂8. 5g等加入反應(yīng)釜中使其溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7. 0 ;向 反應(yīng)釜中加入啤酒酵母泥300g，緩慢升溫，當(dāng)溫度達(dá)到35°C時，加入二磷酸腺苷20g，此時 開始計時取樣，應(yīng)用高效液相色譜法測定反應(yīng)液中三磷酸腺苷的轉(zhuǎn)化率，當(dāng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到95% (高效液相面積歸一化法）以上時，反應(yīng)結(jié)束；反應(yīng)結(jié)束立即用4M的鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至 2. 0,終止反應(yīng)；并加入助濾劑開始進(jìn)行壓濾，當(dāng)反應(yīng)液壓濾結(jié)束后，再用純化水沖洗濾餅， 將壓濾液和水洗液混勻。
[0014] 腺苷的發(fā)酵混合液上活性炭床柱進(jìn)行除鹽，以pH=2的鹽酸水溶液為沖洗液，以 0. 5BV/h的流速去除殘留在活性炭床柱的混合液，以40%，pH7的乙醇水溶液為洗脫液(用 氨水調(diào)pH值)，以0. 5BV/h的流速進(jìn)行等度洗脫，收集含有三磷酸腺苷的洗脫峰；將上述 含有三磷酸腺苷的洗脫峰經(jīng)減壓濃縮得濃縮液，上大孔吸附樹脂床柱進(jìn)行脫色，以純化水 為沖洗液，以〇. 4BV/h的流速去除殘留在大孔吸附樹脂床柱的混合液，收集含有三磷酸腺 苷的沖洗液；將上述含有三磷酸腺苷的沖洗液上陰離子交換樹脂床柱進(jìn)行分離、純化，以 pH=2的甲酸水溶液為沖洗液，以0. 6BV/h的流速去除殘留在陰離子交換樹脂床柱的混合 液，洗脫液先以含0. 04 mol/L氯化鉀、pH4甲酸溶液，以0. 6BV/h的流速進(jìn)行洗脫：再以含 0. 85mol/L氯化鉀pH2甲酸溶液進(jìn)行洗脫，收集含有三磷酸腺苷的沖洗液。
[0015] 將含有三磷酸腺苷的收集液進(jìn)行納濾，當(dāng)納濾濃縮的體積為納濾前的1/4時，停 止納濾。將納濾濃縮液放入醇沉罐中進(jìn)行醇沉，醇沉濃度為85%，沉淀即為三磷酸腺苷。
[0016] 實施例2: 加入純化水于反應(yīng)釜中，加熱至38°C，將葡萄糖19g、磷酸二氫鈉18. 5g、磷酸二氫鉀 20. 5g、氯化銨0. 65g、硫酸鎂7. 5g等加入反應(yīng)釜中使其溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至 8. 0 ;向反應(yīng)釜中加入啤酒酵母泥220g，緩慢升溫，當(dāng)溫度達(dá)到37°C時，加入二磷酸腺苷 15g，此時開始計時取樣，應(yīng)用高效液相色譜法測定反應(yīng)液中三磷酸腺苷的轉(zhuǎn)化率，當(dāng)轉(zhuǎn)化 率達(dá)到95% (高效液相面積歸一化法）以上時，反應(yīng)結(jié)束；反應(yīng)結(jié)束立即用6M的鹽酸調(diào)節(jié)反 應(yīng)液pH至3. 0,終止反應(yīng)；并加入助濾劑開始進(jìn)行壓濾，當(dāng)反應(yīng)液壓濾結(jié)束后，再用純化水 沖洗濾餅，將壓濾液和水洗液混勻。
[0017] 將上述含有三磷酸腺苷的發(fā)酵混合液上活性炭床柱進(jìn)行除鹽，以純化水為沖洗 液，以0. 6BV/h的流速去除殘留在活性炭床柱的混合液，以60%，pH8的乙醇水溶液為洗脫 液(用氨水調(diào)pH值)，以0. 6BV/h的流速進(jìn)行等度洗脫，收集含有三磷酸腺苷的洗脫峰；將 上述含有三磷酸腺苷的洗脫峰經(jīng)減壓濃縮得濃縮液，上大孔吸附樹脂床柱進(jìn)行脫色，以純 化水為沖洗液，以〇. 5BV/h的流速去除殘留在大孔吸附樹脂床柱的混合液，收集含有三磷 酸腺苷的沖洗液；將上述含有三磷酸腺苷的沖洗液上陰離子交換樹脂床柱進(jìn)行分離、純化， 以pH=2的乙酸水溶液為沖洗液，以1. OBV/h的流速去除殘留在陰離子交換樹脂床柱的混合 液，洗脫液先以含〇. 08 mol/L氯化鈉、pH4乙酸溶液，以0. 6BV/h的流速進(jìn)行洗脫：再以含 0. 85mol/L氯化鈉 pH2乙酸溶液進(jìn)行洗脫，收集含有三磷酸腺苷的沖洗液。
[0018] 將含有三磷酸腺苷的收集液進(jìn)行納濾，當(dāng)納濾濃縮的體積為納濾前的1/4時，停 止納濾。將納濾濃縮液放入醇沉罐中進(jìn)行醇沉，醇沉濃度為85%，沉淀即為三磷酸腺苷。
[0019] 實施例3: 加入純化水于反應(yīng)釜中，加熱至32°C，將葡萄糖30g、磷酸氫二鈉18g、磷酸氫二鉀21g、 氯化銨1. 2g、氯化鎂6. 5g等加入反應(yīng)釜中使其溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6. 0 ;向反 應(yīng)釜中加入啤酒酵母泥400g，緩慢升溫，當(dāng)溫度達(dá)到37°C時，加入二磷酸腺苷25g，此時開 始計時取樣，應(yīng)用高效液相色譜法測定反應(yīng)液中三磷酸腺苷的轉(zhuǎn)化率，當(dāng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到95% (高效液相面積歸一化法）以上時，反應(yīng)結(jié)束；反應(yīng)結(jié)束立即用1M的鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至 5. 0,終止反應(yīng)；并加入助濾劑開始進(jìn)行壓濾，當(dāng)反應(yīng)液壓濾結(jié)束后，再用純化水沖洗濾餅， 將壓濾液和水洗液混勻。
[0020] 將上述含有三磷酸腺苷的發(fā)酵混合液上活性炭床柱進(jìn)行除鹽，以純化水為沖洗 液，以0. 8BV/h的流速去除殘留在活性炭床柱的混合液，以70%，pHIO的乙醇水溶液為洗脫 液(用氨水調(diào)pH值)，以0. 8BV/h的流速進(jìn)行等度洗脫，收集含有三磷酸腺苷的洗脫峰；將上 述含有三磷酸腺苷的洗脫峰經(jīng)減壓濃縮得濃縮液，上大孔吸附樹脂床柱進(jìn)行脫色，以pH=2 的鹽酸溶液為沖洗液，以0. 8BV/h的流速去除殘留在大孔吸附樹脂床柱的混合液，收集含 有三磷酸腺苷的沖洗液；將上述含有三磷酸腺苷的沖洗液上陰離子交換樹脂床柱進(jìn)行分 離、純化，以pH=2的乙酸水溶液為沖洗液，以1. 2 BV/h的流速去除殘留在陰離子交換樹脂 床柱的混合液，洗脫液先以含〇. 07 mol/L氯化鈉、pH5乙酸溶液，以1. 2BV/h的流速進(jìn)行洗
【權(quán)利要求】
1. 一種三磷酸腺苷的制備方法，其特征是以二磷酸腺苷為原料，在葡萄糖、磷酸根離 子、銨離子、鎂離子等物質(zhì)的條件下，利用啤酒酵母泥將二磷酸腺苷經(jīng)生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為三磷 酸腺苷。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是反應(yīng)的pH值為5. 5~8. 5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是反應(yīng)溫度為3(T45°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是所述的磷酸根離子用磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀磷酸 氫二鈉或磷酸二氫鈉。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是所述的銨離子用氯化銨或磷酸銨。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是所述的鎂離子用氯化鎂或硫酸鎂。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是各反應(yīng)物的用量按重量份計為： 二磷酸腺苷 1~2份 磷酸銨(或氯化銨）0.01、. 1份 葡萄糖 1~2份 硫酸鎂(或氯化鎂）〇. 1~1份 磷酸氫二鉀(或磷酸二氫鉀或磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉） 0. 5~2. 5份 酵母泥 ΚΓ20份。
8. 將上述含有三磷酸腺苷的發(fā)酵混合液經(jīng)活性炭、大孔吸附樹脂、陰離子交換樹脂等 分離、純化方法，得到三磷酸腺苷二鈉鹽。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述，其特征是： (1) 將上述含有三磷酸腺苷的發(fā)酵混合液上活性炭床柱進(jìn)行除鹽，沖洗液以 0. 2~0. 8BV/h的流速去除殘留在活性炭床柱的混合液，所述沖洗液為下列之一：①純化水、 ②pH=2的鹽酸水溶液、③pH=2的甲酸水溶液、④pH=2的乙酸水溶液；洗脫液以0. 2?0. 8BV/ h的流速進(jìn)行等度洗脫，收集含有三磷酸腺苷的洗脫峰，所述洗脫液為2(Γ80%，ρΗ7?10的乙 醇水溶液(用氨水調(diào)pH值）； (2) 將上述含有三磷酸腺苷的洗脫峰經(jīng)減壓濃縮得濃縮液，上大孔吸附樹脂床柱進(jìn)行 脫色，沖洗液以〇. 2、. 8BV/h的流速去除殘留在大孔吸附樹脂床柱的混合液，收集含有三 磷酸腺苷的上樣流出液和沖洗液，所述沖洗液為下列之一：①純化水、②pH=2的鹽酸水溶 液、③pH=2的甲酸水溶液、④pH=2的乙酸水溶液； (3) 將上述含有三磷酸腺苷的上樣流出液和沖洗液上陰離子交換樹脂床柱進(jìn)行分離、 純化，沖洗液以0. 5~1. 5BV/h的流速去除殘留在陰離子交換樹脂床柱的混合液，所述沖洗 液為下列之一：①純化水、②PH=2的鹽酸水溶液、③pH=2的甲酸水溶液、④pH=2的乙酸水 溶液；洗脫液以〇. 5~1. 5BV/h的流速進(jìn)行洗脫：先用含氯化鈉或氯化鉀的0. 02~0. 08mol/L， ΡΗΓ6的稀酸溶液I進(jìn)行洗脫，再用含氯化鈉或氯化鉀的0. 5~1. 5πι〇1/1，ρΗΓ6的稀酸溶液 Π 進(jìn)行洗脫，收集含有三磷酸腺苷的沖洗液，所述的稀酸溶液I、稀酸溶液II各自獨立為下 列之一：①鹽酸溶液、②硫酸溶液、③甲酸溶液、④乙酸溶液。
【文檔編號】C12R1/865GK104109701SQ201410185254
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】蘆志剛, 熊峰 申請人:吉林英聯(lián)生物制藥股份有限公司