一種易降解植物細(xì)胞壁的分子設(shè)計(jì)及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種易降解植物細(xì)胞壁的分子設(shè)計(jì)及應(yīng)用。本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體而言是一種通過在植物中構(gòu)建2-苯乙醇合成通路實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞壁木質(zhì)素合成降低使植物細(xì)胞壁更易降解，從而提高纖維生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的方法與應(yīng)用。2-苯乙醇合成通路包含兩個(gè)關(guān)鍵基因，分別是矮牽牛的苯乙醛合成酶基因PAAS和番茄苯乙醛還原酶基因LePAR1。本發(fā)明在擬南芥中構(gòu)建一條2-苯乙醇合成的途徑，通過2-苯乙醇的合成與木質(zhì)素合成競(jìng)爭起始底物苯丙氨酸，引起碳代謝的分流，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中木質(zhì)素合成減少。本發(fā)明主要的目的是通過降低植物中木質(zhì)素合成，從而提高植物細(xì)胞壁降解效率降低纖維生物質(zhì)預(yù)處理的難度。目前，在擬南芥中本方法已表現(xiàn)出降低木質(zhì)素合成，同時(shí)提高莖稈細(xì)胞壁提取物酶解釋放葡萄糖效率的特性。
【專利說明】一種易降解植物細(xì)胞壁的分子設(shè)計(jì)及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體而言是一種通過在轉(zhuǎn)基因植物中構(gòu)建2-苯乙醇合成通路以降低木質(zhì)素合成的方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]木質(zhì)纖維生物質(zhì)(b1mass)是地球上最豐富的可再生資源。其轉(zhuǎn)化產(chǎn)品豐富，可轉(zhuǎn)化為生物燃料及生物基化學(xué)品等多種產(chǎn)品。隨著礦物資源的日益短缺，以及使用石油等礦物資源所帶來的環(huán)境污染和氣候惡化，纖維生物質(zhì)資源的開發(fā)利用已在世界范圍內(nèi)引起了廣泛的關(guān)注。木質(zhì)素是木質(zhì)纖維生物質(zhì)的主要成分之一，其存在一直是限制纖維生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化利用的主要屏障。以前的研究結(jié)果證明，通過基因工程技術(shù)改變能源植物木質(zhì)素的含量和成分能夠顯著降低原材料預(yù)處理強(qiáng)度，同時(shí)提高纖維素的降解效率和生物乙醇的發(fā)酵產(chǎn)量。因此，開發(fā)高效轉(zhuǎn)化利用的新型纖維生物質(zhì)能源植物是解決生物質(zhì)利用困難的關(guān)鍵瓶頸之一，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]木質(zhì)素(Iignin)是高等植物細(xì)胞壁的重要組分，是一類組成和結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜的芳香類聚合物，主要有H-木質(zhì)素、S-木質(zhì)素和G-木質(zhì)素3種主要的木質(zhì)素類型。木質(zhì)素的合成代謝途徑在雙子葉植物中被廣泛深入地研究。其生物合成以苯丙氨酸為起始底物，進(jìn)入苯丙酸途徑，經(jīng)過一系列反應(yīng)合成羥基肉桂酸類化合物，最終生成3種主要木質(zhì)素單體。目前，國內(nèi)外關(guān)于木質(zhì)素合成途徑和遺傳調(diào)控的研究，主要集中于雙子葉植物。木質(zhì)素單體合成途徑的 10 個(gè)酶基因(PAL、C4H、HCT、C3H、CES、4CL、CCoAOMT、CCR、F5H、COMT 和 CAD)的功能在擬南芥中已經(jīng)基本研究清楚，其中許多關(guān)鍵基因已應(yīng)用于植物木質(zhì)素生物合成調(diào)控。
[0004]目前的植物木質(zhì)素基因工程的研究策略主要是通過調(diào)控木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素含量的降低或組成結(jié)構(gòu)的改變，從而使木質(zhì)素更易于去除，進(jìn)而利于纖維生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用。為了給木質(zhì)素分子改良提供更多選擇和策略，本發(fā)明以木質(zhì)素合成的起始底物苯丙氨酸為切入點(diǎn)，在擬南芥中構(gòu)建一條2-苯乙醇合成的途徑，希望通過2-苯乙醇的合成與木質(zhì)素合成競(jìng)爭起始底物苯丙氨酸，引起碳代謝的分流，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中木質(zhì)素合成的減少。
[0005]2-苯乙醇是一種具有玫瑰花香的芳香醇，作為香料廣泛應(yīng)用于日化、輕工和食品等領(lǐng)域。其合成途徑在釀酒酵母都得到了較深入的研究，植物中2-苯乙醇合成研究相對(duì)較少，在植物中存在三條不同途徑。與木質(zhì)素合成相似，酵母和植物中2-苯乙醇的合成都是以苯丙氨酸作為起始底物。目前在擬南芥中，尚未有2-苯乙醇合成的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在提供一種通過在植物中構(gòu)建一條2-苯乙醇合成通路，與木質(zhì)素合成競(jìng)爭底物苯丙氨酸，從而降低植物木質(zhì)素含量的代謝途徑改造方法及應(yīng)用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為: 一種2-苯乙醇合成通路，其特征在于:所述合成通路包含2-苯乙醇合成通路的兩個(gè)關(guān)鍵基因，分別是矮牽牛的苯乙醛合成酶基因(DQ243784)和番茄苯乙醛還原酶基因LePARl(ΝΜ_00I247894)。
[0008]一種2-苯乙醇合成通路應(yīng)用，其特征在于:所述2-苯乙醇合成通路在降低植物莖桿木質(zhì)素含量以提高纖維生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的應(yīng)用。
[0009]一種2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體，植物表達(dá)載體包含兩個(gè)目的基因表達(dá)框，分別具有兩個(gè)組成型啟動(dòng)子，以及二者控制的2-苯乙醇合成通路的關(guān)鍵基因和LePARO0
[0010]所述載體還包含載體T-DNA區(qū)中用于篩選轉(zhuǎn)基因植物的標(biāo)記基因。
[0011]所述組成型啟動(dòng)子分別為CaMV35S啟動(dòng)子和pROLD啟動(dòng)子。
[0012]所述2-苯乙醇合成通路分別為來源于矮牽牛的苯乙醛合成酶基因和番茄苯乙醛還原酶基因。
[0013]所述植物為擬南芥。
[0014]所述植物表達(dá)載體在降低植物莖桿木質(zhì)素含量以提高纖維生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明構(gòu)建了 2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體，包含用所述載體轉(zhuǎn)化的擬南芥，以及在擬南芥中降低木質(zhì)素合成的方法。而利用本發(fā)明描述的方法對(duì)擬南芥木質(zhì)素合成進(jìn)行系統(tǒng)的代謝工程改造，使得植物木質(zhì)素含量下降約11%，莖桿細(xì)胞壁提取物酶解釋放葡萄糖效率顯著提高，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的正常生長沒有影響，其具有較大的研究價(jià)值和應(yīng)用潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。
[0017]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的轉(zhuǎn)化2-苯乙醇合成通路的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。其中，對(duì)照(Control)為轉(zhuǎn)入空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥。
[0018]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的RT-PCR分矯PAAS和LePARl在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)水平示意圖。其中，對(duì)照(Control)為轉(zhuǎn)入空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥；1，2，3，4和5代表為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。擬南芥JCTJM基因用作內(nèi)參。
[0019]圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的轉(zhuǎn)化2-苯乙醇合成通路的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株莖橫切面的木質(zhì)素間苯三酹染色分析。其中，對(duì)照(Control)為轉(zhuǎn)入空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥；
為和過表達(dá)株系。Bar = 200 Mm。
[0020]圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的轉(zhuǎn)化2-苯乙醇合成通路的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株莖木質(zhì)素含量測(cè)定。其中，對(duì)照(Control)為轉(zhuǎn)入空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥為E4AS和過表達(dá)株系。*表示差異顯著(P < 0.05)。
[0021]圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的纖維素酶水解擬南芥莖細(xì)胞壁提取物的效率分析。其中，對(duì)照(Control)為轉(zhuǎn)入空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥為和過表達(dá)株系。

【具體實(shí)施方式】
[0022]本實(shí)驗(yàn)所涉及的藥品均購自Sigma公司、Fermentas公司、Thermo Fisher公司、上海生工公司。具體實(shí)驗(yàn)操作依據(jù)《分子克隆》。
[0023]實(shí)施例1 2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體的構(gòu)建:
1.2-苯乙醇合成通路基因:矮牽牛苯乙醛合成酶基因和番茄苯乙醛還原酶基因LePARl的克隆
為了在植物中構(gòu)建2-苯乙醇合成通路，根據(jù)對(duì)植物中2-苯乙醇合成通路的報(bào)道，選擇矮牽牛苯乙醛合成酶基因/^A?(DQ243784)和番茄苯乙醛還原酶基因LePARl (ΝΜ_001247894)構(gòu)建2-苯乙醇合成通路。取矮牽牛(Petunia hybrida)盛開花瓣及番爺(Solanum Iycopersicum)完全成熟果實(shí),利用CTAB法分別提取其總RNA,搜索GenBank獲得二者的全長cDNA序列，分別設(shè)計(jì)基因特異引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增和Ze/MTtV的基因全長cDNA;最后將二者連入pMD19-T中測(cè)序。擴(kuò)增條件為:95°C 5 min預(yù)變性；94 30 s, 55 V 40s, 72 V I min, 35個(gè)循環(huán)；72 V 8 min片段延伸。擴(kuò)增引物為:
PAAScDNAF: 5’ - ATGGATACTATCAAAATCAACC- 3’ ；
PAAScDNAR: 5’ - CTACGCATTCAGCATCATAGTTG-3’ ；
LePARlcDNAF: 5’ -ATGAGTGTGACAGCGAAAACAGTG- 3’ ；
LePARlcDNAR: 5’ -TTACATAGAAGATGAACCTCC-3’ ；
2.2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體的構(gòu)建
先將和基因全長cDNA分別連接到入門克隆pEN-L4-2-L3和pGWC_T載體中，測(cè)序正確后，利用Gateway技術(shù)(Invitrogen公司說明書),通過基因重組將其插入到pK7m34GW2-8m21GW3載體中，從而得到含有和基因共同過表達(dá)的2-苯乙醇合成通路植物表達(dá)載體(參見圖1)。
[0024]實(shí)施例2構(gòu)建2-苯乙醇合成通路降低植物木質(zhì)素合成的應(yīng)用:
1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥
將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，挑取鑒定陽性的克隆，過夜培養(yǎng)，至0D=2.0。將過夜培養(yǎng)的300ml菌液離心，室溫離心收菌，并用150ml轉(zhuǎn)化Buffer重懸(轉(zhuǎn)化Buffer:0.5%蔗糖溶液含有0.02% Silwet).將擬南芥花序倒置浸入菌液中，盡量使全部的花序都浸入菌液中，反復(fù)浸入5-6次，然后將擬南芥倒放于接水盤中，用保鮮膜覆蓋，于培養(yǎng)間(22°C)過夜，然后正常培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化一周以后，可以再重新轉(zhuǎn)化一次，常規(guī)管理至種子成熟。種子收獲后，自然晾干，經(jīng)表面消毒，鋪于含有25ug/ml的卡那霉素的1/2MS平板上，篩選陽性植株。
[0025]2.轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定
取生長4周的候選轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片，利用CTAB法提取其總RNA，用DNAase ICSigma公司)去除可能污染的基因組DNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。以PAAScDNAF/R和LePARlcDNAF/R為引物，利用RT-PCR法檢測(cè)其相對(duì)于對(duì)照植株(轉(zhuǎn)化pK7m34GW2-8m21GW3空載體)的表達(dá)水平。擴(kuò)增條件為:95 V 5 min預(yù)變性；9430 s, 55 V 40s, 72 V I min, 28 個(gè)循環(huán)；72 V 8 min 片段延伸。擬南芥基因用作內(nèi)參。結(jié)果如圖3所示，5個(gè)代表性轉(zhuǎn)基因植株中和Ze/MTtV基因的表達(dá)量比對(duì)照植株明顯要高，表明這兩個(gè)基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因植株中，初步實(shí)現(xiàn)了 2-苯乙醇合成通路構(gòu)建。
[0026]3.利用乙酰溴法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株莖桿木質(zhì)素的含量。具體步驟為:
(O材料的選取及細(xì)胞壁成分提取:收集7-8周左右的對(duì)照及轉(zhuǎn)基因植株的基部莖(地上部分約5cm)，將材料凍干后研磨成細(xì)粉，使用70%的乙醇抽提3次，沉淀再用氯仿-甲醇抽提I次，沉淀使用丙酮懸浮后吹干，稱重，最后再碾磨成細(xì)粉；
(2)取約2mg細(xì)胞壁提取物，加入乙酰溴溶液，50 °C反應(yīng)3h，冷卻至室溫，再加入氫氧化鈉和新配置的鹽酸羥胺溶液，用冰醋酸調(diào)整體積至2ml，取200μ1測(cè)定280nm的吸光度，使用下列公式計(jì)算木質(zhì)素含量:木質(zhì)素含量(%) =ABSL*2ml*100%/Coeff*0.539cm*weight (mg) ；ABSL:吸光度，Coeff=15.69。
[0027]4.利用石蠟切片觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥莖木質(zhì)素含量變化。具體步驟為:
(O材料的選取及固定:利用鋒利刀片取6個(gè)月植株莖基部0.5 cm,置于4%多聚甲醛固定液中真空抽氣2 h,直到材料沉于管底，4°C過夜；
(2)脫水及透明:將上述過夜處理的植株莖的基部用I倍PBS清洗一次，乙醇梯度脫水[乙醇梯度比例為10%、30%、50%、80%、90%乙醇(體積百分比)]后，利用無水乙醇(A)和二甲苯⑶按比例進(jìn)行浸透，其體積比例分別為A/B=3/l，A/B=l/1, A/B=l/3和B，每步比例滲透I h ;
(3)浸蠟及包埋:滲透處理后利用二甲苯(B)和石蠟(C)按比例進(jìn)行蠟浸，其體積比例分別為B/C=3/l，B/C=l/1, B/C=l/3和C，每步浸蠟3 h，而后62°C烘箱中進(jìn)行；
(4)切片、展片及烘片:利用LeicaRM2235切片機(jī)(Leica公司)將材料切成8μ m的薄片，置于42°C水浴鍋中展片1-2 min,使之吸附于世泰REF188105粘附載玻片(世泰公司)上，37°C烘片2天；
(5)脫蠟、二甲苯及染色:將附著有材料的載玻片置于二甲苯中脫蠟5min，脫蠟后，利用無水乙醇(A)和二甲苯(B)按比例進(jìn)行梯度洗脫脫水，梯度比例為:A(無水乙醇)/B(二甲苯)=1/1, A, 95 %A, 85 % A, 75 % A, 50 % A, 30 % A(體積百分比)，最后在0.5% TBO染液中染色15 s ；
(6)脫水及封片:將清水洗過的玻片依次在30% A, 50 % A，75 % A, 85 % A, 95 % A, A及B中脫水至二甲苯中，每步30 S，隨后利用加拿大樹膠將其封存；
(7)切片的觀察:利用OLYMPUSDX51光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)進(jìn)行觀察，拍照(參見圖4)。
[0028]實(shí)施例3構(gòu)建2-苯乙醇合成通路提高植物細(xì)胞壁酶解糖化效率的應(yīng)用利用纖維素酶水解擬南芥莖細(xì)胞壁提取物的效率分析。具體步驟為:
Cl)將細(xì)胞壁提取物分為兩個(gè)處理組，第一組直接使用纖維素酶(Cellulose)和葡萄糖苷酶(β -glucosidase)處理，分別取對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞壁提取物20mg酶解處理24小時(shí)，分別于1，3，6，24小時(shí)取酶解產(chǎn)物500ul，測(cè)定水解產(chǎn)物中葡萄糖含量；
(2)第二組取細(xì)胞壁提取物首先使用熱水(121°C)處理I小時(shí)，然后使用纖維素酶和葡萄糖苷酶處理分別于1，3，6，24小時(shí)取樣測(cè)定酶解產(chǎn)物中葡萄糖含量。按照葡萄糖測(cè)定試劑盒(氧化酶法)說明書操作，計(jì)算每克發(fā)酵樣品中葡萄糖含量。
【權(quán)利要求】
1.一種2-苯乙醇合成通路，其特征在于:所述合成通路包含2-苯乙醇合成通路的兩個(gè)關(guān)鍵基因，分別是來自矮牽牛的苯乙醛合成酶基因PAAS和番茄苯乙醛還原酶基因LePARl。
2.—種權(quán)利要求1所述的2-苯乙醇合成通路的應(yīng)用，其特征在于:所述2-苯乙醇合成通路在降低植物莖桿木質(zhì)素含量以提高纖維生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的應(yīng)用。
3.—種2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體,其特征在于:植物表達(dá)載體包含兩個(gè)目的基因表達(dá)框，分別具有組成型啟動(dòng)子，以及二者控制的2-苯乙醇合成通路的關(guān)鍵基因。
4.按權(quán)利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體，其特征在于:所述組成型啟動(dòng)子分別為CaMV35S啟動(dòng)子和pROLD啟動(dòng)子。
5.按權(quán)利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體，其特征在于:所述2-苯乙醇合成通路關(guān)鍵基因分別為PAAS和LePARl。
6.一種權(quán)利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為擬南芥。
7.—種權(quán)利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于:所述植物表達(dá)載體在降低植物莖桿木質(zhì)素含量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104232663SQ201410164853
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】周功克, 祁廣, 柴國華, 孔英珍, 王殿, 唐賢豐, 付春祥, 賀郭 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所